Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte In-situ Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von LacZ-Tagged Tumor Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Detektion von Mikrometastasen in der Lunge der Maus ex vivo zu verbessern und gleichzeitig die aufgeblähte Lungenarchitektur zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zuerst die Lunge in situ mit PBS durchblutet wird, um das Blut zu entfernen, das die Hauptquelle für den Farbhintergrund in diesem Gewebe ist. Die nächsten Schritte bestehen darin, die Lunge durch Injektion von PFA aufzublasen und dann abzukneifen, um das Lungengewebe unter dem Aufblasen zu fixieren.

Als nächstes wird die Lunge entnommen und weiter in PFA fixiert oder einzelne Lungenlappen werden für die Kryosektion eingebettet. Die letzten Schritte sind das Färben des Gewebes in Xal-Lösung und die Visualisierung der LA-zag-Tumorzellen, schließlich können Metastasen auf ganzen Lungenlappen oder in Lungengewebeschnitten mit einem binokularen Mikroskop oder einem Lichtmikroskop bis auf Einzelzellebene nachgewiesen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem eigenständigen Himmel besteht darin, dass die Nachweisbarkeit von Mikrometastasen durch die Entfernung des blutbezogenen Hintergrunds erheblich verbessert wird.

Beginnen Sie das Protokoll mit der Anästhesie einer Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin, Xylazin und Ace-Promazin in etwa 150 Mikrolitern PBS. Wenn die Schmerzreflexe der Maus nicht mehr beobachtet werden, fixieren Sie sie auf dem Operationstisch. Kehren Sie zurück und glätten Sie das Haar mit 70% Ethanol.

Öffnen Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals. Ziehen Sie die Haut zur Seite oder entfernen Sie sie. Öffnen Sie vorsichtig das Bauchfell im Thorax, um ein Reißen großer Gefäße wie der Venina jugulars zu verhindern.

Dadurch wird die Effizienz der Perfusion verbessert. Schneiden Sie nun die Hohlvene unter der Leber mit einer 20-Milliliter-Spritze und einer 21- bis 24-Gauge-Nadel ab. Injizieren Sie langsam 10 bis 15 Milliliter PBS in die rechte Herzkammer, bis die Lunge vollständig weiß ist und das Herz aufhört zu schlagen.

Dann kneifen Sie die Blutgefäße oberhalb der Leber und das Zwerchfell mit einer Gefäßklemme ab. Laden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit 3 % Paraformaldehyd und injizieren Sie mit einer 21- bis 24-Gauge-Nadel in den rechten Ventrikel. Ungefähr zwei Milliliter.

Legen Sie die Luftröhre außerhalb des Brustkorbs frei und blasen Sie die Lunge mit einer Injektion von etwa drei Millilitern Aldehyd von außerhalb des Brustkorbs in die Luftröhre auf. Drücken Sie dann unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel die Luftröhre ab, die mit einer Gefäßklemme an die Punktion gebunden ist, und warten Sie 10 Minuten, um die Fixierung zu ermöglichen. Als nächstes durchtrennen Sie die Blutgefäße oberhalb der Gefäßklemme.

Entfernen Sie dann die Klemme und injizieren Sie etwa zwei Milliliter PBS in den rechten Ventrikel, um überschüssiges Formaldehyd zu entfernen. Punktieren Sie die unteren Teile aller Lungenlappen mit einer Nadel und entfernen Sie die Gefäßklemme an der Luftröhre. Injizieren Sie nun drei bis fünf Milliliter verdünnte Einbettungslösung in die Luftröhre, die mit der anderen Injektion verhätschelt wird.

Stoppen Sie die Injektion, wenn die Paraform-Haut in den Lungenlappen durch die Lösung ersetzt wird. Entnehmen Sie die Lunge vorsichtig, indem Sie mit einer Zange am Herzen ziehen und Bindegewebsbänder, Blutgefäße und die Luftröhre durchtrennen. Achten Sie darauf, dass das Herz mit der Lunge verbunden bleibt.

Legen Sie einen Lappen für Kryoschnitte beiseite und verwenden Sie das restliche Lungengewebe für die gesamte lange Färbung. Legen Sie die Lunge in einen Plastikbecher mit dicht schließendem Deckel und fixieren Sie ihn mit 2% Formaldehyd und PBS. Legen Sie ein Stück Gaze auf die Lunge, um es in der Lösung zu halten, und lassen Sie es 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.

Entfernen Sie nach einer halben Stunde die Fixierlösung und waschen Sie das Tuch gründlich Mit PB S3 mal, bereiten Sie die gebrauchsfertige Xal-Lösung frisch vor, indem Sie einen Milliliter Xal-Stammlösung, einen bis 40 in der basischen Färbelösung verdünnen und mindestens 10 Milliliter davon in den Becher geben. Versenke die Lunge mit einem Stück Gaze. Befestigen Sie den Deckel locker, um den Luftaustausch zu ermöglichen, und inkubieren Sie ihn drei bis fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius lichtgeschützt.

Entfernen Sie nach der Inkubation die Xal-Lösung. Spülen Sie die Lunge einmal mit PBS, um die restliche Xal-Lösung zu entfernen, und fügen Sie mindestens 10 Milliliter 4%-Paraformaldehyd in PBS hinzu. Das Gewebe ist nun bereit für die Histologie und kann im 4%PFA bei vier Grad Celsius langfristig gelagert werden.

Beginnen Sie damit, ein Drittel einer Einbettungsform mit unverdünntem Polyforze-Einbettmedium zu füllen. Laden Sie dann den Lungenlappen in die Form und fügen Sie weiter Medium hinzu, bis der Lappen vollständig bedeckt ist. Vermeiden Sie es vorsichtig, dass Luftblasen den eingebetteten Lappen nun 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren.

Bereiten Sie als Nächstes die eingebetteten Lungen für die Teilung vor, indem Sie sie langsam in einer Mischung aus Trockeneis und Isopentan einfrieren. Bei Bedarf können sie nun in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius umgefüllt werden, um sie auf einem Kryostaten zu lagern. Geschnittene sieben bis 10 Mikrometer große Kryoabschnitte des Keulens. Montieren Sie die Abschnitte auf handelsübliche Kryoschnitte. Nach der Montage inkubieren Sie die Schnitte sofort in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer. Spülen Sie die Objektträger am nächsten Tag zweimal pro Spülgang fünf Minuten lang in PBS.

Anschließend kurz mit destilliertem Wasser abspülen. Färben Sie nun die Objektträger 10 Sekunden lang mit Nuclear Fast Red gegen, um einen schwachen Gegenfleck zu erhalten, der das Xal dominanter macht, und spülen Sie den Gegenfleck sofort mit destilliertem Wasser ab. Für eine dunklere Gegenfärbung verlängern Sie die Zeit auf bis zu 30 Sekunden oder mehr.

Montieren Sie die Objektträger mit Immuno Mount. Die Bildung von Metastasen in den durchgeführten LM-Modellen mit acht Maus-Betriebssystemen wurde erneut untersucht. Unter Verwendung der hier beschriebenen repräsentativen Bilder von perfundierten und nicht perfundierten Lungen von Mäusen, die gleichzeitig mit laxy transduzierten und nicht transduzierten kontrollierten und LM acht Zellen bei Mäusen injiziert wurden, die mit kontrolliert durchgeführten Zellen injiziert wurden.

Makroskopische und mikroskopische Metastasen blieben in nicht durchbluteten und perfundierten Lungen nicht nachweisbar. Interessanterweise zeigte die xgl-Färbung bei Mäusen, denen DUN-LA-Z-Zellen injiziert wurden, blaue Mikrometastasierungsherde von Einzelzellen oder kleinen Zellclustern auf der Oberfläche von nicht perfundierten Lungen in situ Perfusion und Fixierung der Lunge verbessern die Nachweisbarkeit von Dun-La-Z-Mikrometastasen weiter, jedoch wurde bei Mäusen, denen Kontroll-LM-Acht-Zellen transluzent wurden, kein Auswachsen zu makroskopischen Herden beobachtet. Kaum nachweisbare makrometastasierende Herde mit einem Durchmesser von mehr als 0,1 Millimetern wurden in nicht perfundierten Lungen erkannt. Die Perfusion der Lunge verbesserte die Detektion der Herde nicht.

Bei Mäusen, denen LAC Z-Zellen injiziert wurden, wurden jedoch mehrere X-Gal-gefärbte blaue Makrometastasen auf der Oberfläche von nicht perfundierten Organen nachgewiesen. Mikrometastasen wurden auch auf der Oberfläche von nicht durchbluteten Organen nachgewiesen. Darüber hinaus verbesserte die Perfusion der Lunge die Nachweisbarkeit von Makro- und Mikrometastasen weiter.

In der Folge wurden Mikro- und Makrometastasen mit einer höheren Dichte und einer größeren Anzahl sichtbar, was vor allem auf die Transluzenz des durchbluteten Gewebes zurückzuführen ist, in der auch Herde unter der Organoberfläche sichtbar wurden. Eine zusätzliche histologische Analyse mittels Kryoschnitten von Lungengewebe bestätigte die verbesserte Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bei Mäusen, denen LAX Z transduzierte Done und LM 8 Zellen injiziert wurden, bei Mäusen mit Primärtumoren, die von Dun LAX Z-Zellen abgeleitet wurden. In Lungenschnitten wurden Mikrometastasen oder sogar einzellige Herde erkannt.

Bei Mäusen mit Primärtumoren der jeweiligen Kontrollzellen wurde dies nicht beobachtet. Darüber hinaus waren Makrometastasen bei Mäusen, denen LM acht LA C-Zellen injiziert wurden, auch deutlicher sichtbar als bei Tieren mit der Kontrollzelle LM 8. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Lungenperfusion und -fixation in ZI two und die anschließende Exci-Färbung der Metastasen in der exzidierten Lunge durchgeführt werden.

Diese Technik ist ein hochempfindlicher Endpunkt, der für die Metastasenverteilung in der Lunge in jeder Art von Krebsstudie ausgelesen wird, und kann auch als Benchmark für die Verbesserung aktueller In-vivo-Bildgebungsverfahren wie Mikro-CT-PET und MRT dienen, die zur Früherkennung metastasierender Läsionen eingesetzt werden.