Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Dies ist ein Max-MIDI-Magnet. Darauf steht: Vorsicht, extrem starke Magnetfelder. Hallo, ich bin Melanie Matthew aus dem Labor von Mike Collins am Department für Physiologie und Biophysik der University of California Irvine.

Heute zeigen wir Ihnen die negativselektive Aufreinigung von CD4-positiven T-Zellen mithilfe der Kits von Milton Biotechnology. Hier haben wir den Minimax und die Minimax-Magnete. Der Minimax wird für größere Trennungen verwendet. Man kann bis zu 10⁹ Zellen durch eine Säule leiten, die in den Minimax passt. Der Minimax wird hingegen für deutlich geringere Zellvolumina verwendet.

Je nachdem, ob eine positive oder negative Trennung durchgeführt wird, markieren Sie Ihre Zellen mit dem entsprechenden Antikörper. Diese trägt ein magnetisches Kügelchen, das an den Magneten bindet. Im Fall einer negativen Selektion laufen die Zellen, an denen Sie interessiert sind, durch die Säule, und Sie können den Durchlauf sammeln, der Ihre Zellen von Interesse enthält.

Ich sollte erwähnen, dass die Techniken, die ich Ihnen heute Abend zeige, nicht steril sind. Wenn Sie diese Zellen also für die Zellkultur verwenden möchten, sollten Sie alle Arbeitsschritte in der Gewebekulturhaube mit sterilen Instrumenten durchführen. Obwohl ich Ihnen hier eine Aufreinigung von CD4-positiven T-Zellen zeige, lassen sich viele dieser Techniken auch auf die Reinigung anderer Zelltypen mithilfe der Miltenyi-Biotechnologie-Kits übertragen.

Okay, ich habe die Lymphknoten von der Maus entfernt, und ich zeige Ihnen ausführlich, wie dies in Ausgabe sieben von JoVE zur Lymphknotenpräparation für die Zweiphotonen-Bildgebung durchgeführt wird. Nun werde ich die Lymphknoten in einem 70-Mikrometer-Zellfilter zu einer Einzelzell-Suspension zerkleinern. Okay, jetzt zerkleinere ich die Lymphknoten mithilfe des Kolbens einer sechs-Milliliter-Spritze zu einer Einzelzell-Suspension.

Die Lymphknoten befinden sich in RPMI innerhalb eines Filters, und es ist wichtig, eine geeignete Einzelzell-Suspension herzustellen. Der Grund dafür, dass wir dies in einem Filter tun, ist, dass Sie sicherstellen möchten, dass keine Zellklumpen vorhanden sind. Wenn ich also mit dem Zerkleinern fertig bin, werde ich den Filter aus dem Medium nehmen und anschließend die Zellen verwenden, die durch das Sieb gegangen sind, sowie die Einzelzell-Suspension.

Wenn Sie mahlen, sollten Sie sicherstellen, dass Sie das gesamte Gewebe so stark wie möglich disruptieren. Diese Einzelzell-Suspension ist die Quelle, aus der wir unsere CD4-positiven T-Zellen reinigen werden. Gut, ich habe das Mahlen des Gewebes nun abgeschlossen, und Sie können sehen, dass die meisten Lymphknoten weitgehend verschwunden sind.

Wir haben hier noch einige kleine Fettanteile und gewissermaßen die Hülle eines Lymphknotens mit etwas Bindegewebe, das alles von den sechs Lymphknoten zusammenhängt. Nun entferne ich den Zellfilter. Und Sie können hier sehen, dass das Medium sehr trüb ist.

Es ist voller Zellen aus der Einzelzell-Suspension, um sicherzustellen, dass wir eine maximale Anzahl an Zellen aus dem Filter erhalten, wobei einige davon daran haften bleiben. Ich wasche es mit einigen Millilitern Medium und pipettiere anschließend das gesamte Medium in ein 15-ml-Falcon-Röhrchen, das ich zentrifugiere, um die Zellen später für die Reinigung zu pelletieren. Hier ist also meine Einzelzell-Suspension, zentrifugiert und pelletiert bei 300 × g für 10 Minuten.

Wenn Sie erwarten, dass sich in Ihrer Einzelzell-Suspension eine hohe Anzahl toter Zellen befindet, ist es ratsam, das Kit zur Entfernung toter Zellen von Miltenyi Tene zu verwenden. Da ich die Probe nun pellettieren habe, werde ich das Medium abgießen und eine Lyse der roten Blutkörperchen durchführen. Anschließend werde ich die Zellen zählen und dann ein CD4-positives T-Zell-Negativselektionskit auf diese speziellen Zellen anwenden. Gut, nun führe ich die Erythrozytenlyse durch.

Wir werden die roten Blutkörperchen, die wir zusammen mit den Lymphozyten pelletiert haben, lysieren, indem wir die Osmolarität der Lösung verringern, indem wir zunächst Wasser hinzufügen und sie anschließend durch Zugabe von 10 X-D-B-P-S wieder auf eine 1x-Lösung erhöhen. Unsere Lymphozyten sind gegenüber der Änderung der Osmolarität resistenter als rote Blutkörperchen, doch wir müssen dennoch schnell arbeiten, da wir sonst auch die Lymphozyten lysieren würden, was wir nicht wollen. Ein Teil der schnellen Arbeitsweise besteht darin, dass ich die Volumina, die ich für die Lyse benötigen werde, bereits vor dem eigentlichen Hinzufügen von Wasser zum System auffülle.

Ich möchte mein 10×-D-B-P-S einige Sekunden, nachdem ich das Wasser hinzugegeben habe, hinzufügen, um sicherzustellen, dass ich meine Lymphozyten nicht lysiere und lediglich die roten Blutkörperchen lysiere. Dazu nehme ich 900 Mikroliter Wasser, das sind fast ein Milliliter, und hundert Mikroliter 10×-D-B-P-S.

Ich habe beide Pipetten bereit. Bei der Lyse gebe ich Wasser hinzu, warte einige Sekunden, schüttele das Reagenzglas möglicherweise leicht und füge dann den 10×-DBPS hinzu, anschließend schüttele ich das Reagenzglas etwas stärker. Und wenn Sie viele rote Blutkörperchen lysieren, werden Sie eine große, amorphe Ansammlung aus gebrochenen Zellmembranen entstehen sehen.

Wir haben hier eine kleine Menge davon, und Sie können sehen, dass es sich um etwas gebrochene Zellmembranen handelt. Nachdem ich die Lyse durchgeführt habe, füge ich gerne noch einige Milliliter Medium zu den Zellen hinzu, falls beim Pipettieren ein Fehler aufgetreten ist, um sicherzustellen, dass die Osmolarität korrekt ist und keine weitere Lyse stattfindet. Gut, nun habe ich meine Lymphozyten in einer Einzelzell-Suspension.

Auch hier habe ich die Lyse der roten Blutkörperchen durchgeführt und werde sie nun zentrifugieren, um sie zu pelletieren. Vorher werde ich sie mit dem Hämozytometer zählen, um zu bestimmen, wie viel Antikörper wir für das CD4-positive T-Zell-Negativselektionskit hinzufügen müssen. Gut, jetzt zentrifugiere ich die Zellen in Max-Puffer, und Sie können sehen, dass das Pellet nach der RBC-Lyse deutlich weißer ist.

Und ich werde eine negative Selektion für CD4-positive T-Zellen durchführen. Dazu gieße ich das gesamte Medium sowie den gesamten Max-Puffer, in dem ich die Zellen suspendiert habe, ab. Anschließend werde ich mit dem Biotin-Antikörper-Cocktail markieren, was Schritt eins bei der negativen Selektion für CD4-positive T-Zellen darstellt.

Dann inkubiere ich 10 Minuten im Kühlschrank. Gut, meine Zellen sind mit der ersten Inkubation fertig. Nun werde ich das Antibiotikum zu den Mikroperlen hinzufügen und sie erneut 15 Minuten im Kühlschrank lagern.

Für diese spezielle Zellseparation verwenden wir eine LS-Säule von Miltenyi Biotec und befestigen sie am magnetischen Halter. Die Säule wird vorbereitet, indem wir drei Milliliter MAX-Puffer hindurchlaufen lassen. Nun öffnen wir die Säule und positionieren sie so, dass die Haltezungen nach innen in Richtung Magnet zeigen. Ich werde jetzt den MAX-Puffer zur Säule hinzufügen; Sie sollten sehen, wie er durch die LS-Säule läuft und am unteren Ende zu tropfen beginnt. Es ist nicht schlimm, wenn die Säule austrocknet.

Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit verhindert, dass sie austrocknet, bis Sie Ihre Zellen hinzufügen. Bevor Sie die Zellen hinzufügen, ist es wichtig, den Max-Puffer vollständig durch die Säule ziehen zu lassen. Gut, nach der 15-minütigen Inkubation mit unseren anti-Biotin-Magnetbeads, die an die Zellen und den Max-Puffer gebunden sind, werde ich den Puffer abgießen und die Zellen in einer für unsere Zellzahl geeigneten Puffermenge resuspendieren.

Sie müssen daher Ihr Milli-Tiny-Protokoll dafür überprüfen. Anschließend werde ich die Probe auf die Säule auftragen, die wir gerade mit Max-Puffer gewaschen haben. Nun fügen wir die Zellsuspension der Säule hinzu.

Und da dies eine Negativselektionssäule ist, werden wir die Zellen sammeln, die durchgeflossen sind, und diese sollten in diesem Fall ausschließlich CD4-positive T-Zellen sein. Nun werde ich die Säule mit 12 ml MAX-Puffer waschen und erneut das Eluat sammeln, das nur CD4-positive T-Zellen enthalten sollte. Anschließend werde ich die CD4-positiven T-Zellen abzentrifugieren, resuspendieren und sie dann mit dem geeigneten Farbstoff markieren, den ich für die Tau-Bildgebung verwenden werde.

Ich werde außerdem eine kleine Probe der gereinigten Zellen entnehmen, sie mit Anti-CD3- und Anti-CD4-Antikörpern markieren und auf einem FACS-Gerät analysieren, um sicherzustellen, dass ich eine reine Population von CD4-positiven T-Zellen erhalten habe. Hier sehen wir die Zellen, die wir gerade abzentrifugiert haben. Dies sollte eine Population reiner CD3-, CD4-positiver T-Zellen sein.

Ich habe Ihnen soeben die negative Selektion von CD4-positiven T-Zellen gezeigt. Mithilfe des Miltenyi Biotec-Kits werden wir diese Zellen adoptiv in eine Maus übertragen und für eines unserer eigenen T-Photon- und Maschinenexperimente verwenden. Viel Erfolg bei Ihren eigenen Experimenten.