Lensfree On-Chip-tomographischen Mikroskopie beschäftigt Multi-Angle-Beleuchtung und Super-Pixel-Auflösung
16. August 2012
Lensfree optischen Tomographie ist eine dreidimensionale Mikroskopie-Technik, die eine räumliche Auflösung von <1 um bietet × <1 um x <3 &mgr; m in x-, y-und z-Dimensionen jeweils über einen großen Imaging-Volumen von 15-100 mm 3 Kann das besonders nützlich sein für die Integration in Lab-on-a-Chip-Plattformen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine linsenfreie dreidimensionale On-Chip-Bildgebung biologischer Proben über ein großes Bildgebungsvolumen zu erreichen. Dies wird erreicht, indem die Probe zunächst direkt auf dem Sensorchip platziert wird und eine teilweise kohärente Beleuchtung bereitgestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Lichtquelle für die Aufnahme von verschiedenen Positionen seitlich zu verschieben.
Subpixel verschoben holografische Bilder der Probe. Die nächsten Subpixel verschoben. Holografische Bilder werden für die tomographische Bildgebung mit einem Vielfachen der Beleuchtung aufgenommen.
Der letzte Schritt ist die Datenverarbeitung, bei der der erfasste Datensatz digital rekonstruiert wird, um schließlich dreidimensionale tomographische Bilder der Probe zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen Lichtmikroskopie besteht darin, dass sie einen hohen Durchsatz bei der Bildgebung in einer kompakten Architektur ermöglicht. Dies macht unsere Plattform besonders nützlich für die Integration mit libanesischen Chipplattformen.
In diesem Bericht wird der grundlegende Bildgebungsaufbau für eine Benchtop-Implementierung zur Tomographie statischer Proben beschrieben. Ein Monochromator mit einer Xenon-Lampe wurde so eingestellt, dass er eine Leistung mit einer spektralen Breite von etwa einem bis 10 Nanometern um eine Mittenwellenlänge von 450 bis 650 Nanometern liefert. Dieser teilweise kohärente Ausgang wird dann mit einer Multimode-Glasfaser gekoppelt, um teilweise kohärentes Licht an das System zu liefern.
Die optische Faser ist auf einem motorisierten Rotationstisch montiert, um den Beleuchtungswinkel zu ändern. Der motorisierte Tisch mit der angebrachten Lichtquelle ist auf einem zweidimensionalen linearen XY-Tisch montiert, der verwendet wird, um in einfachen Verschiebungen der Lichtquelle einen gegebenen Winkel für die Detektion zu erreichen. Zum Einsatz kommt ein A-C-M-O-S-Sensorarray mit fünf Megapixeln und einer Pixelgröße von 2,2 Mikrometern.
Der Detektor wird verwendet, um holografische Bilder von Proben mit großem Sichtfeld aufzuzeichnen. Es ist wichtig, dass das Sensorarray in der gleichen axialen Ebene wie die Rotationsachse der Lichtquelle positioniert ist, um sicherzustellen, dass wir überprüfen, ob der Sensor bei großen Beleuchtungswinkeln ausreichend Licht erhält. Während mit der linsenfreien optischen Tomographie eine Vielzahl von Objekten wie Zellen und Mikroorganismen abgebildet werden kann, werden hier die Grundprinzipien durch die dreidimensionale Mikroskopie einer Meereselgan-Probe mit einem Skalpell oder einem Spatel demonstriert.
Nehmen Sie ein kleines Stück AGA aus der Petrischale, in der sich die Versiegelungsorgankultur befindet. Ein kubisches Stück von mehreren Millimetern entlang jeder Dimension enthält Hunderte von Nematoden. Legen Sie das kleine Stück Agar in ein Polypropylenfläschchen mit einem Milliliter deionisiertem Wasser.
30 Sekunden bis eine Minute lang sanft vortexen. Nach 10 bis 15 Minuten sollte der Wurm aus dem Agar in das entionisierte Wasser kriechen. Beachten Sie, dass die Würmer zu klein sind, um sie hier zu sehen, um die Würmer und einen Milliliter von fünf bis 10 Millimolaren Lima vorübergehend zu immobilisieren.
Also Lösung und 10 Minuten warten. Pipettieren Sie fünf bis 10 Mikroliter Probe vom Boden des Fläschchens und legen Sie sie zwischen zwei Abdeckfolien. Diese Probe, die eine große Anzahl von vorübergehend immobilisierten Würmern enthält, kann auf den Detektor gelegt werden, um die Datenerfassung zu starten.
Zu Demonstrationszwecken werden in diesem Abschnitt die Bildaufnahmeschritte für eine typische linsenfreie optische Tomographie oder ein LOT-Experiment zusammengefasst, der gesamte Prozess wurde jedoch unter Verwendung der speziell entwickelten Laboransichtsschnittstelle automatisiert. Um mit den manuellen Schritten zu beginnen, stellen Sie den Anfangswinkel des Drehtisches auf minus 50 Grad ein, wobei null Grad der vertikalen Position der Lichtquelle entspricht. Stellen Sie die Anfangsposition des XY-Tisches auf Null Null ein, was die Ausgangsposition ist.
Passen Sie die Belichtungszeit des Detektors so an, dass der Dynamikbereich optimal genutzt wird, sodass das Bild so hell wie möglich ohne gesättigte Pixel ist, ohne den Winkel des Rotationstisches zu ändern. Nehmen Sie neun Bilder für jedes Bild auf. Verschieben Sie den XY-Tisch an eine neue Position in einem drei mal drei quadratischen Raster, sodass jedes Bild im Vergleich zum vorherigen Bild um etwa ein Viertel Pixel verschoben wird.
Die Aufnahme von mehr Bildern aus jedem Winkel kann je nach Art des Objekts und Signal-Rausch-Verhältnis die Auflösung verbessern. Nachdem Sie neun Bilder im Anfangswinkel aufgenommen haben, stellen Sie die Position des XY-Tisches wieder auf die Nullposition ein. Vergrößern Sie dann den Winkel des Drehtisches in Schritten von zwei Grad, bis er positive 50 Grad erreicht.
Wiederholen Sie nach jedem Inkrement bei jedem neuen Winkel die beschriebenen Schritte. Die Winkelinkremente können feiner oder gröber sein, je nachdem, wie die Erfassungszeit im Vergleich zur Bildauflösung optimiert wird. Nach der Datenerfassung wird ein Satz von 459 Bildern aufgenommen, die neun subpixelverschobene Bilder für jeden der 51 verschiedenen Beleuchtungswinkel enthalten.
Jeder Satz von neun Bildern wird unter Verwendung von Pixel-Superresolution-Algorithmen digital verarbeitet, um eine hochauflösende Projektion zu erhalten. Hologramm pro Winkelpixel Superergebnis werden dann digital rekonstruiert, um 51 Projektionsbilder zu erhalten. Die Datenverarbeitung wird hier anhand eines Laptops gezeigt.
Die Rekonstruktion würde weniger als eine Sekunde für das volle Sichtfeld unter Verwendung grafischer Verarbeitungseinheiten dauern. Dieser Satz von 51 Projektionsbildern wird dann mit dem Tom OJA-Plugin zurückprojiziert. Für Image J werden die Projektionsbilder zuerst in Image J geladen, woraufhin das Tom OJ-Plugin aufgerufen wird.
Eine Nachschlagetabelle, die den Betrachtungswinkel für jedes Projektionsbild angibt, wird in OJ geladen. Mit der Methode der gewichteten Rückprojektion können dreidimensionale tomographische Bilder der Probe erhalten werden. Hier wird das große Sichtfeld der linsenfreien optischen Tomographie demonstriert, da die Probe direkt auf dem Detektorarray platziert wird. Holografische Bilder der Objekte können über ein Sichtfeld von 24 Millimetern im Quadrat aufgenommen werden, das mit Hilfe neuer Detektorarrays mit größeren aktiven Flächen weiter vergrößert werden kann.
Obwohl die Pixelgröße des Detektorarrays die Auflösung der aufgezeichneten holographischen Bilder begrenzt, mildern Pixel-Superauflösungstechniken dieses Problem: Hier gezeigt sind superaufgelöste Pixel-Hologramme, zusammen mit den rekonstruierten Projektionsbildern, die eine räumliche Auflösung von unter einem Mikrometer für drei verschiedene Beleuchtungswinkel bieten. Die Projektionsbilder können mit Hilfe von tomographischen Bildrekonstruktionstechniken kombiniert werden, um den TOM-Grund der Probe zu berechnen. Hier sind drei Schichtbilder in der XY-Ebene durch den Frontzahn des Wurms zu sehen, wobei der Rachenschlauch nur in dem Schnitt durch Z sichtbar ist, der acht Mikrometer beträgt, wie es von dieser annähernd zylindrischen Struktur mit einem Außendurchmesser von etwa fünf Mikrometern erwartet wird.
Darüber hinaus zeigt das Schnittbild in der XZ-Ebene deutlich die Grenzen des Wurms und des Pharynxtubus im Inneren, was eine erfolgreiche 3D-Bildgebung des Pharynx zeigt. Mit ihrer Entwicklung kann diese Technik den Weg für Forscher ebnen, dreidimensionale Mikroskopie über Dutzende von Millimeter Röhren mit Bildgebungsvolumen durchzuführen. Daher kann die linsenlose optische Tomographie ein nützliches Werkzeug für Hochdurchsatz-Bildgebungsanwendungen in libanesischen Chipplattformen sein.
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Übersicht
Dieser Artikel behandelt die linsenfreie optische Tomographie, eine dreidimensionale Mikroskopietechnik, die hochauflösende Abbildungen biologischer Proben ermöglicht. Die Methode erlaubt die Abbildung über ein großes Volumen und eignet sich daher gut für die Integration in Lab-on-a-Chip-Plattformen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologische Bildgebung
- Mikroskopietechniken
Hintergrund
- Die linsenfreie optische Tomographie bietet eine räumliche Auflösung von <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- Das Verfahren ist in der Lage, Volumina zwischen 15–100 mm³ abzubilden.
- Es ist besonders vorteilhaft für Anwendungen in Lab-on-a-Chip-Technologien.
- Diese Methode nutzt teilweise kohärente Beleuchtung zur Abbildung.
Zweck der Studie
- Um eine linsenfreie dreidimensionale Abbildung biologischer Proben zu erreichen.
- Um die Integration dieser Technik mit Lab-on-a-Chip-Plattformen zu untersuchen.
- Um die Abbildungsfähigkeiten über große Volumina hinweg zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Platzierung der Probe direkt auf dem Sensorchip.
- Verwendung einer teilweise inkohärenten Beleuchtung.
- Laterales Verschieben der Lichtquelle zur Aufnahme holographischer Bilder mit Subpixel-Verschiebung.
- Aufnahme mehrerer holographischer Bilder für die tomographische Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche dreidimensionale Abbildung biologischer Proben.
- Nachweis von hohen räumlichen Auflösungsfähigkeiten.
- Effektive Integration mit Lab-on-a-Chip-Plattformen.
- Validierung der Methode durch verschiedene Abbildungstests.
Schlussfolgerungen
- Die linsenfreie optische Tomographie ist eine aussichtsreiche Technik für die biologische Bildgebung.
- Das Verfahren bietet erhebliche Vorteile hinsichtlich räumlicher Auflösung und Bildgebungsvolumen.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf verschiedene Bereiche der biologischen Forschung ausdehnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die linsenfreie on-Chip-Tomographiemikroskopie ermöglicht eine hochdurchsatzfähige, markierungsfreie 3D-Bildgebung biologischer Proben über große Volumina hinweg, ohne aufwändige Optik, und unterstützt die Integration mit mikrofluidischen Plattformen und Lab-on-a-Chip-Systemen. Dieser Ansatz verringert den Platzbedarf und die Kosten des Instruments, während er eine Submikrometer-Auflösung beibehält, und trägt so zur Lösung von Engpässen in der Entdeckungsphase bei Durchsatz und Assay-Kompatibilität bei. Die Technologie steigert die Vorhersagesicherheit bei der frühen Zielvalidierung, indem sie quantitative, tiefenauflösende strukturelle Daten für die phänotypische Bildgebung und die mechanistische Ent-Risikobewertung bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch 3D-Strukturvisualisierung zellulärer Phänotypen und subzellulärer Organellen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die markierungsfreie Bildgebung lebender Proben, reduziert Vorbereitungsartefakte und erhält die native Biologie für Target-Bindungsstudien.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt quantitative volumetrische Daten, um den Wirkmechanismus aufzuklären und Zielwegen in der frühen Entdeckung Risiken zu nehmen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht 3D-Bildgebung mit submikroner Auflösung über große Sichtfelder hinweg und damit ein hochinformatives phänotypisches Screening von Mikroorganismen und Zellpopulationen.
- Operativer Wert: Macht Linsen und komplexe Optiken überflüssig und standardisiert so die Bildgebungsabläufe für reproduzierbare und skalierbare Assay-Entwicklung.
- Assay-Eignung: Erleichtert die Vorbereitung validierter biologischer Systeme für die anschließende Wirkstoffbewertung durch automatisierte, hochdurchsatzfähige Datenerfassung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem sie eine konsistente 3D-Bildgebung über verschiedene Modellsysteme hinweg – wie C. elegans und Zebrafischembryonen – bereitstellt.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Ermöglicht die langfristige Verfolgung struktureller Veränderungen in krankheitsrelevanten Systemen, um die Abstimmung von Biomarkern und risikoadjustierte Fortschrittsentscheidungen zu unterstützen.
- Treue der präklinischen Modelle: Erhält die native Gewebearchitektur und -dynamik bei, wodurch die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus in-vitro- in in-vivo-Kontexte verbessert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Biologie bis zur Leitstruktur-Identifizierung und unterstützt die Hypothesenprüfung, die Standardisierung von Assays sowie quantitative Analysen, ohne umfangreiche Probenvorbereitung oder Markierungsschritte zu erfordern.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch 3D-Visualisierung struktureller Phänotypen in ungestörten biologischen Systemen.
- Screening: Bietet assaysbereite, reproduzierbare Bildgebung mit quantitativen Ergebnissen zur Vergleichbarkeit von Kontroll- und Behandlungsbedingungen in großen Stichprobenpopulationen.
- Analysen: Erzeugt tiefenauflösende tomographische Rekonstruktionen und Projektionsbilder, die den statistischen Vergleich morphologischer Merkmale ermöglichen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Kontinuität durch die Bildgebung krankheitsrelevanter Modellorganismen mit konsistenter Auflösung und Volumenabdeckung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die mit verschiedenen Probentypen und mikrofluidischen Formaten kompatibel ist und somit redundante Technologieinvestitionen reduziert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit durch markierungsfreie, hochauflösende 3D-Bildgebung, die mechanistische Unklarheiten bei der Zielvalidierung verringert.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Skalierbarkeit durch eine linsenfreie Konstruktion, automatisierte Datenaufnahme und Kompatibilität mit Sensorarrays im Großformat.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige Erkennung phänotypischer Anomalien ermöglicht wird, was biologische Risiken in späteren Phasen und kapitalineffiziente Prozesse reduziert.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem quantitative, multiparametrische Bildgebungsdaten für den objektiven Vergleich therapeutischer Kandidaten bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in rechnergestützter Bildgebung, Holographie und tomographischen Rekonstruktionsalgorithmen.
- Benötigt hochauflösende CMOS/CMOS-Sensorarrays und motorisierte Beleuchtungsstufen zur Erfassung von Daten aus mehreren Winkeln.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei Beleuchtungsprotokollen, Belichtungseinstellungen und Subpixel-Verschiebungsverfahren zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Die Übertragung auf verschiedene Modellsysteme kann eine Optimierung der Probenvorbereitung und Immobilisierungstechniken erfordern, um die Lebensfähigkeit während der Bildgebung zu erhalten.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählt die Empfindlichkeit gegenüber dem Brechungsindex und den Streueigenschaften der Probe, die das Signal-Rausch-Verhältnis bei dichten oder stark absorbierenden Proben beeinträchtigen können.
