Stereotaktische Intrakranielle Implantation und In vivo Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende serielle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, durch präzise stereotaktische Implantation von bio abbildbaren Glioblastoma multiforme-Krebszellen in das Gehirn von Nacktmäusen Tumor-Xenotransplantate zu erzeugen, die die wichtigsten klinischen Merkmale des Glioblastoma multiforme rekapitulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Glioblastoma-Multiforme-Tumorzellen so vorbereitet werden, dass sie Luziferase für die serielle nicht-invasive Biolumineszenzbildgebung stabil exprimieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Maus zu betäuben und in den stereotaktischen Rückhalteapparat zu legen.

Als nächstes wird ein Schnitt in die Haut gemacht und ein Bohrloch an den genauen Koordinaten des B bgma gebohrt. Der letzte Schritt ist die langsame Implantation von Tumorzellen in das Gehirn mit stereotaktischen Techniken, gefolgt von der Entfernung der Nadel und dem Verschluss des Schnitts. Letztendlich werden die biolumineszierende Bildgebung und die Magnetresonanztomographie verwendet, um serielle nicht-invasive Bildgebung durchzuführen, um das Tumorwachstum und das Ansprechen auf Prüfbehandlungen zu verfolgen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie der nicht-stereotaktischen manuellen Implantation von Krebszellen, besteht darin, dass die hier beschriebene Methode der stereotaktischen interkraniellen Implantation von Tumorzellen und Mäusen reproduzierbarere Tumore erzeugt, die das infiltrative und schnelle Wachstumsmuster des klinischen Glioblastoma multiforme sinnvoll rekapitulieren. Die perioperative Morbidität und Mortalität für das Verfahren sind sehr niedrig, und die Tumoraufnahmerate ist sehr hoch. Diese Technik eignet sich besonders gut für Experimente, bei denen Mäuse gleichmäßig in verschiedene Behandlungsgruppen eingeteilt werden, bei denen es wünschenswert ist, reproduzierbare Tumore vergleichbarer Größe und biologischer Eigenschaften an anatomischer Stelle zu haben.

Nachdem Sie die Maus mit dem Ketamin-Xylazin-Gemisch betäubt haben, positionieren Sie sie in der stereotaktischen Plattform Stulting Digital, indem Sie ihre Schneidezähne in die Beißstange des Schnauzenfixes einhaken. Ziehen Sie dann die Nasenklemme über der Schnauze fest. Stellen Sie in der Zwischenzeit sicher, dass sich der Kopf der Maus auf einer ebenen Ebene befindet.

Übertragen Sie als Nächstes die zurückgehaltene Maus auf die stereotaktische Plattform. Passen Sie die Position des Tieres so an, dass sich die Spitzen der Ohrbügel am verhätschelten Ende des Gehörgangs befinden. Befestigen Sie dann die Bissstange am stereotaktischen Rahmen.

Die Maus sollte auf einer festen Kunststoffheizplatte ruhen, die mit Klebeband an der Plattform befestigt ist, um eine rückkopplungsgesteuerte Temperaturregulierung während der Operation zu ermöglichen. Schieben Sie danach die Ohrstangen in den verwöhnten Teil des Gehörgangs vor. Befestigen Sie sie so, dass sich der Kopf der Maus auf einer ebenen Ebene befindet und bewegungsunfähig ist.

Führen Sie anschließend die geschmierte Spitze eines rektalen Temperaturfühlers ein, um die Temperatur des Tieres zu überwachen und eine Rückkopplungssteuerung an die Heizplatte zu ermöglichen, um die Körpertemperatur des Tieres während der Operation bei 36 Grad Celsius zu halten. Tragen Sie dann eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Tragen Sie anschließend Betadin-Lösung auf die Oberseite des Kopfes der Maus auf.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass die Maus durch ein Zehenkneifen bewusstlos ist, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen 0,75 Zentimeter langen Schnitt in Längsrichtung in der mittleren Kopfhaut zu machen, der sich von der Höhe der Augen aus erstreckt. Stellen Sie sicher, dass die BMA sichtbar ist. Befestigen Sie dann den Bohrerhalter an der Stealthing-Plattform.

Setzen Sie dann einen Bohrer mit einem 0,5 Millimeter Fräser in den Bohrerhalter ein und fixieren Sie ihn. Platzieren Sie nun den Bohrer genau über der Rema. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um die Ränder des Schnitts vorsichtig zurückzuziehen Um die Visualisierung des Schädels zu erleichtern, bewegen Sie die Spitze des Bohrers in eine Position zwei Millimeter nach hinten und 1,5 Millimeter lateral zum BGMA in der rechten Gehirnhälfte und bohren Sie mit dem Fordham-Bohrer in den Tierschädel, wobei Sie nur den Knochen durchstechen.

Entfernen Sie dann den Bohrer von der stereotaktischen Plattform. Befestigen Sie als Nächstes die Milbeninjektor-Spritzenpumpe an der stereotaktischen Plattform. Nehmen Sie die Zellen aus dem Eis und wirbeln Sie entweder das Fläschchen mit den Tumorzellen vorsichtig mit kurzen Impulsen oder schnippen Sie vorsichtig mit dem Fläschchen, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Ziehen Sie dann sieben Mikroliter der Zellsuspension durch eine 30 Gauge, einen Zoll lange flache Kegelnadel auf, die an einer 10-Mikroliter-Spritze befestigt ist. Vermeiden Sie große Luftblasen in der Spritze und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in den ersten sechs Mikrolitern Flüssigkeit befinden, die dem Gesamtvolumen entsprechen, das in die Maus injiziert wird. Setzen Sie die geladene Spritze in den Spritzeninjektor ein.

Verwenden Sie ein Alkoholpad, um die Zellsuspensionsflüssigkeit zu entfernen, die an der Spitze der Nadel erscheint, um eine Kontamination der Inzisionsstelle mit Krebszellen zu verhindern, die dazu führen kann, dass der Tumor im zusätzlichen Schädelraum wächst. Stellen Sie nun die Injektorpumpe so ein, dass sie 6,0 Mikroliter bei einer Geschwindigkeit von 0,5 Mikrolitern pro Minute fördert. Der eine Mikroliter Zellsuspension, der nach der Implantation in der Spritze verbleibt, stellt sicher, dass die Luftblasen, die sich häufig in der Spritze ansammeln, nicht in die tierische Injektion von Luftblasen injiziert werden, was zu einer tödlichen Luftembolie führen kann.

Führen Sie als Nächstes die Spritzennadel in das Bohrloch ein, während Sie die Nadel senkrecht zum Schädel halten. Sobald die Nadel den Schädel durchquert hat, stellen Sie die Koordinaten auf der stereotaktischen Digitalanzeige auf Null. Dann schieben Sie die Nadelspitze über einen Zeitraum von vier Minuten langsam vor, bis sie eine Tiefe von 2,5 Millimetern erreicht.

Machen Sie eine Pause von zwei Minuten und beginnen Sie dann mit der Implantation von Zellen, nachdem die Injektion abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel etwa zwei Minuten lang im Gehirn. Ziehen Sie die Nadel dann langsam über einen Zeitraum von drei bis vier Minuten zurück. Lösen Sie die Ohrstangen und den Schnauzenfix.

Entfernen Sie danach die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Verschließen Sie das Bohrloch im Schädel mit sterilem Knochenwachs, indem Sie es über das Bohrloch hin und her reiben. Tragen Sie das Knochenwachs so lange auf, bis das Loch vollständig verschlossen ist und das versiegelte Bohrloch bündig mit dem angrenzenden Schädel abschließt.

Tragen Sie anschließend Veterinärgewebekleber auf, um die Wunde zu versiegeln, und nähern Sie sich den Rändern des Schnitts mit sterilen Wattestäbchen wieder an und stellen Sie sicher, dass die Augen des Tieres keinem Klebstoff ausgesetzt sind. Legen Sie die Maus schließlich auf ein Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, bis das Tier das Bewusstsein wiedererlangt hat. Bringen Sie das Tier zurück in seinen ursprünglichen Käfig.

Sobald die Maus wach und ansprechbar ist, während die Maus anästhesiert ist, injizieren Sie entweder subkutan oder intraperitoneal 60 Mikroliter D Lucifer Kaliumsalz, das in PBS auf eine Konzentration von 50 Milligramm pro Milliliter verdünnt wurde. Schalten Sie den Anästhesiefluss zu den Nasenkegeln im biolumineszierenden Bildgebungsscanner ein und übertragen Sie die Mäuse schnell auf den Scanner. Platzieren sie ihre Schnauze in den Nasenkegeln.

Positionieren Sie die schwarzen Trennwände zwischen den Mäusen, um die Fähigkeit eines großen Tumors mit hoher Signalintensität zu begrenzen, die gemessene Signalintensität eines benachbarten Tumors mit viel niedrigerem Signal künstlich zu erhöhen. Schließlich werden mit der Lebendbild-Software häufige Serienbelichtungen von jeweils weniger als fünf Minuten für eine Gesamtdauer von bis zu 30 Minuten nach dem Zeitpunkt der Luzifer-Injektion durchgeführt. Hier ist das Ergebnis einer erfolgreichen stereotaktischen Implantation von Glioblastoma multiforme Zellen in das Gehirn der Maus zu sehen.

Die gewichtete MRT-Untersuchung des Gehirns T two, die 21 Tage nach der Implantation mit einem 9,4-Magneten durchgeführt wurde, zeigt einen einzelnen Tumorfokus in der rechten Hemisphäre mit einer Größe von 19 Kubikmillimetern, der an den genauen Koordinaten der Implantationsstelle lokalisiert ist. Das umgebende normale Gehirn ist hier grau konturiert, 10 Mäuse mit stereotaktisch implantierten Glioblastoma multiforme Tumoren wurden entweder mit externer Strahlentherapie auf 16 Graue in vier Fraktionen oder ohne Behandlung behandelt. Die biolumineszierende Bildgebung zeigt, dass die Strahlentherapie die Proliferation der implantierten Tumoren hemmt, was zu keiner Erhöhung des detektierten Biolumineszenzsignals führt, während das Signal bei scheinbestrahlten Kontrolltumoren aufgrund der unkontrollierten Proliferation der Krebszellen nach der Beherrschung erheblich ansteigt.

Diese Technik kann in etwa 25 Minuten pro Maus mit der gleichen Charge von Zellen abgeschlossen werden, während Sie dieses Verfahren versuchen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Tiere vor Beginn der Operation ordnungsgemäß betäubt werden und keine Reaktion auf ein festes Einklemmen der Zehen erfolgt. Gleichzeitig sollte darauf geachtet werden, dass die Tiere nicht überbetäubt werden.

Wie nach unserer Erfahrung scheinen die meisten perioperativen Todesfälle mit einer anästhesieinduzierten Atemdepression verbunden zu sein. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine präzise stereotaktische Implantation von Krebszellen in das Gehirn von Nacktmäusen durchführt und wie man serielle in vivo Biolumineszenz-Bildgebung durchführt, um das Wachstum als Reaktion auf die Behandlung des resultierenden intrakraniellen Tumors zu überwachen. Xenotransplantate.