Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Diese Standardtechnik erzeugt fluoreszenzmarkierte, mit Gelatine beschichtete Deckgläser, die für quantitative Assays zur Bestimmung der invadierten Podomatrix-Degradation geeignet sind. Nachdem die Deckgläser mit fluoreszenzmarkierter Gelatine beschichtet wurden, die Zellen ansäen und zur Matrixdegradation kultivieren. Anschließend fixieren und mit fluoreszierenden Farbstoffen die Zellen für Inve-Podium-Markerproteine anfärben, die Bilder aufnehmen und die Matrixdegradation quantifizieren.

Typische Ergebnisse können die Unterschiede bei der Podien-vermittelten Matrixdegradation zwischen Zellen mit unterschiedlicher Manipulation ausgewählter Gene oder Behandlung mit pharmakologischen Substanzen quantifizieren. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Herstellung von mit Gelatine beschichteten Deckgläsern mit homogener Fluoreszenz aufgrund ungleichmäßiger Beschichtung mit fluoreszierender Gelatine oder unsachgemäßer Handhabung der gelatinebeschichteten Deckgläser schwierig ist. Die Durchführung der Methode wird von der wissenschaftlichen Assistentin Professorin Karen Martin, der Postdoktorandin Mandy Ammer sowie den Doktoranden Elise Walk, Karen Hayes und Steve Markwell demonstriert.

Zur Herstellung der unmarkierten 5 %igen Gelatine-Saccharose-Standardlösung werden Gelatine und Saccharose in PBS gemischt und bei 37 Grad Celsius vollständig gelöst. Anschließend bei vier Grad Celsius lagern. Danach fortfahren mit der Reinigung der Glasdecken.

Verteilen Sie eine einzelne Deckglas auf jede Vertiefung einer 24-Loch-Kunststoffkulturplatte und geben Sie jeweils 500 µL 20 %iger Salpetersäure hinzu. Inkubieren Sie 30 Minuten lang. Nach dem Entfernen der Salpetersäurelösung waschen Sie die Deckgläser dreimal mit entionisiertem Wasser. Danach beschichten.

Jede Deckglas mit 500 Mikrolitern einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Polylysin-Lösung versehen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Polylysin-Lösung entfernen und dreimal mit PBS waschen. Die Poly-L-Lysin-Beschichtung ermöglicht eine gleichmäßige Beschichtung und Bindung des darüberliegenden markierten Gelatins. Die 24-Loch-Platten auf Eis stellen und jeweils 500 Mikroliter frisch zubereitete 0,5 %ige Glutaraldehyd-Lösung hinzufügen.

Die Platten 15 Minuten lang gut auf Eis inkubieren. Drei Waschungen mit kaltem PBS durchführen und anschließend alle Reste von PBS abziehen, bevor die Gelatine-Beschichtung erfolgt. In der Zwischenzeit, während der Inkubation mit Glutaraldehyd, das mit Oregon Green 488 konjugierte Gelatin rekonstituieren.

Erwärmen Sie gemäß dem Herstellerprotokoll das markierte Gelatin sowie die unmarkierte 5 %ige Gelatin-Sucrose-Grundlösung auf 37 Grad Celsius. Verdünnen Sie anschließend 500 Mikroliter markiertes Gelatin in vier Milliliter unmarkiertem Gelatin. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der verdünnten 488-Gelatin-Mischung auf jedes Deckglas.

Verwendung einer ausreichenden Menge Gelatine, um den Deckglaser ohne manuelles Verteilen zu beschichten. Es ist wichtig, die verdünnte Gelatine-Mischung mit 4 88 während des Beschichtungsvorgangs bei 37 Grad zu halten, um eine vorzeitige Verfestigung zu verhindern. Ab diesem Schritt sollten die Deckgläser außerdem so viel wie möglich im Dunkeln aufbewahrt werden, um eine mögliche Photobleiche zu vermeiden.

Wenn alle Deckgläser in einer Platte beschichtet sind, halten Sie die Platte schräg und entfernen Sie das überschüssige Gelatin aus jedem Well durch Vakuum-Aspiration. Anschließend inkubieren Sie die beschichteten Deckgläser 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nachdem Sie die Deckgläser dreimal mit PBS gewaschen haben, geben Sie 500 Mikroliter Natriumborhydrid, Natriumborhydrid hinzu.

Hydrid ist sprudelnd, und kleine Bläschen werden auf und um jeden Deckel sichtbar sein. Inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur, um verbleibendes Glutaraldehyd zu reduzieren und zu inaktivieren. Entfernen Sie die Natriumborhydrid-Lösung durch Vakuumabsaugung mit einer schnellen, kreisförmigen Bewegung entlang des Außenrands jedes Wells. Achten Sie darauf, keine schwimmenden Deckel aufzusaugen, die sich während der Natriumborhydrid-Behandlung vom Boden der Zellkulturplatte gelöst haben. Nach drei Spülgängen mit PBS inkubieren Sie die Deckel 30 Minuten bei Raumtemperatur in 70 % Ethanol.

Unter sterilen Bedingungen die Deckgläser mit den Platten in eine Klasse-II-A-B-Zellkulturlaminarströmungskammer überführen und die Deckgläser dreimal mit steriler PBS mithilfe einer sterilen Nadel und Pinzette spülen. Die Deckgläser vorsichtig in eine leere Vertiefung einer neuen 24-Loch-Platte überführen, um sie mit dem Kulturmedium für den spezifischen Zelltyp, der verwendet wird, zu äquilibrieren.

Seeden Sie die Zellen nach einer geeigneten Inkubationszeit nun direkt auf die Deckgläser. Verarbeiten Sie die Proben für die Immunfluoreszenz-Bildgebung, um die Proben zu montieren. Geben Sie einen Tropfen ProLong Gold Anti-Fade oder ein ähnliches Reagenz auf einen Objektträger und positionieren Sie vorsichtig das invertierte Deckglas darauf, anschließend Bilder zur Analyse aufnehmen.

Diese Analyse liefert die normalisierte Fläche der Matrixdegradation relativ zur Fläche der Zellen oder zur Anzahl der Zellen. Sie ist nützlich zur Analyse gesamter mikroskopischer Gesichtsfelder, in denen mehrere Zellen vorhanden sind, die gemeinsam mit irna-Wachstumsfaktoren oder therapeutischen Wirkstoffen behandelt wurden. Für diese Analyse werden Bilder mit niedrigerer Vergrößerung aufgenommen, die ausreicht, um effizient Informationen über Zellpopulationen zu sammeln.

Öffnen Sie das Bild in ImageJ. Überprüfen Sie die Skaleninformationen und wählen Sie die Messungen aus. Wählen Sie die Fläche aus und begrenzen Sie die Schwellenwertoptionen. Berechnen Sie die Abbaufläche anhand des fluoreszierenden Gelatinebildes, indem Sie den Hintergrundschwellenwert korrigieren, um eine ungleichmäßige Beleuchtung über die Gelatine hinweg auszugleichen, und stellen Sie die oberen und unteren Pixelintensitätswerte des Bildes ein.

In nachfolgenden Bildern. Verwenden Sie die Schaltfläche „Einstellen“ im Schwellenwertfenster, um für alle Bilder denselben Schwellenwert als objektives Kriterium zur Auswahl des Abbaubereichs festzulegen. Nutzen Sie die Funktion „Partikel analysieren“, um den Schwellenwert in den Bereichen des Matrixabbaus zu messen.

Wählen Sie eine Partikelgröße größer als null, um Rauschen aus der Auswahl zu entfernen. Zeigen Sie Umrisse an, um interessierende Bereiche zu identifizieren. Aktivieren Sie anschließend „Ergebnisse anzeigen“ und „Zusammenfassen“, um Messungen anzuzeigen, falls alle Abbauareale spezifisch umrissen wurden.

Kopieren Sie die Gesamtflächenmessung in eine Tabellenkalkulation; wurden andere Objekte ausgewählt, beispielsweise Schmutzpartikel, notieren Sie nur die Flächen der relevanten Interessenbereiche. Öffnen Sie als Nächstes die Foid- und die gefärbte Bildschwelle des Bildes, um die oberen und unteren Pixelintensitätswerte festzulegen, sodass die Zellränder in nachfolgenden Bildern ausgewählt werden. Verwenden Sie die Schaltfläche „Setzen“ im Schwellwertfenster, um denselben Schwellwert für alle Bilder festzulegen.

Als objektive Methode zur Auswahl des Zellbereichs verwenden Sie die Funktion „Partikel analysieren“, um den Schwellenwert für die Fläche der Zellen zu bestimmen. Wählen Sie eine Partikelgröße größer als null, um Rauschen aus der Auswahl zu entfernen.

Umrisse anzeigen, um Bereiche für die Analyse zu identifizieren, Anzeigeergebnisse prüfen und zusammenfassen, um Flächenmessungen anzuzeigen. Nicht aktivieren. Löcher einbeziehen, wenn Zwischenräume zwischen Zellen und einem Verbund vorhanden sind.

Wählen Sie nun. Kopieren Sie die Flächenergebnisse für die relevanten interessierenden Bereiche in eine Tabellenkalkulation und berechnen Sie die Fläche der Gelatinedegradation pro Gesamtzellfläche. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die Degradationsfläche anhand der Zellanzahl zu normalisieren, die durch Zählen der DAP e-gefärbten Kerne bestimmt wird.

Dies ist wichtig, wenn Manipulationen die durchschnittliche Zellfläche verändern. Verwenden Sie für diesen Ansatz das Kernzähler-Plugin, um Kerne automatisch zu zählen. Passen Sie die Optionen an, um sie an Ihre Bilder anzupassen. Wenn sich Kerne stark überlappen, liefert das automatische Zählen unter Umständen keine genaue Aufzählung. In diesem Fall.

Die manuelle Zählung kann mithilfe des Zellzähler-Plugins erleichtert werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Deckgläser werden gleichmäßig mit Oregon Green 488-konjugiertem Gelatin beschichtet. Während der Beschichtung und Verarbeitung von gelatinbeschichteten Deckgläsern können mehrere Artefakte auftreten.

Beispielsweise resultiert eine ungleichmäßige Beschichtung aus einer unsachgemäßen Abdeckung des Deckgläschens während des Beschichtungsprozesses aufgrund mangelhafter Durchmischung, manuellem Verteilen oder teilweiser Erstarrung der Gelatinemischung. Kratzer deuten auf eine Entfernung der beschichteten Matrix durch Ritzen mit Nadeln oder Pinzetten während der Handhabung hin. Eine Austrocknung der Oberfläche des Deckgläschens während längerer Lagerungszeiträume kann zu einem gepflasterten Erscheinungsbild führen. Dieser Bereich spiegelt eine Photobleiche der fluoreszierenden Gelatinoberfläche während der Bildaufnahme aufgrund verlängerter oder intensiver Lichtexposition wider.

Beachten Sie, wie ein gut präparierter Deckelobjektträger eine homogene Fluoreszenz zeigt, wenn er mittels Mikroskopie visualisiert wird. Die dabei entstehenden dünnen Matrizen bieten eine empfindliche Methode, um die Fähigkeit von Zellen zum Abbau der ECM zu bewerten. Zum Beispiel.

Diese Bilder zeigen die Invasions- und Podium-Matrixdegradationsaktivität einer OSC-19-Kopf- und Halskrebszelle. Hier wurden Zellen auf einer mit Oregon Green 488 konjugierten Gelatine-Coverslip kultiviert und mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, wie in 2D- und 3D-Bildern dargestellt. Diese OSC-19-Zellen, die auf mit Oregon Green 488 konjugierten Gelatine-Coverslips kultiviert wurden, wurden mit R-Domäne-konjugiertem Phalloidin und Anti-Cortactin-Antikörpern markiert, die mit dem sekundären Antikörper ANOR 647 nachgewiesen und grün pseudofärbig dargestellt wurden.

Podien sind im überlagerten Bild als fokale zytoplasmatische Anreicherungen von F-Aktin und Cortactin erkennbar, die sich mit Bereichen des Gelatinaushöhlungsvolumens überschneiden. Die Visualisierung zeigt, wie die eingedrungenen Podien in das ECMA-Teilvolumen eindringen, das erstellt wurde, um eine Kante innerhalb der Zelle darzustellen, an der inve-Podien vorhanden sind. Die dorsale Kantenansicht demonstriert inve-Podien, die in die darunterliegende Gelatinschicht eingefügt sind.

Die Ansicht der ventralen Kante zeigt Vorstülpungen in Veda-Podien und Bereiche der Gelatinedegradation unter der Deckglasauflage als rote Regionen auf der grünen Matrix. Diese Bilder zeigen einige der wichtigen Schritte zur Quantifizierung der normalisierten Gelatinedegradation von Zellen innerhalb eines gesamten mikroskopischen Bildes. Alle Fluoreszenzbilder wurden zur besseren Darstellung der roten Schwellenwertbestimmung und der Markierungen des Interessenbereichs in Graustufen umgewandelt.

Dieses Bild von Oregon Green 488-konjugiertem Gelatin zeigt die dunklen Bereiche, in denen ein Abbau stattgefunden hat. Durch Schwellenwertanalyse wird im Gelatinbild der Abbau hervorgehoben, und ausgewählte Regionen von Interesse werden hinsichtlich ihres Abbaubereichs vermessen. Dieses Bild zeigt Ruminen, Foid und F-Aktin-Färbung, wie erwartet.

Die Schwelle in der Aktin-Bildaufnahme markiert die gesamte Zellfläche, aus der die zu messenden Zellbereiche ausgewählt werden. Ebenso kann die Technik zur Untersuchung von Bildern von mit DAPI gefärbten Zellkernen angewandt werden. Dieses Panel zeigt ausgewählte Schritte zur Quantifizierung des fluoreszenten Gelatine-Abbaus durch einzelne Zellen innerhalb einer gemischten zellulären Population.

Diese einfache Quantifizierung bezieht sich auf eine einzelne transfizierte OSC-19-Zelle, die überexprimiertes rekombinantes Cortactin, das an den Flag-Epitop-Tag fusioniert ist, exprimiert. Beachten Sie, wie die Matrixdegradation durch transfizierte Zellen auch innerhalb einer gemischten Population aus transfizierten und nicht transfizierten Zellen analysiert werden kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mehrere Dinge zu beachten.

Zunächst sollte sichergestellt werden, dass Ihre fluoreszierenden Zellmarker nicht mit der Farbe des fluoreszierenden Gelatins überlappen. Bei der Bildaufnahme ist es wichtig, Aufnahmefelder basierend auf dem Vorhandensein von Zellen auszuwählen. Vermeiden Sie eine gezielte Suche nach Bereichen mit Degradation, da dies die Daten aufgrund der Variabilität zwischen Zelllinien und deren Reaktionen auf verschiedene therapeutische Wirkstoffe verzerren könnte.

Faktoren wie die Abbaudauer der Sitzplatznummer und die Auswahl des Proteins für die immunfluoreszenzmarkierte Färbung sollten für Ihr spezielles Experiment optimiert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Deckgläser herstellt, die gleichmäßig mit fluoreszierendem Gelatin aus beta-Podia-vermittelten Abbaunachweisen beschichtet sind, sowie Methoden zur Quantifizierung des Matrixabbaus.