NADH Fluoreszenz-Imaging von isolierten biventrikulären Arbeiten Kaninchenherzen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Stoffwechsel zu untersuchen. Bei der Verwendung der NADH-Bildgebung in einer funktionierenden Herzpräparation wird dies erreicht, indem zunächst das Kaninchenherz isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, alle vier Herzkammern erfolgreich zu kanülieren, um ein funktionierendes Herzmodell zu erhalten.

Der letzte Schritt ist die Einrichtung der bildgebenden Geräte und die Erfassung von NADH-Daten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Letztendlich können die Ergebnisse metabolische Veränderungen des Herzens durch die Bildgebung von fluoreszierendem NADH zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Lanor-Retro-Profusion besteht darin, dass das Herz in seinem physiologischen Zustand mit einer Strömung in normaler Richtung arbeitet und das Herz seinen eigenen Druck für die koronare Perfusion bereitstellt.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Elektrophysiologie und der Mechanismen letaler Herzrhythmusstörungen zu beantworten. Dies geschieht durch die Bereitstellung eines physiologischen Modells, um den Zusammenhang zwischen dem koronaren Flussstoffwechsel und der elektrischen Aktivität zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Kanülierungsschritte für Gefäße und Herzkammern schwer zu erlernen sind.

Eine unsachgemäße Technik kann das Herz schädigen und den Rest des Experiments gefährden. Spülen Sie vor dem Ausführen eines Experiments alle Schläuche in den Kammern des funktionierenden Herzsystems mit gereinigtem Wasser aus und spülen Sie dann das Wasser aus dem System, indem Sie die Pumpen laufen lassen. Fügen Sie Zellulosemembranfilter in Übereinstimmung mit der LOR-Perfusionspumpe, der Linksherzperfusionspumpe und der Rechtsherzperfusionspumpe hinzu.

Nachdem Sie dem System die Perfuse acht hinzugefügt haben, führen Sie für jeden Drucksensor eine Zweipunktkalibrierung durch. Schalten Sie das beheizte zirkulierende Wasserbad ein, das die wasserummantelten Rohre und die Wärmetauscher erwärmt. Schalten Sie das Wasserbad ein. Wird zum Heizen der PERFUSE Acht verwendet.

Schalten Sie die Pumpen ein, die die PERFUSE acht in einem geschlossenen Kreislauf zirkulieren lassen, und schalten Sie den Umwälzbehälter ein, um die Perfuse mit Sauerstoff zu versorgen. Achten Sie darauf, dass der Mikrofaser-Oxygenator oder die Hämofilter 95 % Sauerstoff für die Perfusion Acht bei 80 Kilopascal liefern. Stellen Sie abschließend sicher, dass die Wärmetauscher die Temperatur der zirkulierenden Persicherung halten.

Acht bei 37 Grad Celsius, beginnen Sie die Herzexzision, indem Sie zuerst das funktionierende Herzsystem so einstellen, dass es unter konstantem Druck arbeitet. LRF-Modus. Stellen Sie den Druck des Aortenblocks zwischen 50 und 60 ein, nachdem Sie ein Kaninchen sediert haben.

Injizieren Sie Pentobarbital und Heparin entweder in die marginale Ohrvene oder in die laterale Vena saphena an der Innenseite der hinteren Extremität. Sobald dem Kaninchen ein Schmerzreflex fehlt, öffnen Sie schnell die Brusthöhle. Schneiden Sie das Perikard auf, klemmen Sie die Aorta ein und entfernen Sie Herz und Lunge.

Die Lunge wird befestigt gehalten, um die Isolierung der Lungenvenen zu erleichtern. Füllen Sie anschließend eine Spritze mit 60 Millilitern pro F acht und 200 Einheiten Heparin. Befestigen Sie eine Fünf-Millimeter-Kanüle und kanülieren Sie die Aorta.

Befestigen Sie die Aorta mit Seidennähten der Größe Null an der Kanüle. Drücken Sie dann langsam auf die Spritze, um das Blut durch das Herz auszuspülen. Richten Sie das funktionierende Herzsystem ein, indem Sie zuerst das Herz mit dem Aortenblock verbinden.

Nähern Sie sich dem Konnektor in einem schrägen Winkel und lassen Sie Perfuse 8 vorsichtig aus dem Konnektor in die Kanüle tropfen, während sie befestigt ist. Dadurch wird verhindert, dass Luft in die Aorta eindringt, und so eine Koronarembolie verhindert, während das Herz unter konstantem Druck durchblutet wird. L endorf Modus.

Entfernen Sie das Fett und das Bindegewebe und lokalisieren Sie die folgenden Gefäße. Vena cva inferior und superior, Vena aose, Lungenarterie und Lungenvenen. Als nächstes ligatisieren Sie die obere Vena cva.

Schneiden Sie die Lungenarterie direkt unter der Stelle, an der sie sich in die rechte und linke Lungenarterie verzweigt. Die restlichen Gefäße sind die Lungenvenen. Gruppieren Sie sie zwischen Herz und Lunge und ligieren Sie sie alle mit einer Naht.

Dies ist aus zwei Gründen von entscheidender Bedeutung. Zunächst wird durch das Abbinden der mit der Lunge verbundenen Gefäße sichergestellt, dass nach Abschluss der Kanülierung kein Leck mehr auftritt. Und zweitens ist es wichtig, beide VNA-Cavas für die spätere Kanülierung zu isolieren.

Entferne nun die Lunge. Schneiden Sie ein Loch geeigneter Größe in die Ecke des linken Vorhofohrs und stellen Sie sicher, dass es mit reichlich acht gefüllt ist. Als nächstes kanülieren Sie das Anhängsel, während die Kanüle vollständig mit Perfunde acht gefüllt ist.

Während Sie dann das Gewebe festhalten, nähen Sie die Kanüle mit dem Anhang. Das Gewebe des linken Vorhofohrs ist extrem empfindlich und kann leicht reißen. Daher ist es wichtig, den linken Vorhof beim ersten Versuch zu kanülieren, sonst ist es möglicherweise nicht möglich.

Schalten Sie die Pumpe Nummer zwei ein, um den linken Vorhof zu leiten. Stellen Sie die Vorspannung während des gesamten Experiments zwischen zwei und sechs Tor ein. Möglicherweise muss der Druck angepasst werden.

Halten Sie es innerhalb von zwei Millimetern um den Zieldruck. Schalten Sie nun das Herz in den funktionierenden Herzmodus, indem Sie die Pumpe Nummer eins, die Langorpumpe, für einen Moment ausschalten. Verringern Sie den Aortendruck auf tendenziell tor und erhöhen Sie ihn dann langsam auf den Bereich von 80 bis 100 tor.

Dadurch kann sich die Aortenklappe öffnen und so funktionieren, wie sie es unter normalen physiologischen Bedingungen tun würde. Legen Sie den endgültigen Nachlastdruck auf einen Wert von ca. 20 fest. Riss weniger als den Spitzen-LV-Druck mit einer Kanüle, die direkt am System befestigt ist.

Kanülieren Sie den rechten Vorhof durch die Vena CVA inferior und nähen Sie die Kanüle mit der Vene. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen. Schalten Sie die Pumpe Nummer drei ein, die Pumpe auf der rechten Seite, um den Durchfluss in den rechten Vorhof zu gewährleisten.

Stellen Sie den Druck auf etwa drei Tor ein. Zum Schluss wird der rechte Ventrikel ohne Lufteintritt kanüliert und die Kanüle mit der Lungenarterie vernäht. Damit ist die biventrikuläre Kanülierung abgeschlossen.

Fahren Sie nun mit der Signalerfassung fort. Führen Sie den Druckaufnehmerkatheter vorsichtig über die Aortenkanüle in die Aorta ein. Navigieren Sie es vorsichtig an der Aortenklappe vorbei und in die LV.

Das LV-Drucksignal erscheint wie erwartet, wenn die Katheterspitze richtig positioniert ist. Drücken Sie anschließend die monophasische Wirkungspotentialelektrode vorsichtig gegen das ventrikuläre Epikard. Ein leichtes Bewegungsartefakt im Elektrodensignal ist normal.

Platzieren Sie als nächstes eine bipolare Stimuluselektrode auf dem rechten Vorhof, um das Herz entsprechend der experimentellen Designposition zu beschleunigen. Und fokussieren Sie die CCD-Kamera auf die interessierende Region des Herzens. An der Kamera sollte ein Emissionsfilter angebracht sein.

Um die NADH-Fluoreszenz zu passieren, schalten Sie das Umgebungslicht aus, um das Epikard gleichmäßig mit einer UV-Lichtquelle an der Arbeitsstation zu beleuchten, an der die Kamera angebracht ist. So stellen Sie die Software so ein, dass Bilder mit zwei Bildern pro Sekunde aufgenommen werden. Wählen Sie dann den Live-Update-Modus, um die mittlere Pixelintensität innerhalb des interessierenden Bereichs zu überwachen.

Wenn die Profusion ausreichend war, sollten die NADH-Spiegel, die durch die Fluoreszenz dargestellt werden, niedrig und stabil über der Epikardoberfläche sein. Führen Sie nun das Experiment aus, wenn es abgeschlossen ist. Entferne das Herz.

Entleeren Sie die PERFUSE acht sowie die Schläuche und Kammern des Systems mit gereinigtem Wasser. Spülen Sie das System regelmäßig mit Mucosal TM Lösung oder einer verdünnten Wasserstoffperoxidlösung unter Verwendung des beschriebenen Protokolls. Die Herzen wurden mit Zykluslängen zwischen 200 und 400 Schlägen pro Minute geklebt.

Die diastolische LVP lag in der Regel zwischen null und 10 tor, der minimale diastolische Aortendruck betrug etwa 60 Tor, der maximale systolische LVP ist abhängig vom Fülldruck und der Kontraktilität und sollte optimalerweise zwischen 60 und 80 liegen. Der maximale Aortendruck und die maximale LVP sollten eng mit der monophasischen Wirkung übereinstimmen. Die für das Herz eines Kaninchens typischen Potentiale haben eine schnelle Depolarisationsphase und eine charakteristische Repolarisationsphase. Aktionspotentiale ließen sich leicht aus den Präparaten erfassen, wiesen aber in der Regel ein kleines Bewegungsartefakt während der Diastole auf.

Durchschnittliche fluoreszierende NADH-Werte aus einer Region von Interesse in der roten Box wurden gemessen, um Veränderungen des mitochondrialen Redoxzustands während drei Stimulationszyklen bei Psycholängen von 300, 200 und 150 Millisekunden zu überwachen, wenn die Stimulationsrate nahe dem Sinusrhythmus lag. Der Ausgangswert des NADH-Spiegels war relativ konstant, da die Zykluslänge verkürzt wurde. Unterhalb von 300 Millisekunden stiegen die NADH-Spiegel an, wobei der größte Anstieg bei 150 Millisekunden zu verzeichnen war, das Signal oszilliert mit der Kontraktion und die Schwingungsfrequenz entspricht der Herzfrequenz.

Die Amplitude dieser Oszillationen war immer geringer als bei längeren Zeitskalentrends, die durch Ischämie oder Hypoxie verursacht wurden. Die hochauflösende Fluoreszenz-NADH-Bildgebung der gesamten Frontzahnoberfläche bei 200 Schlägen pro Minute war konstant und bei 400 Schlägen pro Minute räumlich homogen. Die NADH-Spiegel stiegen im gesamten Epikard erheblich an.

Es wurde eine signifikante räumliche Heterogenität beobachtet, wobei die größten Erhöhungen in den septalen Regionen des RV und LV nach der Beherrschung auftraten. Diese Technik kann in weniger als 45 Minuten durchgeführt werden, wenn sie korrekt ausgeführt wird. Wenn Sie versuchen, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, daran zu denken, dass keine Luftblasen in die Aorta oder den linken Vorhof gelangen.

Zusätzliche Methoden, wie das Beladen des Herzens mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff, können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Verknüpfung der elektrischen und metabolischen Aktivität auf der Oberfläche des Herzens in pathologischen Szenarien wie der lokalen Ischämie nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern in der Herzphysiologie den Weg, um den Herzstoffwechsel und Leitungsstörungen bei pathologischen Zuständen mit einem physiologisch relevanteren Modell zu untersuchen.