Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine robuste Herstellungsmethode für biologisch relevante Lipidvesikel vorzustellen. Dies wird erreicht, indem Phospholipide gemischt und in Glasgefäße überführt werden und anschließend mit wässrigem Puffer hydratisiert werden, um eine mehrschichtige SLE-Suspension herzustellen. Als zweiter Schritt wird eine Gefrier-Tau-Methode durchgeführt, die anschließend zur Bildung von Ella-Vesikeln aus mehrschichtigen Vesikeln führt.

Anschließend wird die Liposom-Suspension unter Verwendung des ermittelten optimalen Drucks durch einen Extruder geleitet, um homogene Lipidvesikel einer gewünschten Größe herzustellen. Es wurden Ergebnisse erzielt, die aufgrund der dynamischen Lichtstreuung und der Nanopartikel-Tracking-Analyse konsistente submikronale Vesikelgrößen zeigen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber etablierten Methoden wie der Beschallung und der Zentrifugation besteht darin, dass es ein Druckregelungssystem mit optimal ermittelten Stickstoffströmungsraten zur effizienten Herstellung von Lipidvesikeln definierter Größe verwendet.

Um dieses Verfahren zu beginnen, nehmen Sie ein 20-Milliliter-Glasfläschchen mit Teflon-verschlossenem Deckel; reinigen Sie sämtliches Glaswerk und alle Spritzen vor der Verwendung mit Chloroform, um Kontaminationen zu vermeiden. Überführen Sie 100 Mikroliter chloroformreiner Qualität mithilfe einer 250-Mikroliter-Dichthaltigen-Glasspritze in das Glasfläschchen. Fügen Sie anschließend 30 Mikroliter methanolreiner Qualität mit einer 100-Mikroliter-Dichthaltigen-Glasspritze demselben Glasfläschchen hinzu.

Stellen Sie eine zwei Millimolar starke Pop-C-Mohn-Cholesterin-Lipidlösung her, indem Sie 216 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter enthaltenden Pop-C-Lösung, 42 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter enthaltenden Lösung und 20 Mikroliter einer 11 Milligramm pro Milliliter enthaltenden Cholesterinlösung in ein 20-Milliliter-Glasfläschchen überführen. Verdampfen Sie die organischen Lösungsmittel unter Verwendung eines langsamen Argon- oder Stickstoffgasstroms, bis ein dünner Lipidfilm auf dem Boden des Fläschchens sichtbar ist. Stellen Sie das ungekapselte Glasfläschchen für mindestens 30 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator.

Um das restliche Lösungsmittel zu entfernen, überführen Sie zwei Milliliter Puffer, der zuvor durch einen 0,2-Mikron-Filter geleitet wurde, in das Glasfläschchen, um die Lipide zu hydratisieren. Inkubieren Sie das Gemisch über Nacht bei vier Grad Celsius und verwenden Sie es innerhalb von 48 Stunden für Liposomen mit Größen von 30 bis 100 Nanometern. Schocken Sie die Liposomen-Suspension 15 Sekunden lang in flüssigem Stickstoff.

Anschließend die Liposomensuspension etwa drei Minuten lang in einem Heizblock bei 42 Grad SIUs auftauen. Wiederholen Sie den Einfrier- und Auftauvorgang insgesamt fünf Zyklen lang. Das Einfrieren und anschließende Auftauen erzeugt Ella Les aus multilamellären Vesikeln und verbessert die Effizienz der Lipidabschließung während der Extrusion.

Bereiten Sie anschließend die Extrusion vor, indem Sie den Anweisungen für Avastin sorgfältig folgen, um die Liposomen so schnell wie möglich herzustellen. Eine korrekte Montage des LF 50-Extruders ist entscheidend, um Stickstoffleckagen zu verhindern, die die gewünschten Durchflussraten beeinträchtigen. Führen Sie die folgenden Schritte sorgfältig aus, um den Erfolg sicherzustellen.

Um eine luftdichte Abdichtung zu erzielen, platzieren Sie den großen Lochträger mit dem Sieb in die Filterbodeneinheit, gefolgt von der runden Mittelschale, einer Drainagescheibe und einer Polycarbonatmembran. Setzen Sie den kleinen schwarzen O-Ring auf die Membran und befestigen Sie ihn an der Filterbodeneinheit.

Befestigen Sie den oberen Filterextruder, indem Sie vier Schrauben in die entsprechenden vier Löcher eindrehen. Bauen Sie die Filterextrudereinheit unterhalb des großen Extruderzylinders zusammen. Geben Sie die Liposomenlösung in den Zylinderraum auf dem Extrusionszylinder hinzu.

Platzieren Sie einen großen runden O-Ring, eine schmale Kappe, einen weiteren großen runden O-Ring und eine runde Kappe. Befestigen Sie den Gasregler an der Oberseite des Extrudermantels und schließen Sie alle Ventile, um Luftleckagen zu verhindern, einschließlich des Überdruckventils. Stellen Sie ein 20-Milliliter-Glasfläschchen oder einen 50-Milliliter-Erlenmeyerkolben unter die Filtereinheit des Extruders.

Ein Sicherheitsventil ist mit dem Regler verbunden und öffnet sich, wenn der Druck 600 PSI überschreitet. Schalten Sie das Stickstoffgas ein und öffnen Sie das Ventil, das mit dem Extruder verbunden ist. Erhöhen Sie den Stickstoffdruck auf 25 PSI für 400 Nanometer große Liposomen, auf 125 PSI für 100 Nanometer große Liposomen und auf 400 bis 500 PSI für 30 Nanometer große Liposomen. Beobachten Sie die Liposomensuspension, bis sie durch den Stickstoff in den Behälter ausgestoßen wird.

Halten Sie den Stickstoffstrom aufrecht, bis keine Flüssigkeit mehr zu beobachten ist. Das Filtrat durchläuft den Extruderfilter und gelangt in das Glasgefäß, um eine DLS-Analyse durchzuführen. Bereiten Sie zunächst 50 Mikroliter einer 20 Mikromolar-Liposomenlösung vor, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS verdünnt ist.

Schalten Sie dann die Stromquelle und die Lampenquelle ein. Öffnen Sie die Dynapro-Software. Stellen Sie die Software auf das Algorithmusmodell ein, um Liposomen in der gewünschten Größe zu detektieren.

Nachdem Sie 14 Mikroliter Liposomenprobe mittels der angeschlossenen Pipette in die Quarzküvette gegeben und die Küvette in den Probenträger eingesetzt haben, starten Sie die Messung. Nach etwa 20 bis 30 Aufnahmen drücken Sie auf „Stop“. Analysieren Sie die auf dem Histogramm erfassten Peakwerte für den durchschnittlichen Liposomen-Durchmesser. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse beginnt mit der Herstellung einer 500-Mikroliter-Lösung von 0,1 Mikromolar-Liposomen, die in PBS gelöst sind. Spülen Sie danach das Probenfach mit Wasser und Ethanol.

Trocknen Sie anschließend das Probenfach mit einem fusselfreien Papiertuch. Schalten Sie die Laserstromquelle und den Computer ein, und geben Sie 300 Mikroliter einer 0,1-molaren Liposomenlösung in das Probenfach. Öffnen Sie die Temperaturregelung und die Software für die Nanopartikel-Verfolgungsanalyse.

Drücken Sie die Aufnahmetaste, um den Laser einzuschalten. Verwenden Sie die horizontalen und vertikalen Justierungen, um den Objekttisch zu bewegen und den Mikroskofokus einzustellen. Stellen Sie die gewünschte Temperatur und Aufnahmezeit ein.

Drücken Sie die Aufnahmetaste, um für einen bestimmten Zeitraum mehrere Einzelbilder der Liposomenpartikel aufzunehmen. Analysieren Sie die Peaks, die den Durchmessern der Liposomengrößen im Histogramm entsprechen, während die Bewegung jedes Partikels verfolgt wird. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) ist eine etablierte Methode, bei der gestreutes Licht gesammelt wird, um den Partikeldurchmesser zu bestimmen, und wurde durchgeführt, um die Liposomengrößen zu ermitteln.

Hydratisierte Liposomen wurden gemäß des schriftlichen Protokolls durch Polycarbonatmembranen unterschiedlicher Größe und unter verschiedenen Drücken extrudiert. Die mittels DLS gemessenen Durchmesser der Liposomen betrugen bei einer Porengröße von 30 Nanometern 66 ± 28 Nanometer, bei einer Porengröße von 100 Nanometern 138 ± 80 Nanometer und bei einer Porengröße von 400 Nanometern 360 ± 25 Nanometer.

Ein Suspension von 50 Nanometer polierten Irene-Perlen wurde als Kalibrierstandard verwendet, wobei ein Durchmesser von 47 ± 16 Nanometern gemessen wurde. Der Prozentsatz der Polydispersität zeigt, dass keine Überlappung zwischen den Liposomgrößen vorliegt. Es ist typisch, bei Verwendung der DLS-Analyse Durchmesser über 30 Nanometern zu beobachten, aufgrund der bekannten Neigung dieses Instruments, größere Partikel stärker zu gewichten.

Trotz dieser instrumentellen Einschränkung beschreibt die Kalibrierungskurve eine lineare Korrelation. Die Nanopartikel-Verfolgungsanalyse ist eine neue Technologie, die die Größe jedes Partikels anhand direkter Beobachtungen der Diffusion in einem flüssigen Medium misst, unabhängig vom Brechungsindex oder der Dichte des Partikels. Diese hochauflösende Methode kann verwendet werden, um die Messung von Liposomen mittels DLS zu ergänzen; für die Kalibrierung wurden mit NTA gemessene Durchmesser von 95 ± 48 Nanometern und 356 ± 51 Nanometern für zwei Polystyrol-Lösungen mit 100 beziehungsweise 400 Nanometern verwendet.

Lipidlösungen weisen einen bezüglich des Durchmessers vergleichbareren Wert im Vergleich zur DLS auf, wobei mittlere Größen von 29 ± 14 Nanometern für eine Porengröße von 30 Nanometern, 95 ± 17 Nanometern für eine Porengröße von 100 Nanometern und 359 ± 73 Nanometern für eine Porengröße von 400 Nanometern ermittelt wurden. Die NTA könnte eine allgemeinere Charakterisierungsmethode zur Quantifizierung mikroskopischer Partikel darstellen, da ihre Empfindlichkeit die Messung von Partikeln im Bereich von 50 bis 1000 Nanometern ermöglicht. Die Kalibrierungskurve zeigt eine lineare Korrelation zwischen der Polycarbonatmembran-Pore und dem gemessenen NTA-Durchmesser. Negativgefärbte Durchstrahlungselektronenmikroskopie-Aufnahmen zeigen die jeweilige Liposomgröße nach Extrusion durch 30, 100 und 400 Nanometer große Poren, die deutlich voneinander unterscheidbar sind.

Die Vergrößerung wurde auf 25.000-fach mit einer Maßstabsleiste, die 0,5 Mikrometer entspricht, eingestellt. Ein Zeitverlaufsversuch wurde mit drei Liposomgrößen durchgeführt. Die DLS wurde für jede Liposomlösung unmittelbar nach der Extrusion gemessen.

Alle Liposomlösungen wurden über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert. Ihre Durchmesser wurden nach einer Übernacht-Inkubation erneut mittels DLS aufgezeichnet. Nach einer 60-stündigen Inkubationszeit wurde kaum eine Veränderung beobachtet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass mehrfache Durchläufe durch den Extrusionsfilter die Homogenität der Vesco-Lösung verbessern.

Beachten Sie außerdem, Glasgefäße und Spritzen für die Probenzubereitung zu verwenden, um eine Kontamination durch Auslaugung von Polypropylenröhrchen durch Chloroform zu vermeiden.