Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic C elegans

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Abmessungen und Helligkeit punktförmiger fluoreszierender Signale in Gans effizient zu quantifizieren. So können große Populationen von Objekten statistisch ausgewertet werden, wobei synaptische Proteine abgebildet werden.

In dieser Demonstration besteht der erste Schritt des Verfahrens darin, synchronisierte Kulturen hoher Dichte der betreffenden ELEGANS zu erzeugen. Anschließend werden konfokale Aufnahmen der markierten Synapsen angefertigt, wobei die Variabilität von Bild zu Bild minimiert wird. Synaptische Pünktchen werden automatisch identifiziert und von der Hintergrundfluoreszenz unterschieden.

Der letzte Schritt besteht darin, die Daten zu tabellieren und zu organisieren, um eine effiziente nachgeschaltete Analyse zu ermöglichen. Letztendlich können die Ergebnisse genau zeigen, wie experimentelle Bedingungen die Verteilung synaptischer Proteine oder jedes anderen Proteins, das an hochkontrastreichen Pünktchen lokalisiert ist, beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Analyse von Zack-Projektionen liegt darin, dass alle Daten erhalten bleiben, einschließlich der Synapsenvolumina, und die automatisierte Identifizierung eine schnelle Erfassung von Hunderten von Proben pro Bedingung ermöglicht. Getestet.

Dieses Protokoll erfordert Hochdichtekulturen adulter CL egan'scher Würmer, die auf 10 cm hohen Peptid-NGM-Agarplatten mit NA 22 e Coli-Bakterien gezüchtet wurden; bereiten Sie genau eine Platte für jede geplante immunologische Färbung vor. Beginnen Sie mit der Ernte der Würmer und einigen Millilitern Wasser. Überführen Sie diese in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die meisten Würmer gesammelt sind.

Zentrifugieren Sie die Würmer und waschen Sie das Pellet bis zu dreimal mit Wasser, bis das Überstand klar ist. Dadurch werden Reste von Bakterien entfernt. Überführen Sie stets Lösungen, die Würmer oder Eier enthalten können oder enthalten, mit Plastikpipetten, da diese an Glas haften können. Nun ist es entscheidend, zügig die verbleibenden Schritte durchzuführen, um einen Verlust der Ei-Vitalität zu vermeiden.

Lösen Sie die Eier des Wurms, indem Sie diese in fünf Millilitern alkalischer Hypochloritlösung erneut verbiegen. Schwenken Sie die Röhrchen vorsichtig und untersuchen Sie sie etwa einmal pro Minute unter einem Stereomikroskop. Nach fünf Minuten, oder sobald etwa die Hälfte der Würmer in einem Röhrchen verbogen und aufgebrochen erscheint.

Füllen Sie das Röhrchen bis oben mit Eipuffer und stürzen Sie es mehrmals um. Nachdem die Fadenwürmer pelletiert wurden, pipettieren Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn. Waschen Sie das Pellet anschließend dreimal mit Eipuffer.

Nach den Waschungen suspendiert Reese das Pellet in fünf Milliliter Wasser, gefolgt von der Zugabe von fünf Milliliter steriler 60 %iger Saccharoselösung in Wasser; gut mischen. Nach dem Eintrocknen der Suspension befinden sich die Eier an der Meniskusoberfläche und erscheinen trüb.

Überführen Sie jede Eiersammlung auf eine eigene nicht beimpfte 10 cm große NGM-Agarplatte. Zum Überführen von X auf die Platte kann Wasser verwendet werden, jedoch sollte die Menge an überführter Flüssigkeit möglichst gering gehalten werden. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 20 Grad Celsius für die ersten paar Stunden. Belüften Sie die Platten, indem Sie die Deckel leicht geöffnet lassen, achten Sie jedoch darauf, sie über Nacht abzudecken.

Nach dem Schlüpfen überführen Sie die L1-Larven in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das mit S basil gefüllt ist. Pelletieren Sie die L1-Larven und resuspendieren Sie sie in einem minimalen Volumen von S basil. Anschließend teilen Sie jede L1-Sammlung auf zwei 10-Zentimeter-NGM-Agarplatten auf, die mit NA22-Bakterien beimpft wurden.

Überwachen Sie die Kulturen ein- bis zweimal täglich. Falls sie Gefahr laufen, zu verhungern, überführen Sie sie vor dem Verhungern auf frische NA-22-Platten, während sich Typ-N-Zweier-Sammellinien bilden, die sich wellenartig von den auf diesen Platten bereits entleerten Nahrungszonen wegbewegen; die Nahrung wird innerhalb weniger Stunden vollständig erschöpft sein.

Wenn die Würmer das gewünschte Alter erreicht haben, sind sie bereit für die Immunfärbung oder die Live-Bildgebung, um die Würmer einzubetten. Für die konfokale Bildgebung verwenden Sie Antifa-Einbettmedium, um ihre Dichte auf einige hundert Würmer pro Mikroliter einzustellen.

Mit Erfahrung kann diese Dichte anhand der Trübung der Suspension erkannt werden. Idealweise liegen die Würmer dicht gepackt, aber nicht übermäßig überlappend, auf dem Objektträger. Auf dem Objektträger eine Unterlage aus 2 % Agarose in ESP-Basil, umgeben von einem dünnen Ring aus Vaseline, anlegen.

Um eine Verdunstung während der Bildgebung zu verhindern, tragen Sie Vaseline mittels einer Dreimilliliter-Spritze auf, die mit einer abgeschnittenen 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Pipettieren Sie nun einige Mikroliter der Wurmsuspension mit einer Pipettenspitze, deren Ende abgeschnitten wurde, um eine Scherbelastung der Würmer zu vermeiden, auf eine Deckglas und setzen Sie das Agarose-Pad vorsichtig auf das Deckglas, wobei die Würmer unter dem Mikroskop gleichmäßig auf dem Pad verteilt werden. Synapsen von Interesse sollten so ausgerichtet sein, dass sie direkt zur Objektivlinse zeigen oder sich innerhalb eines Winkels von 45 Grad dazu befinden.

Verbringen Sie einige Sekunden hier, um eine Photo-Bleaching zu vermeiden. Die Kultur und die Bedingungen sollten genügend Würmer liefern, um dieses strenge Kriterium zu erfüllen, das hier als ideale Orientierung dargestellt ist, bei der die ventrale Nervenbahn direkt zum Objektiv hin ausgerichtet ist. Dieser nächste würde abgelehnt werden, weil die ventrale Nervenbahn direkt vom Objektiv weg orientiert ist.

Beachten Sie, wie die dorsale Schnur, die in dieser Probe in Richtung der Linse orientiert ist, das schärfere Bild erzeugt. Hier ist ein weiteres Beispiel, das abgelehnt würde, da die dorsale und ventrale Schnur an den Rändern des Wurms liegen. In diesem Fall müssten Anregungs- und Emissionslicht durch mehr Wurmgewebe hindurchtreten und würden dadurch verzerrt.

Die größte Herausforderung besteht darin, die Variabilität innerhalb der Behandlungsgruppen zu minimieren; eine Alterssynchronisation und die Auswahl von Würmern, bei denen die Struktur von Interesse direkt auf das Objektiv ausgerichtet ist, können hierbei sehr hilfreich sein. Der Beginn mit großen Kulturen erhöht die Auswahl an Würmern und trägt so zu maximaler Konsistenz bei. Für optimale Bildergebnisse sollten relativ flache Proben gewählt werden, die innerhalb eines Stapels von 14 oder weniger Schichten erfasst werden können.

0,4 Mikrometer dicke Schnitte. Schnelle, niedrig aufgelöste Bilder sind ausreichend für eine rasche und genaue Datenerfassung. Vermeiden Sie eine Sättigung des Detektors durch übermäßige Signalstärken, da dies zu einer Unterschätzung der Fluoreszenzsignale führt.

Diese Demonstration verwendet das im Handel erhältliche Softwarepaket Velocity, das mindestens Version 4.0 aufweisen muss. Viele alternative Softwarelösungen verlieren dreidimensionale Informationen. Nachdem Sie die Multi-TIFF-Ausgabedateien des konfokalen Mikroskops geöffnet haben, wählen Sie Bild, dann erweiterter Fokus und anschließend Freihand.

ROI beschneidet nun Bereiche des Bildes, die die Struktur von Interesse nicht enthalten. Mithilfe des aktivierten Werkzeugs bietet der erweiterte Fokus eine Z-Ebenen-Projektion, um die ROI-Auswahl zu erleichtern. Dies beeinflusst die zugrunde liegenden Daten nicht.

Ebenso beeinflussen Helligkeits- und Kontrastanpassungen nicht die zugrunde liegenden Daten. Schließen Sie den Zuschnitt ab, indem Sie Aktionen auswählen und auf die Auswahl zuschneiden. Messen Sie anschließend die Länge des analysierten Bereichs.

Unter Verwendung des Linienwerkzeugs wird die Länge der Linie berechnet und der Datentabelle hinzugefügt. Identifizieren Sie nun Objekte mithilfe des Filters „Objekte nach Intensität“ im Messmodus. Die Einbeziehung eines unabhängigen synaptischen Markers, der mit einer eindeutigen Farbe markiert ist, kann helfen, Synapsen eindeutig zu identifizieren, indem ein Schwellenwert festgelegt wird, sodass synaptische Cluster hervorgehoben werden, nichtsynaptischer Hintergrund jedoch nicht.

Führen Sie dies nur einmal mit einer Kontrollprobe durch und verwenden Sie diese für alle nachfolgenden Proben; eine getrennte Schwellenwertbestimmung für jede Probe ist unzulässig, da sie die Möglichkeit von experimenteller Voreingenommenheit mit sich bringt. Objekte werden automatisch ausgewählt und tabelliert. Typische Synapsen umfassen einige bis einige hundert Voxel; sortieren Sie die Daten vor dem Exportieren nach Objektgröße.

Dies erleichtert die nachgeschaltete Entfernung von Objekten mit zwei oder weniger Voxel, die gewöhnlich nur Hintergrundartefakte darstellen. Exportieren Sie nun die Daten im CSV-Format, das mit jedem Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet werden kann. Jedes Bild erzeugt eine Ausgabedatei, um Aufnahmen des ventralen Nervenstrangs von CL gans, die 49 GABA-Rezeptoren zeigen, zu sortieren und zu exportieren, die mit dem beschriebenen Protokoll erstellt wurden.

Alle Tiere wiesen eine sehr ähnliche Größe und Reife auf. Die Gesamtwerte der synaptischen Fluoreszenz für fünf Würmer wurden normalisiert, bezogen auf die analysierte Länge des Nervenstrangs. Diese Daten zeigten Standardfehlerwerte von etwa 10 % des Mittelwerts.

Das Bild auf der linken Seite ist roh, ohne Schwellenwert- und Hintergrundbereinigung. Die Synapsen wurden mit Muscimol, einem GABA-Rezeptoragonisten, behandelt, der nach längerer Exposition eine Downregulation der Rezeptoren bewirkt. Die Gesamtfluoreszenz wurde quantifiziert und auf die Länge des Nervenstrangs sowie die kumulative Wahrscheinlichkeit normalisiert.

Histogramme des synaptischen Fluoreszenzgehalts einzelner Individuen wurden berechnet. Dasselbe wurde für das Synapsenvolumen berechnet. Diese Messungen zeigen, dass die Exposition gegenüber einem Agonisten den synaptischen Gehalt und das Volumen signifikant verringert.

Insgesamt sollten quantitative Ergebnisse stets das widerspiegeln, was visuell erkennbar ist. Andernfalls sollte die Untersuchung der Bilder und der durch die Geschwindigkeit identifizierten Objekte zeigen, wo der Fehler aufgetreten ist, und korrigierende Maßnahmen wie Schwellenwertbestimmung oder Entfernung von Artefakten nahelegen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es entscheidend, Würmer für die Bildgebung anhand ihrer geometrischen Ausrichtung auszuwählen, anstatt auf Grundlage einer subjektiven Einschätzung der Bildqualität; nach Möglichkeit wird eine verblindete Bewertung dringend empfohlen.