Name: Antikörper Transfektion in Neuronen als Werkzeug zur Pathogenese der Erkrankung Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Antikörper-Transfektion in Neuronen, um Autoantikörper-Wirkungen auf neuronale Funktionen und neurologische Erkrankungen zu untersuchen. Diese Technik nutzt Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Diese Arbeit wird durch das Office of Research and Development, Medical Research Service, Department of Veterans Affairs unterstützt. Diese Studie wurde von einer VA Merit Review Award (MCL) und der University of Tennessee Health Science Center Multiple Sclerosis Research Fund finanziert.

Ein. Antibody Labeling (Abbildung 1) <ol><li> Machen 0,1 M NaHCO 3-Puffer: <ul type="circle"><li> 8,4 g NaHCO 3 </li><li> 29,2 g NaCl </li><li> 1 Liter H 2 O </li></ul></li><li> Bringen der Puffer bis zu einem pH von 8,4 mit dieser Lösung (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 Liter H 2 0). </li><li> Fügen Sie 35 ul Atto550 NHS bis 70 ul anti-hnRNPA1 und 500 ul NaHCO 3-Puffer und drehen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem einstündigen Rotation, spritzen die Mischung in einen Dialysator und dialysieren in 2 l PBS über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag konzentrieren die dialysierte Atto550 NHS anti-hnRNPA1 unter Verwendung eines Spin-Säule (Amicon Ultra 0.5). </li><li> Nachdem die Atto550 NHS markierten Anti-Antikörper hnRNPA1 konzentriert worden ist, Nano-Drop Probe zur Bestimmung der Konzentration. </li></ol> 2. Antikörper Transfektion (Abbildung 2) <ol><li> Seed 10 5 Zellen / Well in 500 ul Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM/F12 +10% FBS +1% Antibiotikum) in einem 8 sowie Schlitten 24 Stunden vor der Transfektion. Zellkonfluenz sollte mindestens 70% betragen. </li><li> Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen, fügen 2 ul Ab-deliverin Reagenz in ein Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Anschließend fügen 2 ug Atto550 NHS markierten Anti-Antikörper hnRNPA1 (0,5 ug / ul) an dieselbe Eppendorfröhrchen Inkubation und 10-15 min bei RT. </li><li> Während der Inkubation anzusaugen Medien und fügen 394 ml frisches DMEM-Medium zu den Zellen. </li></ol> Hinweis: In 500 ul DMEM zu einer Kammer der unberührten Zellen als Kontrolle dienen. <ol start="5"><li> Nach der Inkubation mit 100 ul DMEM an den Antikörper Mischung, mischen durch Pipettieren rauf und runter, und fügen Sie zu den Zellen in DMEM mit einem Gesamtvolumen von 500 ul. </li><li> Ändern Sie die Medien nach 48 h von Antikörper Lieferung. </li></ol> Hinweis: Das Protokoll wurde mit FITC als positive Kontrolle markierten Rigg wiederholt. 3. Live und Fixed Imaging Effizienz bestimmen <ol><li> Bildzellen bei 48 h unter Verwendung der Cy3-Filter auf einem Fluoreszenzmikroskop Die zur Bebilderung der transfizierten Atto550 NHS markierten Antikörpern. </li><li> Nach Live-Bildgebung abgeschlossen ist, saugen die Medien und fix Zellen. </li><li> Nach Absaugen Medien behandeln Zellen mit 0,4% Paraformaldehyd für 15 Min. bei Raumtemperatur. Waschen der Zellen 4 x 5 min mit jeweils PBS. Dann montieren Zellen mit Eindeckmedium enthält DAPI Reagenz und fix Deckglas. Messen Transfektionseffizienz der fixierten Zellen mit AxioVision Software. Wenn Axiovision Software ist nicht auf der Hand, zählen Sie einfach die Ereignisse aus dem Bild mit der Hand und stecken Ergebnisse in die Berechnung bei 3,7. Alternativ kann ImageJ Software für diese Berechnungen verwendet werden. </li><li> Erstens, die &quot;Events&quot;-Messung, um die Gesamtzahl der Zellen in Ihrem Bild der Wahl zählen 20-facher Vergrößerung. </li><li> Weiter, verwenden Sie die &quot;Events&quot;-Messung, um die Zellen, die nicht zählenerfolgreich mit Antikörpern in der gleichen 20-facher Vergrößerung Bild transfiziert. </li><li> Um die gemessenen &quot;Events&quot; in einer Excel-Stil-Format zuzugreifen, auf &quot;Eigenschaften&quot; klicken, klicken Sie auf die &quot;Measurement&quot;-Registerkarte, und klicken Sie auf, um anzuzeigen &quot;Wie die Tabelle.&quot; </li><li> Schließlich verwenden Sie die folgende Berechnung, um Ihre Transfektionseffizienz zu bestimmen, indem die beiden zuvor gemessenen Ereignisse: ((Summe Zellen - transfizierten Zellen) / Total Cells) x 100 = Transfektionseffizienz. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Live-Bilder von untransfizierten (3A) auf transfizierten (3B) Neuronen im Vergleich zeigen, dass die Markierung der Antikörper (rot oder grün in jeder Figur) ist klar innerhalb der Zellen (3B, C, D) beobachtet. Nach Absaugen und Waschen mit Medien, um Antikörper zwischen oder Anhänger der Oberfläche von Zellen zu entfernen, sind noch vorhandenen markierten Antikörpern in Neuronen (3C, D).<html> Um die Transfektionseffizienz zu berechnen, verwenden Sie die Software AxioVision zur gesamten Zellen im Vergleich zu Zellen, die nicht erfolgreich transfiziert wurden zu berechnen. Diese Werte wurden in einen Transfektionseffizienz Formel, um die Transfektionseffizienz als Prozentsatz der gesamten Zellen (Abbildung 4) übernehmen wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufschema der Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit der Atto 550 NHS-Ester gefolgt von den Schritten erforderlich, um die markierten Antikörpern zu konzentrieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ablaufschema der Verfahren verwendet werden, um markierte Antikörper in lebende Zellen in Kultur zu transfizieren.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> Abbildung 3. Live-Bilder der transfizierten Neuronen 48 hr nach Transfektion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> Abbildung 4. Behoben und Bilder gespült mit Ereignissen, um gezählt, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
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<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
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<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Um Hypothesen über spezifische Moleküle und deren Expression zu testen, werden Gene und andere Vektoren üblicherweise in Zellen transfiziert. Die Besonderheit dieses Verfahrens ist die Fähigkeit, leicht transfizieren Antikörper in Zielzellen. Wir führten diese Methode in fünf getrennten Experimenten jeweils in Duplikaten. Transfektionseffizienz Ergebnisse waren ähnlich bei allen Experimenten. Insbesondere erlaubt der Verfahrenseintrag von Antikörpern in die Zelle ohne Veränderung Antikörper Struktur oder Funktion. Ferne...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Axiovision Version 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC markierten Anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS-Ester </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-deliverin </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10% FBS 1% Antibiotika </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin-8-Well-Kultur Slides </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientific Industries Inc </td><td> Modell 151 </td></tr><tr><td> DAPI Mounting Medien </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialysator </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd (4% ige Lösung) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antikörper transfektion in neuronen als werkzeug zur pathogenese der erkrankung studieren

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antikörper bieten die Möglichkeit, neue Einblicke in die verschiedenen Ereignisse in lebenden Systemen zu gewinnen. Die Fähigkeit, hochspezifische Antikörper zu produzieren Zielproteine ​​wurde für sehr präzise biologischer Fragestellungen gelassen adressiert werden. Wichtigerweise haben Antikörper in die Pathogenese einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, einschließlich systemischem Lupus erythematodes (SLE), rheumatoider Arthritis (RA), paraneoplastischen Syndromen, Multiple Sklerose (MS) und menschlichen T-lymphotropen Virus Typ 1 (HTLV-1) in Verbindung gebracht assoziierte Myelopathie / tropische spastische Paraparese (HAM / TSP) 1-9. Wie Krankheiten verursachen Antikörper ist ein Bereich der laufenden Untersuchung und Daten nahe, dass Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und verschiedene intrazelluläre Moleküle führt zu Entzündung, zellulärer verändert Messaging und Apoptose 10. Es hat sich gezeigt, dass Patienten mit MS und HAM / TSP Autoantikörper produzieren, um die intrazelluläre RNA-Bindeprotein heterogenen ribonuclear Protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Neuere Daten weisen darauf hin, dass Antikörper, sowohl Intra-neuronale und Oberflächenantigene pathogenen 3, 5-9, 11 sind. So ein Verfahren, das für die Untersuchung der intrazellulären Antikörpers ermöglicht: Protein Interaktionen würde großen Einblick in Krankheitsentstehung verleihen. Gene häufig in primären Zellen und Zelllinien in Kultur transfiziert wurde jedoch Transfektion von Antikörpern in Zellen durch Änderung des Antikörpers Struktur oder schlechte Transfektionseffizienz 12 behindert. Andere Transfektionsmethoden sind Antikörper Transfektion auf kationischen Liposomen (bestehend aus DOTAP / DOPE) und Polyethylenimine (PEI) bezogen, welche beide in einem Zehn-fache Abnahme der Antikörper Transfektion resultierte, verglichen mit Kontrollen 12. Das Verfahren unserer Studie durchgeführt ähnelt kationische Lipid-vermittelte Methoden und verwendet eine Lipid-basierten Mechanismus zur nicht-kovalente Komplexe mit den Antikörpern zu bilden, durch elektrostatische und hydrophobic Wechselwirkungen 13. Wir verwendeten Ab-deliverin Reagenz, das eine Lipidformulierung einfangen kann Antikörper durch nichtkovalente elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen und liefert sie innerhalb der Zellen ist. So chemischen und genetischen Kupplungen sind nicht notwendig für die Lieferung von funktionellen Antikörpern in lebenden Zellen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, führen verschiedene Antikörper Tracing und Proteinlokalisierung Versuche sowie die Analysen der molekularen Folgen von intrazellulären Antikörper: Protein Wechselwirkungen 9. In diesem Protokoll wird gezeigt, wie an Antikörper zu Neuronen transfizieren rasch, reproduzierbar und mit einem hohen Grad der Transfektionseffizienz. Als ein Beispiel verwenden wir anti-hnRNP A1 und Anti-IgG-Antikörpern. Für die einfache Quantifizierung der Transfektionseffizienz verwendet man Anti-Antikörper mit hnRNP A1 Atto-550-NHS und FITC-markierten-IgG markiert. Atto550 NHS ist ein neues Label mit hochmolekularen Absorption und Quanten-yield. Anregungsquelle und fluoreszierenden Filter für Atto550 ähneln Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Darüber hinaus hat Atto550 hohe Photostabilität. FITC-markiertes IgG wurden als Kontrolle verwendet, um anzuzeigen, dass dieses Verfahren vielseitig und nicht färben abhängig ist. Dieser Ansatz und die Daten, die erzeugt wird Verständnis der Rolle, dass Antikörper gegen Zielantigene intrazelluläre könnte in der Pathogenese von Erkrankungen des Menschen spielen, zu unterstützen.

Eine schnelle Annäherung an Interaktionen und Wirkungen auf molekularer Mechanismen in Bezug auf die Anwesenheit von Antikörpern in einer intrazellulären Umgebung untersucht wird beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Transfektion von Antikörpern in lebende Zellen mit einem nicht-kovalenten Komplex-Bildung auf einem Lipid Formulierung. Die Technik ist anpassbar an immortalisierten Zelllinien und primäre Zellen.

Antikörper Transfektion in Neuronen als Werkzeug zur Pathogenese der Erkrankung Studieren

Antikörper ermöglichen es, neue Erkenntnisse über verschiedene in lebenden Systemen ablaufende Vorgänge zu gewinnen. Die Fähigkeit, hochspezifische ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, einen schnellen und reproduzierbaren Ansatz bereitzustellen, um zu untersuchen, wie Antikörper, auto-molekulare Mechanismen in Bezug auf die neuronale Funktion und die Pathogenese neurologischer Erkrankungen zusammenhängen. Zunächst werden die Antikörper mit einer ATO five 50 NHS-Fluoreszenzmarkierung markiert. Anschließend werden die Antikörper mit dem Transfektionsreagenz vermischt und in neuronale Zellen transfiziert.Im Kulturversuch werden 48 Stunden nach der Transfektion die Neuronen mit DPI-Medien fixiert, aufgebracht und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die Transfektionseffizienz kann mithilfe von Bildanalyse-Software berechnet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften und Neuroimmunologie zu beantworten, beispielsweise wie Autoantikörper molekulare Mechanismen beeinflussen, die mit der neuronalen Funktion und der Pathogenese immunvermittelter neurologischer Erkrankungen zusammenhängen.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir die Hypothese überprüfen wollten, dass Antikörper gegen h und RPA1 sowie RNA-bindende Proteine, die in Neuronen überexprimiert sind, zum Mechanismus der Neurodegeneration beitragen. Das Verfahren wird Josh Douglas, ein Doktorand, demonstrieren. Vor Beginn des Verfahrens sicherstellen, dass hochwertige, intakte neuronale Zellen, die mit 100.000 Zellen pro Vertiefung ausgeplattet wurden und mindestens zu 80 % konfluent sind, am Tag vor den Experimenten verfügbar sind. Am Tag des Assays die Zellen beobachten, um sicherzustellen, dass sie gesund sind.Beginnen Sie mit der Herstellung eines 0,1-mil-Sodiumbicarbonat-Puffers durch Mischen von 8,4 Gramm Natriumbicarbonat und 29,2 Gramm Natriumchlorid in einem Liter Wasser. Danach stellen Sie den pH-Wert des Puffers auf 8,4 ein und geben 500 Mikroliter Puffer ab. Fügen Sie 70 Mikroliter des zu konjugierenden Antikörpers, in diesem Fall anti H-N-R-N-P-A eins, und 35 Mikroliter des Markierungreagenzes, hier at oh five 50 NHS, hinzu.Drehen Sie die Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur und injizieren Sie sie anschließend in einen Dialysator, wo sie über Nacht in zwei Litern PBS bei vier Grad Celsius dialysiert wird. Verwenden Sie am nächsten Tag eine Spinsäule, um den dialysierten markierten Antikörper zu konzentrieren. Bestimmen Sie abschließend die Antikörperkonzentration mithilfe eines NanoDrop-Spektrophotometers.In einer Acht-Well-Platte 10.000 Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 500 Mikrolitern komplettem DMEM ansiedeln. Die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren oder bis die Zellkonfluenz mindestens 70 % erreicht hat. Sobald die Zellen 70 % konfluent sind, das Verfahren beginnen, indem zwei Mikroliter Antikörper, die Transfektionsreagenzien und zwei Mikrogramm markierten Antikörper mit einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter in einem Eppendorf-Röhrchen gemischt werden, und die Lösung 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird.Entfernen Sie in der Zwischenzeit das SUP-Natam aus den Zellkulturmulden und ersetzen Sie es durch genau 394 Mikroliter pro Mulde mit frischem Medium. Sobald die Transfektionslösung bereit ist, geben Sie 100 Mikroliter DMEM hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie anschließend genau 106 Mikroliter der Transfektionsmischung in jede Mulde mit Zellen, um ein Endvolumen von 500 Mikrolitern pro Mulde zu erhalten.Stellen Sie sicher, dass eine NICHT TRANSFEKTIERTE Negativkontroll-Vertiefung vorhanden ist, der anstelle des Antikörpers DMEM zugesetzt wird. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach dieser Inkubation das Medium durch frisches DMEM und führen Sie die Live-Bildgebung 48 Stunden nach der Markierung mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops durch.Um ATO fünf 50 NHS-markierte Antikörper zu visualisieren, verwenden Sie nach der Live-Bildgebung den SI-Drei-Filter, saugen Sie das Medium ab und fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 4 % Paraldehyd und Inkubation des Objektträgers 15 Minuten bei Raumtemperatur. Sobald die Zellen fixiert sind, waschen Sie sie viermal mit PBS, wobei für jeden Waschschritt eine fünfminütige Inkubationsphase in PBS eingelegt wird. Anschließend entfernen Sie den PBS und geben einen Tropfen Einbettmedium mit DPI hinzu.Platzieren Sie vorsichtig je einen Deckglaser auf die Zellen und verwenden Sie ein fluoreszierendes Mikroskop. Beginnen Sie mit der Bildaufnahme der Zellen. In diesem Experiment führten wir erfolgreich die Live-Fluoreszenz-Bildgebung von Neuronen durch, die erfolgreich mit ATO fünf 50 NHS-markierten anti H-N-R-N-P-A1-Antikörpern transfiziert wurden.Dieses Bild zeigt Antikörper in den neuronalen Zellen, einschließlich der zytoplasmatischen neuronalen Fortsätze sowie der Kernfixierung und Kernfärbung. Die Verwendung von DPI, das hier in Blau dargestellt ist, ermöglicht es, die Transfektionseffizienz zu bestimmen, indem die Anzahl der transfizierten Zellen durch die Anzahl der Gesamtzellen dividiert wird. In diesem Fall beträgt die Effizienz 50 % nach diesem Verfahren.Andere Methoden wie die Immunzytochemie, die RNA-Extraktion, die Mikroarray-Analyse und Western Blots können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Kolokalisation von Antikörpern innerhalb zellulärer Organellen sowie zu Veränderungen der neuronalen Funktion und Integrität im Zusammenhang mit der Spezifität des Antikörpers für das Zielantigen. In diesem Video haben wir gezeigt, wie man Antikörper mit einer fluoreszierenden Markierung markiert, einen Komplex aus Transfektionsreagenz mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern herstellt, Neuronen transfectiert und die Transfektionseffizienz berechnet. Diese Methode ist nützlich zur Beurteilung, wie Autoantikörper zelluläre Funktionen wie Vitalität, Apoptose, neuronalen Transport sowie die molekularen Mechanismen, die mit der neuronalen Funktion und der Pathogenese neurologischer Erkrankungen zusammenhängen, beeinflussen.

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt den Prozess der Transduktion menschlicher neuronaler Zellen mit einem Lentivirus, das für ein mutiertes humanes Tau-Protein kodiert, das mit gelb fluoreszierendem Protein (YFP) markiert ist, um die Proteinaggregation zu untersuchen. Es werden die Schritte vom Eintritt des Virus bis zur Expression von mutiertem Tau beschrieben, die in der Bildung sichtbarer zytoplasmatischer Tau-Aggregate in den Neuronen gipfeln.

Lentivirale vermittelte Transduktion menschlicher Neuronen für die Analyse der Tau-Protein-Aggregation

Hier demonstrieren wir eine Technik zur weit verbreiteten neuronalen Transduktion durch intraventrikuläre Injektion von Adeno-assoziierten Viren in das neonatale Mausgehirn.  Diese Methode bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, eine lebenslange Expression von viral transportierten Transgenen zu erreichen.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

Die Kontrolle der Proteinexpression ist nicht nur für jeden lebenden Organismus unerlässlich, sondern auch eine wichtige Strategie, um Proteinfunktionen in zellulären Modellen zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll zeigt die Anwendung von Antikörperinterferenzen in Säugetierzellen, einschließlich primärer Hippocampus-Neuronen, und demonstriert die Verwendung dreidimensionaler Rekonstruktionen bei der Untersuchung der Proteinfunktion.

Das Studium von Proteinfunktionen und die Rolle der Altered Protein Expression von Antikörper-Interferenz und Dreidimensionale Rekonstruktionen

Dieses Manuskript beschreibt, wie die virale vektorvermittelte lokale Genabgabe eine attraktive Möglichkeit bietet, Transgene im zentralen Nervensystem zu exprimieren.  Das Protokoll beschreibt alle wichtigen Schritte zur Durchführung einer viralen Vektorinjektion in die Substantia nigra der Ratte, um ein auf viralen Vektoren basierendes Tiermodell für die Parkinson-Krankheit zu entwickeln.

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

Intraspinal Injektion von Rekombinase abhängigen recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) kann verwendet werden, um jeden genetisch gekennzeichneten Zelltyp im Rückenmark zu manipulieren. Hier beschreiben wir, wie Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks lumbale transduzieren. Diese Technik ermöglicht funktionale Verhör des Subtyps manipulierten Neuron.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Das Ziel dieses Protokolls ist, ein Zell-basierte System, das die Bildung von Alpha-Synuclein repliziert in Vivoaggregiert zu bieten. Intrazelluläre Alpha-Synuclein Einschlüsse sind in primären Neuronen durch die Internalisierung ausgesät und Vermehrung von exogenen verabreicht native microsomen-assoziierten Alpha-Synuclein-Aggregaten von erkrankten Alpha-Synuclein transgenen Mäusen isoliert.

Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

In diesem Protokoll wird ein Verfahren beschrieben, bei dem menschliche neuronale Kulturen mit Linsenkonstrukten übertragen werden, die für mutwillige menschliche Tauben kodieren. Durchgeführte Kulturen zeigen Tau-Aggregate und damit verbundene Pathologien.

Ein In-Vitro-Modell für das Studium der Tau Aggregation mit Lentiviral-vermittelter Transkription menschlicher Neuronen

Autoimmunenzephalitis ist eine neue Kategorie von Antikörper-vermittelten Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Hippocampus-Neuronen können verwendet werden, um diese Antikörper zu entdecken und zu charakterisieren. Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die primäre Zellkultur und Immunfärbung zur Bestimmung von Autoantikörpern im Serum und in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten.

Hippocampus-neuronale Kulturen zum Nachweis und zur Untersuchung neuer pathogener Antikörper, die an der Autoimmunenzephalitis beteiligt sind

Hier zeigen wir, wie die Transfektion von primären hippokampalen Nagetierneuronen mit konfokaler Bildgebung in lebenden Zellen kombiniert werden kann, um pathologische Protein-induzierte Effekte auf den axonalen Transport zu analysieren und mechanistische Signalwege zu identifizieren, die diese Effekte vermitteln.

Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Messung der Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport in primären Hippocampus-Neuronen

Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Antikörper-Transfektion in Neuronen, um Autoantikörper-Wirkungen auf neuronale Funktionen und neurologische Erkrankungen zu untersuchen. Diese Technik nutzt Immunfluoreszenzmikroskopie.

Antikörper Transfektion in Neuronen als Werkzeug zur Pathogenese der Erkrankung Studieren

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