Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Dies ist ein Max MIDI Magnet. Darin heißt es, Vorsicht vor extrem starken Magnetfeldern. Hallo, ich bin Melanie Matthew vom Mike Collins Labor am Department of Physiology and Biophysics der University of California Irvine

Heute zeigen wir Ihnen eine Präparation der Negativselektion von vier positiven Zöliakie-T-Zellen mit den Milton-Biotechnologie-Kits. Hier haben wir also den Minimax und die Minimax-Magnete und der Minimax wird für größere Trennungen verwendet. Sie können bis zu 10 bis zur neunten Zelle durch eine Säule laufen lassen, die in den Minimax passt, und die Minimax werden für viel kleinere Zellvolumina verwendet.

Je nachdem, ob Sie eine positive oder eine negative Trennung vornehmen oder nicht, markieren Sie Ihre Zellen mit dem entsprechenden Antikörper. Sie haben einen magnetischen Beat, der sich an den Magneten heftet. Im Falle einer negativen Auswahl durchlaufen die Zellen, an denen Sie interessiert sind, die Spalte und Sie können den EL-Schadstoff sammeln, der Ihre interessierenden Zellen enthält.

Ich sollte erwähnen, dass die Techniken, die ich Ihnen heute Abend zeige, nicht steril sind. Und wenn Sie diese Zellen für die Zellkultur verwenden möchten, sollten Sie in der Gewebekulturhaube alles mit sterilen Instrumenten erledigen. Obwohl ich Ihnen also ein Präparat für Zöliakie-4-positive T-Zellen zeige, sind viele dieser Techniken bei der Reinigung anderer Zelltypen mit den milit tiny Biotechnologie-Kits anwendbar.

Okay, ich habe Lymphknoten aus der Maus entfernt, und ich zeige Ihnen im Detail in der siebten Ausgabe von Joe lymph node preparation for two photon imaging, wie man das macht. Und jetzt werde ich die Lymphknoten in einem 70-Mikron-Zellsieb zu einer einzelligen Suspension zerkleinern. Okay, jetzt werde ich die Lymphknoten mit der Rückseite einer Sechs-Milliliter-Spritze zu einer einzelligen Suspension zerkleinern.

Die Lymphknoten befinden sich in RPMI in einem Filter, und es ist wichtig, eine richtige Einzelzellsuspension herzustellen. Und der Grund, warum wir dies in einem Filter tun, ist, dass Sie sicherstellen möchten, dass Sie keine Zellklumpen haben. Wenn ich mit dem Mahlen fertig bin, nehme ich den Filter aus dem Medium und verwende dann die Stoffe, die durch das Sieb gekommen sind, und die Einzelzellensuspension.

Wenn du schleifst, solltest du sicherstellen, dass du das gesamte Gewebe so weit wie möglich zerstörst. Aus dieser einzelligen Suspension werden wir unsere vier positiven Zöliakie-T-Zellen reinigen. Okay, jetzt bin ich mit dem Schleifen des Gewebes fertig und Sie können sehen, dass die meisten Lymphknoten so gut wie verschwunden sind.

Wir haben hier immer noch ein paar kleine Fettstücke und eine Art Hülle eines Lymphknotens mit ein wenig Bindegewebe, das von allen sechs Lymphknoten zusammengeklebt ist. Und jetzt entferne ich das Zellsieb. Und man sieht hier, dass die Medien sehr wolkig sind.

Er ist voll mit Zellen aus der Einzelzellsuspension, um sicherzustellen, dass wir eine maximale Anzahl von Zellen aus dem Filter erhalten, und einige von ihnen bleiben daran haften. Ich wasche es mit ein paar mil Medium und pipettiere dann das gesamte Medium in das 15 mil Falcon-Röhrchen und schleudere es nach unten, um die Zellen durch spätere Reinigung zu befallen. Hier ist also meine einzellige Suspension, heruntergeschleudert und 10 Minuten lang bei 300 g pelletiert.

Wenn Sie glauben, dass Sie eine hohe Population toter Zellen in Ihrer Einzelzellsuspension haben werden, ist es eine gute Idee, das Kit zur Entfernung toter Zellen von Milit Tene zu verwenden. Jetzt, wo ich das heruntergeprasselt habe, werde ich das Medium abgießen und eine Lyse der roten Blutkörperchen durchführen, und dann werde ich die Zellen zählen und dann ein CD mit vier positiven T-Zell-Negativ-Selektionskit für diese speziellen Zellen durchführen. Okay, jetzt werde ich eine Erythrozytenlyse machen.

Wir werden die roten Blutkörperchen, die wir zusammen mit den Lymphozyten pelletiert haben, lyzieren, indem wir die Osmolarität der Lösung verringern, indem wir zuerst Wasser hinzufügen und sie dann wieder auf eine eins-x-Lösung bringen, indem wir 10 X-D-B-P-S hinzufügen. Unsere Lymphozyten sind widerstandsfähiger gegen die Veränderung der Osmolarität als rote Blutkörperchen, aber wir müssen trotzdem schnell arbeiten oder unsere Lymphozyten werden entlasten, was wir nicht wollen. Ein Teil der Schnellarbeit besteht darin, dass ich die Volumina fülle, die ich für die Lyse benötige, bevor ich dem System tatsächlich Wasser hinzufüge.

Also möchte ich in der Lage sein, meine 10 X-D-B-P-S-A ein paar Sekunden nachdem ich mein Wasser hinzugefügt habe, hinzuzufügen, um sicherzustellen, dass ich meine Lymphozyten nicht lysiere und ich die roten Blutkörperchen anpasse. Also nehme ich 900 Mikroliter Wasser. Es ist fast eine Mühle und hundert Mikroliter 10 X-D-B-P-S.

Ich habe beide Pfeifen griffbereit. In der Lyse füge ich das Wasser hinzu, warte ein paar Sekunden, schüttle vielleicht das Röhrchen ein wenig und füge dann die 10 X-D-B-P-S hinzu, schüttle das Röhrchen noch ein wenig. Und wenn Sie viele rote Blutkörperchen haben, die Sie als Lysin bezeichnen, sehen Sie eine große Art von amorpher Klecksform aller gebrochenen Zellmembranen.

Wir haben hier ein bisschen davon und man kann sehen, dass es ein bisschen kaputte Zellmembranen sind. Nachdem ich also die Lyse durchgeführt habe, für den Fall, dass es einen Fehler beim Pipettieren gegeben hat, füge ich den Zellen gerne ein paar Mühlen Medien hinzu, um sicherzustellen, dass die Osmolarität korrekt ist und wir nicht mehr mit dem Lysin fortfahren. Okay, jetzt habe ich meine Lymphozyten in der Einzelzellsuspension.

Auch hier habe ich die Lyse der roten Blutkörperchen durchgeführt und werde sie nach unten schleudern und pelletieren. Bevor ich dies tue, werde ich sie auf dem Hämozytometer zählen, um zu bestimmen, wie viel Antikörper wir für das CD vier positive T-Zell-Negativ-Selektionskit hinzufügen müssen. Okay, jetzt gebe ich die Zellen in maximalem Puffer aus und Sie können sehen, dass das Pellet viel weißer ist, nachdem wir die Erythrozytenlyse durchgeführt haben.

Und ich werde eine negative Selektion für vier positive T-Zellen vornehmen. Also gieße ich alle Medien ab, den gesamten maximalen Puffer, in dem ich die Zellen verbringe. Und ich werde mit dem Biotin-Antikörper-Cocktail vier positive T-Zellen markieren, der der erste Schritt in der negativen Selektion für Zöliakie ist.

Und dann inkubiere ich 10 Minuten im Kühlschrank. Okay, meine Zellen sind also mit ihrer ersten Inkubation fertig. Jetzt füge ich das Antibiotikum zu den Mikrokügelchen hinzu und stelle sie für 15 Minuten wieder in den Kühlschrank.

Für diese spezielle Zelltrennung verwenden wir eine LS-Säule von Milit Tiny Biotech und wir werden sie auf den Magnethalter setzen und die Säule vorbereiten, indem wir drei Mühlen mit maximalem Puffer laufen lassen. Durch sie hindurch öffnen wir die Säule und platzieren sie so, dass die Zinken nach innen in den Magneten zeigen. Jetzt füge ich der Spalte den maximalen Puffer hinzu, und Sie sollten sehen, dass er in der LS-Spalte nach unten geht und unten heraustropft. Machen Sie sich keine Sorgen, dass die Säule trocken läuft.

Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit verhindert, dass sie trocken läuft, bis Sie Ihre Zellen hinzufügen. Bevor Sie Ihre Zellen hinzufügen, ist es wichtig, den maximalen Puffer vollständig durch die Säule trinken zu lassen. Okay, nach der 15-minütigen Inkubation mit unseren magnetischen Biotin-Kügelchen, die ich für die Zellen und den maximalen Puffer ausgegeben habe, werde ich den Puffer abgießen und sie in einer Puffermenge resuspendieren, die unserer Zellzahl entspricht.

Sie müssen also Ihr milli tiny Protokoll dafür überprüfen. Und dann wende ich sie auf die Spalte an, die wir gerade mit Max Buffer gespült haben. Jetzt fügen wir der Spalte die Zellensuspension hinzu.

Und da es sich um eine Spalte mit negativer Selektion handelt, werden wir die Zellen sammeln, die durchflossen sind, und das sollten in diesem Fall alle CD vier positive T-Zellen sein. Jetzt wasche ich die Säule mit 12 mil maximalem Puffer, und wieder sammeln wir die Eluierung, die nur vier positive T-Zellen enthalten sollte. Jetzt werde ich die vier positiven T-Zellen der CD herunterdrehen, sie resuspendieren und sie dann mit dem entsprechenden Farbstoff markieren, den ich für die Tau-Bildgebung verwenden werde.

Ich werde auch eine kleine Probe der Zellen nehmen, die ich gereinigt habe, und sie mit Anti-CD 3 und Anti-CD vier markieren und sie auf Fakten laufen lassen, um sicherzustellen, dass ich eine saubere Population von CD 4-positiven T-Zellen habe. Hier ist also ein Blick auf die Zellen, die wir gerade heruntergedreht haben. Dabei sollte es sich um eine Population von reinen CD drei, CD vier positiven T-Zellen handeln.

Also habe ich Ihnen gerade eine negative Selektion für CD vier positive T-Zellen gezeigt. Mit dem winzigen Biotech-Kit von Milit werden wir diese Zellen adoptiv in eine Maus übertragen und sie für eines unserer eigenen T-Photonen- und Maschinenexperimente verwenden. Viel Glück bei Ihren eigenen Experimenten.