Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, die Rolle polarisierter Makrophagen in einem biologischen Prozess in vivo zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst Makrophagen von Mäusen dezimiert werden. Als nächstes werden neue Makrophagen erzeugt, die einzigartige Merkmale aufweisen und unterschiedliche Funktionen haben.

Dann werden die polarisierten Makrophagen adoptiv in Mäuse übertragen, um ihre Rolle im biologischen Prozess von Interesse zu bestimmen. Letztendlich können Unterschiede in der Makrophagen-vermittelten Entzündung basierend auf der klinischen und histologischen Erkrankung gemessen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Kreuzung von Mäusen mit einem CD 11 BDTR-Hintergrund besteht darin, dass diese Methode schneller ist als die Zucht von Mäusen.

Für Experimente. Es ist relativ einfach und kostengünstig und kann mit Mäusen beliebiger genetischer Herkunft durchgeführt werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Rolle von Makrophagen im Darm geben kann, kann sie auch auf eine Vielzahl anderer Organe angewendet werden, darunter Leber, Milz und Lunge.

Entfernen Sie zwei Stunden vor der Injektion die Röhrchen mit Liposomen und PBS aus der Lagerung bei vier Grad Celsius. Wenn die Liposomen Raumtemperatur erreicht haben, drehen Sie die Röhrchen acht- bis zehnmal um, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Laden Sie dann 200 Mikroliter der warmen bis liposomischen Suspension in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel.

Rollen Sie die Spritze zwischen den Handflächen beider Hände und drehen Sie sie sechsmal um, um die Liposomenlösung vor der Injektion gleichmäßig zu verteilen. Benutze nun eine Maus direkt unter den Ohren, halte mit einer Hand genug Haut fest, um ihren Kopf und ihre Gliedmaßen bewegungsunfähig zu machen, und neige dann die Maus so, dass ihr Kopf leicht zum Boden zeigt. Halten Sie dann die Spritze in einem Winkel von 30 bis 40 Grad.

Führen Sie die Nadel in den unteren rechten Quadranten des Bauches ein und injizieren Sie 200 Mikroliter Liposomenlösung. Nachdem Sie eine acht bis 12 Wochen alte Maus eingeschläfert und die Gliedmaßen in einer ausgestreckten Position befestigt haben, entfernen Sie die Oberschenkelknochen und Schienbeine und schneiden Sie während des Präziervorgangs so viel Muskel wie möglich ab. Laden Sie dann eine Fünf-Milliliter-Spritze mit IMDM mit 10 % FCS.

Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel und spülen Sie das Mark von den Knochen. Verdünnen Sie die Knochenmarkaspirate in 40 Millilitern IMDM mit FCS und übertragen Sie die Zellen dann in einen 75 Zentimeter großen Gewebekulturkolben. Inkubieren Sie die Kultur nach vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Sammeln Sie das Supinat in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die nicht anhaftenden Vorläuferzellen fünf Minuten lang bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur. Nach der Zählung werden die zurückgewonnenen Zellen in einer Konzentration von 0,5 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in vollständigem Medium in frischen 75-Zentimeter-Quadratkolben kultiviert. Am vierten Tag werden die nicht adhärenten Zellen heruntergeschleudert und in frischem Medium wieder in die Kolben gegeben.

Entsorgen Sie am siebten Tag die nicht adhärenten Zellen und ersetzen Sie sie durch frische Medien. Entsorgen Sie an Tag 10 die Medien. Geben Sie dann fünf Milliliter Zelldissoziationspuffer in den Kolben.

Nach fünf Minuten wird mit dem Handballen einer Hand mehrmals kräftig auf die Seite des Kolbens geschlagen. Untersuchen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie sich vom Boden des Kolbens abgehoben haben. Pipettieren Sie dann die resuspendierten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Der Kolben wird mit weiteren 10 Millilitern IMDM plus FCS gewaschen und die Zellen dann fünf Minuten lang bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur heruntergeschleudert. Nach der Zählung resuspendieren Sie die gewonnenen Zellen in einer Konzentration von 10 bis sieben Zellen pro Milliliter in sterilem PBS und reservieren Sie einmal 10 bis sechs Makrophagen für die Beurteilung des Makrophagen-Phänotyps. Beginnen Sie mit der Bestückung einer mit 100 Mikrolitern gefüllten Ein-Milliliter-Spritze an der gerade vorbereiteten Makrophagensuspension mit einer 26-Gauge-Nadel. Als nächstes verwenden Sie eine Wärmelampe für fünf bis 10 Minuten, um die Schwanzvene zu erweitern.

Nachdem Sie die Maus auf ein Rückhaltegerät übertragen haben, drehen Sie den Schwanz um 90 Grad, sodass die Vene nach oben zeigt. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer und halten Sie dann die Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben. Führen Sie die Nadel in einem leichten Winkel fast parallel zur Vene ein.

Wenn die Nadel richtig eingeführt wird, sollte kein Widerstand zu spüren sein und die Vene sollte nach der Injektion klar werden. Nach der Injektion üben Sie sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, bis die Blutung aufhört. Diese immunhistochemischen Schnitte eines Dickdarms aus der Maus zeigen, dass die intraperitoneale Injektion von Clodronat-haltigen Liposomen zu einer Abnahme der F vier 80 positiven Makrophagen während der DSS-induzierten Kolitis führt, was durch die Abnahme der F vier 80 Färbung bei braunen Mäusen im Vergleich zu kontrollierten PBS-injizierten Mäusen mit Arginase eins positiv belegt wird. Alternativ werden aktivierte Makrophagen im Braunen auch erfolgreich durch Clodronat-Liposomen-Injektionen depletiert.

Der blaue Fleck in dieser und der vorherigen Abbildung stellt Zellkerne dar, während das Balkendiagramm die quantitative Bewertung von F vier 80 positiven MCSF-abgeleiteten Makrophagen und Arginase ein positives zeigt. Alternativ deutet aktiviertes MCSF-abgeleitetes plus IL vier behandelte Makrophagen darauf hin, dass beide Populationen bei Mäusen, die intraperitoneale Injektionen von Clodronat-Liposomen erhalten, signifikant depletiert sind. Diese Daten zeigen die Ergebnisse eines typischen Fettassays, bei dem der Gehalt an Stickstoffmonoxid als Reaktion auf Lipopolysaccharid gemessen wird, indem der nachgeschaltete Metabolit Nitrit nachgewiesen wird.

Somit produzieren klassisch aktivierte MCSF-abgeleitete Makrophagen signifikant höhere Mengen an Nitrit im Vergleich zu alternativ aktivierten MCSF-abgeleiteten plus IL-4-behandelten Makrophagen. Klassisch aktivierte Makrophagen produzieren auch ein höheres Verhältnis von IL 12 P 70 zu IL 10 im Vergleich zu alternativ aktivierten Makrophagen, gemessen mit ELA, was mit einem alternativ aktivierten Phänotyp übereinstimmt. MCSF-abgeleitete Makrophagen, die mit IL vier behandelt wurden, exprimieren konstitutiv YM 1 und Arginase eins, wie sie durch westliche Immunflossing nachgewiesen wurden.

Hier wird die Gesamtzahl der klassisch aktivierten M1-Makrophagen und die Anzahl der alternativ aktivierten M two-Makrophagen in histologischen Schnitten von Mäusen gezählt, die mit polarisierten Makrophagen aus dem Knochenmark injiziert wurden. Der C-Datenbalken zeigt Kontrollmäuse an, die eine PBS-Injektion ohne Makrophagen erhielten. Die Auswirkungen, die der Transfer polarisierter Makrophagen auf den Dickdarm während einer DSS-induzierten Kolitis hat, werden durch den Krankheitsaktivitätsindex angezeigt, einen additiven Score, der auf Gewichtsverlust, rektalen Blutungen und verminderter Stuhlkonsistenz basiert.

Es ist zu beachten, dass M1-Makrophagen keinen Einfluss auf die Entzündung haben, während M-2-Makrophagen den Krankheitsaktivitätsindex signifikant reduzieren. Daher zeigen diese Ergebnisse, dass die von Dex vivo abgeleiteten, adoptiv übertragenen Makrophagen in den Dickdarm gelangen und die induzierte Entzündung nach seiner Entwicklung beeinflussen können. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher, die die Makrophagenbiologie untersuchten, um die Rolle der Makrophagenpolarisation bei Mäusen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Rolle polarisierter Makrophagen bei der Homöostase und bei der Krankheit bei Mäusen bestimmen können.