Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine robuste Präparationsmethode für biologisch relevante Lipidvesikel vorzustellen. Dies wird erreicht, indem Phospholipide gemischt und in Glasfläschchen überführt und mit wässrigem Puffer hydratisiert werden, um eine SLE-Suspension mit mehreren Lamellen zu erzeugen. In einem zweiten Schritt wird ein Einfrier- und Auftauverfahren durchgeführt, das anschließend zur Herstellung von Ella Vesikeln aus Mehrlamellenvesikeln führt.

Als nächstes wird die Liposomensuspension unter Verwendung des ermittelten optimalen Drucks durch einen Extruder geführt, um homogene Lipidvesikel einer gewünschten Größe herzustellen. Es wurden Ergebnisse erzielt, die konsistente Vesikelgrößen im Submikrometerbereich zeigen, die auf dynamischer Lichtstreuung und Nanopartikel-Tracking-Analyse basieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Ultraschall und Sedimentation besteht darin, dass diese Methode ein Druckkontrollsystem mit optimal bestimmten Stickstoffflussraten für eine effiziente Vorbereitung der Lipidvesikelgröße verwendet.

Um diesen Vorgang zu beginnen, nehmen Sie ein 20-Milliliter-Glasfläschchen mit einer mit Teflon ausgekleideten Kappe und reinigen Sie alle Glaswaren und Spritzen vor der Verwendung mit Chloroform, um eine Kontamination zu vermeiden. Übertragen Sie 100 Mikroliter Chloroform in Reagenzqualität mit einer luftdichten 250-Mikroliter-Glasspritze in das Glasfläschchen. Geben Sie 30 Mikroliter Methanol in Reagenzqualität mit einer luftdichten 100-Mikroliter-Glasspritze in dasselbe Glasfläschchen.

Bereiten Sie eine zwei Millimolare Pop C Mohn-Cholesterin-Lipidlösung vor, indem Sie 216 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter Pop C und 42 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter übertragen. Pop e und 20 Mikroliter von 11 Milligramm pro Milliliter. Cholesterinlösungen in das 20-Milliliter-Glasfläschchen verdampfen die organischen Lösungsmittel mit langsam fließendem Argon oder Stickstoffgas, bis ein dünner Lipidfilm auf dem Boden des Fläschchens beobachtet wird. Legen Sie das unverschlossene Glasfläschchen mindestens 30 Minuten lang in ein Vakuumtrocken

Um Lösungsmittelreste zu entfernen, geben Sie zwei Milliliter Puffer, der zuvor durch einen 0,2-Mikron-Filter geleitet wurde, in das Glasfläschchen, um die Lipide zu hydratisieren. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius und verwenden Sie sie innerhalb von 48 Stunden für Liposomengrößen von 30 bis 100 Nanometern. Befreien Sie die Liposomensuspension 15 Sekunden lang von flüssigem Stickstoff.

Tauen Sie dann die Liposomensuspension mit einem Heizblock bei 42 Grad SIUs etwa drei Minuten lang auf. Wiederholen Sie den Auftauvorgang für insgesamt fünf Zyklen. Durch das Einfrieren und anschließende Auftauen wird Ella Les aus Multilamellen-Vesikeln hergestellt und die Effizienz der Lipideinfangung während der Extrusion verbessert.

Bereiten Sie sich anschließend auf die Extrusion vor, indem Sie die Anweisungen von Avastin befolgen, um die Lipo so schnell wie möglich sorgfältig zusammenzubauen. Die korrekte Montage des LF 50 Extruders ist entscheidend, um Stickstoffleckagen zu verhindern, die die gewünschten Durchflussraten beeinträchtigen. Um den Erfolg sicherzustellen, führen Sie die folgenden Schritte sorgfältig aus.

Um einen luftdichten Verschluss herzustellen. Platzieren Sie das Stützsieb mit großem Loch in der Stützfilterbasis, gefolgt von der kreisförmigen Mittelschale, einer Ablaufscheibe und einer Polycarbonatmembran. Setzen Sie den kleinen schwarzen O-Ring auf die Membran und befestigen Sie ihn an der Stützfilterbasis.

Befestigen Sie den oberen Filterextruder, indem Sie vier Schrauben in den vier entsprechenden Löchern festziehen. Montieren Sie die Filterextrudereinheit unter dem großen Extruderzylinder. Geben Sie die Liposomenlösung in den Zylinderzylinder auf dem Extrusionszylinder.

Setzen Sie einen großen runden O-Ring, eine schmale Kappe, einen großen kreisförmigen O-Ring und eine kreisförmige Kappe ein. Befestigen Sie den Gasregler an der Oberseite des Extruderzylinders und schließen Sie alle Ventile, um ein Austreten von Luft zu verhindern, einschließlich des Überdruckventils. Stellen Sie ein 20-Milliliter-Glasfläschchen oder einen 50-Milliliter-Erlenmeyerkolben unter die Extruderfiltereinheit.

Ein Sicherheitsventil ist mit dem Regler verbunden und löst sich, wenn der Druck 600 PS überschreitet. Ich schalte das Stickstoffgas ein und öffne das Gasventil, das mit dem Extruder verbunden ist. Erhöhen Sie den Stickstoffdruck auf 25 PSI für 400-Nanometer-Liposomen, auf 125 PSI für 100-Nanometer-Liposomen und auf 400 bis 500 PSI für 30-Nanometer-Liposomen. Beobachten Sie die Liposomensuspension, bis sie in den Behälter ausgestoßen wird, während sie vom Stickstoff gedrückt wird.

Lassen Sie den Stickstoff fließen, bis keine Flüssigkeit mehr zu sehen ist. Passieren des Extruderfilters in die Glasdatei, um eine DLS-Analyse durchzuführen. Bereiten Sie zunächst 50 Mikroliter einer 20-mikromolaren Liposomenlösung vor, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS verdünnt ist.

Schalten Sie dann die Stromquelle und die Lampenquelle ein. Fahren Sie mit dem Öffnen der dynapro-Software fort. Stellen Sie die Software auf das Algorithmusmodell ein, um Liposomen in der gewünschten Größe zu erkennen.

Nachdem Sie 14 Mikroliter Liposomenprobe an die Hardware-Pipette angeschlossen und in den Quarzhalter eingeführt haben, drücken Sie nach ca. 20 bis 30 Aufnahmen auf Start, drücken Sie Stopp. Analysieren Sie die durchschnittlichen Liposomendurchmesserpeaks, die im Histogramm aufgezeichnet sind. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse beginnt mit der Herstellung einer 500 Mikroliter 0,1 mikromolaren Liposomenlösung, die in PBS solubilisiert ist, spülen Sie den Probenraum mit Wasser und Ethanol.

Trocknen Sie dann das Probenfach mit einem fusselfreien Papiertuch ab. Schalten Sie die Laserstromquelle ein und der Computer liefert 300 Mikroliter 0,1 molare Liposomenlösung in den Probenraum. Öffnen Sie die Temperaturregelung und die Analysesoftware zur Nanopartikelverfolgung.

Drücken Sie die Aufnahmetaste, um den Laser einzuschalten. Verwenden Sie die horizontalen und vertikalen Einstellungen, um den Tisch zu bewegen und den Fokus des Mikroskops einzustellen. Stellen Sie die gewünschte Temperatur und Aufnahmezeit ein.

Drücken Sie die Aufnahmetaste, um mehrere Bilderbilder der Liposomenpartikel für eine bestimmte Zeit aufzunehmen. Analysieren Sie die Peaks, die dem Durchmesser der Liposomengrößen im Histogramm entsprechen, während es die Bewegung jedes Partikels verfolgt. DLS ist eine etablierte Methode, die Streulicht zur Bestimmung des Partikeldurchmessers sammelt und zur Bestimmung der Liposomengrößen durchgeführt wurde.

Hydratisierte Liposomen wurden durch Polycarbonatmembranen in verschiedenen Größen und Drücken extrudiert, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Die Durchmesser der mit DLS gemessenen Liposomen für eine Porengröße von 30 Nanometern betrugen 66 plus oder minus 28 Nanometer. Für 100 Nanometer betrug die Porengröße 138 plus oder minus 80 Nanometer und für 400 Nanometer betrug die Porengröße 360 plus oder minus 25 Nanometer.

Als Kalibriernormal wurde eine Suspension aus 50 Nanometern polierten Irene-Kügelchen verwendet, die einen Durchmesser von 47 plus oder minus 16 Nanometern aufzeichnete. Die prozentuale Polydispersität zeigt, dass es keine Überlappung innerhalb der Liposomengrößen gibt. Es ist typisch, bei der DLS-Analyse Durchmesser von mehr als 30 Nanometern zu beobachten, da dieses Instrument bekanntermaßen zu größeren Partikeln neigt.

Trotz dieser instrumentellen Einschränkung beschreibt die Kalibrierkurve eine alineare Korrelation. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse ist eine neue Technologie, die die Größe jedes Partikels aus direkten Beobachtungen der Diffusion in einem flüssigen Medium unabhängig vom Brechungsindex oder der Partikeldichte misst. Diese hochauflösende Technik kann zur Ergänzung der Messung von Liposomen mit DLS verwendet werden, die NTA erfasste Durchmesser von 95 plus oder minus 48 Nanometern und 356 plus oder minus 51 Nanometer für zwei 100 Nanometer und 400 Nanometer Polystyrollösungen wurden zur Kalibrierung verwendet.

Lipidlösungen haben einen vergleichbareren Durchmesser im Vergleich zu DLS und erzeugen durchschnittliche Größen von 29 plus oder minus 14 Nanometern für 30 Nanometer Porengröße, 95 plus oder minus 17 Nanometer für 100 Nanometer Porengröße und 359 plus oder minus 73 Nanometer für 400 Nanometer Porengröße. NTA könnte eine allgemeinere Charakterisierungstechnik zur Quantifizierung mikroskopischer Partikel sein, da ihre Empfindlichkeit die Messung von Partikeln von 50 bis 1000 Nanometern ermöglicht. Die Kalibrierkurve zeigt eine lineare Korrelation zwischen der Pause der Polycarbonatmembran und der aufgezeichneten negativen Färbungstransmission des NTA-Durchmessers. Elektronenmikroskopische Bilder zeigen jede Liposomengröße nach den Extrusionsgrößen 3, 100 und 400 Nanometer, die sich deutlich voneinander unterscheiden.

Die Vergrößerung wurde auf das 25.000-fache eingestellt, wobei der Maßstabsbalken 0,5 Mikrometer darstellt. Es wurde ein Zeitverlaufsexperiment mit drei Liposomengrößen durchgeführt. Die DLS wurde für jede Liposomenlösung unmittelbar nach der Extrusion gemessen.

Alle Liposomenlösungen wurden über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert. Ihre Durchmesser wurden nach einer Inkubation über Nacht erneut von DLS erfasst. Nach einer 60-stündigen Inkubationszeit wurde wenig bis gar keine Veränderung beobachtet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass mehrere Durchgänge durch den Extrusionsfilter die Homogenität der Vesco-Lösung verbessern.

Denken Sie auch daran, Glasfläschchen und Spritzen für die Probenvorbereitung zu verwenden, um eine Kontamination durch Auslaugung durch Polypropylenröhrchen aus Chloroform zu vermeiden.