Name: Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte In-situ Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von LacZ-Tagged Tumor Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Erfahren Sie die verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Einzelzellauflösung in Mäusen durch kombinierte In-situ-Perfusion und X-Gal-Färbung von lacZ-markierten Tumorzellen.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lubor Borsig (Institut für Physiologie, Universität Zürich) für seine Ratschläge danken auf der Technik der Lungenperfusion. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Krebsliga des Kantons Zürich, der Walter L. und Johanna Wolf-Stiftung, Zürich, der Lydia Hochstrasser-Stiftung, Zürich, der Swiss National Science Foundation, SNF, der Schweiz, Schweizerischer Verein Balgrist und der Universität unterstützt Zürich.

1. In-situ Lung Perfusion und Fixation <ol><li> Anästhesieren Mäusen durch ip Injektion von ~ 150 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 112,5 mg / kg (Körpergewicht) Ketamin, 16,5 mg / kg Xylazin und 15 mg / kg Acepromazin (oder durch eine andere geeignete Anästhesie enthält Schmerzmittel). </li><li> Wenn Reflexe der Maus nicht mehr beobachtet werden, fixieren sie auf dem OP-Tisch zurück-down-und benetzen das Fell mit 70% Ethanol zu slick den Haaren nach unten. </li><li> Öffnen Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals und ziehen Sie sie an den Seiten oder entfernen. </li><li> Öffnen Sie das Bauchfell und den Brustkorb auf eine reichliche Größe. Verhindern von großen Brüchen Gefäße (zB die Vena jugularis) in reduzierter Effizienz der nachfolgende Perfusion vermeiden. </li><li> Schneiden Sie die Vena cava caudalis unter der Leber. </li><li> Verwenden eines 20-ml-Spritze mit einer 21G ausgestattet - 24G Nadel langsam 10-15 ml PBS in den rechten Ventrikel des schlagenden Herzens zu injizieren, bis die Lungen vollständig weiß unddas Herz aufhört zu schlagen (Asystolie). </li><li> Abkneifen die Blutgefäße der Leber und der Membran mit einer Gefäßklemme. </li><li> Eine 10 ml Spritze mit einer 21G ausgestattet - 24G Nadel auf ~ 2 ml 3% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in den rechten Ventrikel zu injizieren. </li><li> Entdecken Sie die Luftröhre außerhalb des Thorax. Verwenden das gleiche Spritze auf ~ 3 ml 3% PFA in PBS kraniale (außerhalb des Thorax) injizieren in die Trachea bis zur Lunge aufgeblasen wird. Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel, abkneifen die Luftröhre kaudalen der Punktion mit einer Gefäßklemme und für 10 min, um die Fixierung zu ermöglichen. </li><li> Durchschneiden die Blutgefäße oberhalb der Gefäßklemme, entfernen die Klemme und injizieren ~ 2 ml PBS in die rechte Herzkammer, um überschüssiges PFA entfernen. </li><li> Punktieren der unteren Teile aller Lungenlappen mit einer Nadel, entfernen die Gefäßklemme an der Trachea und injizieren 3-5 ml einer Lösung von PolyFreeze Einbettungsmedium / PBS 1:1 in der Luftröhre kaudalen des ersten Punktion bis PFA in der LungeLappen durch die Lösung ersetzt. </li><li> Entfernen Sie die Lunge sorgfältig, indem das Herz mit einer Pinzette und durch Durchschneiden des Bindegewebes Bändern, Blutgefäßen und der Luftröhre. Halten Sie das Herz an der Lunge. </li><li> Je nachdem, wie mit dem Lungengewebe Analyse gehen mit den Protokollen in den Abschnitten 2 und 3 beschrieben fortsetzen. Wenn Sie beide Analysen durchführen möchten, entfernen Sie ein Lungenlappen und wie unter 3 beschrieben. Verarbeiten Sie die verbleibenden Lappen mit dem Herzen wie unter Punkt 2 beschrieben. </li></ol> 2. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Entire Lungenlappen <ol><li> Legen Sie die Lunge in einen Plastikbecher mit engen schließenden Deckel aufsetzen und mit 2% Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30-60 min. </li><li> Entfernen Fixierungslösung und gründlich 3-mal mit PBS. </li><li> Hinzufügen mindestens 10 ml frisch hergestellte 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) Färbelösung (X-Gal Stammlösung [40 mg / ml inDimethylformamid] 1:40 verdünnt in Basic Färbelösung; pH 7,1 (Tabelle 1); vor Licht schützen). </li><li> Legen Sie ein Stück Gaze auf der Oberseite des Swimming Lungen, um es vollständig zu halten in der Lösung und setzen Sie den Deckel nur lose auf dem Topf, den Austausch von Luft zu ermöglichen. </li><li> Inkubation bei 37 ° C für 3-5 Stunden vor Licht geschützt. </li><li> Entfernen X-Gal-Lösung, einmal mit PBS spülen, um restliches X-Gal-Lösung (optional) entfernen und 4% PFA. </li></ol> 3. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Lung Kryoschnitte <ol><li> Vorfüll ein markiertes Einbettform bis 1/3 mit unverdünntem PolyFreeze Einbettungsmedium. Legen Sie die Lungenlappen oben und füllen sich mit Einbettmedium bis der Lappen vollständig bedeckt ist. Versuchen Sie, um Blasen zu verhindern. </li><li> Inkubieren der eingebetteten Lungen bei 4 ° C für 20 min. </li><li> Dann frieren die eingebettete Lunge langsam in einer Mischung aus Trockeneis und Isopentan und bei -80 ° C. </li><li> Cut 7-10 um KryoAbschnitte auf einem Kryostaten und montieren sie auf SuperFrostPlus Objektträger. </li><li> Inkubiere die Abschnitte sofort mit X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer. </li><li> Spülen Sie die Objektträger in PBS 2 mal für 5 min und dann kurz in destilliertem Wasser. </li><li> Counter-Fleck mit Kernechtrot für 10-30 sec gründlich in destilliertem Wasser und montieren Sie die Folien mit Immu-Mount. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Asai et al. Im ursprünglichen Artikel auf der Dunn-OS abgeleiteten LM8 Mausmodell dass sc Primärtumoren von den parentalen Dunn Zellen abgeleitet, die sich von denen aus der hoch metastatischen LM8 Sub-Zelllinie abgeleitet sind, nicht spontan bilden nachweisbare Lungenmetastasen in gemeldet syngenen C3H Mäusen 14. Mit den hier berichteten Techniken, untersuchten wir die Bildung von Metastasen in den Dunn/LM8 Maus OS-Modelle. Wir nutzten stabile lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zelles und eines Protokolls für in-situ Lungenperfusion und Fixierung in Mäusen. Repräsentative Bilder perfundierten und nicht-perfundierten Lungen von Mäusen subkutan injiziert mit lacZ-transduzierten und nicht-transduzierten Steuerung Dunn und LM8 Zellen in Abbildung 1 gezeigt. In Mäusen, die mit Zellen injiziert Steuerung Dunn blieb makroskopischen und mikroskopischen Metastasen in nicht nachweisbar nicht perfundierten und perfundierten Lunge (1A, i-iv). Aber interessanterweise in Mäusen mit Dunn-lacZ-Zellen injiziert, offenbarte X-gal-Färbung blauen mikrometastatischen Foci von Einzelzellen oder kleinen Zellaggregaten (&lt;0,1 mm) auf der Oberfläche des nicht-perfundierten Lunge (Abbildung 1A, vi). Im situ Perfusion und Fixierung der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Dunn-lacZ Mikrometastasen (1A, viii). Jedoch wurde Auswuchs auf makroskopische Foci nicht beobachtet (Abbildung 1A, V, VII). &lt;/ P&gt; Bei Mäusen mit Steuerung LM8 Zellen, transluzent, kaum nachweisbar macrometastatic Foci injiziert größer als 0,1 mm Durchmesser wurden im nicht-perfundierten Lunge (1B, i) erfasst. Perfusion der Lunge (1B, iii) nicht verbessert die Erkennung der Brennpunkte. Jedoch in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen injiziert mehrere X-Gal blau gefärbt makro-(1B, v) und Mikrometastasen (1B, vi) wurden auf der Oberfläche von nicht-perfundierten Organen detektiert. Darüber hinaus Perfusion der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Makro-und Mikrometastasen (Abbildung 1B, VII - VIII). Folglich wurde der Mikro-und sichtbaren Makrometastasen bei einer höheren Dichte und einer größeren Anzahl, hauptsächlich aufgrund der Durchsichtigkeit des perfundierten Gewebe, in dem Brennpunkte unterhalb der Organoberfläche wurde ebenfalls sichtbar. Ein zusätzlicher histological Analyse mit Gefrierschnitten des Lungengewebes bestätigt die verbesserte Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bei Mäusen mit lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zellen injiziert. Bei Mäusen mit Primärtumoren von Dunn-lacZ oder lacZ LM8-Zellen abgeleitet wurden im Gegensatz zu Mäusen, die mit primären Tumoren der jeweiligen Kontrollzellen, Mikrometastasen oder sogar einzelne Zellfoci in Lungenschnitten (Abbildung 2) erfasst. Darüber hinaus waren auch Makrometastasen deutlicher sichtbar in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen als bei Tieren mit der Steuerung LM8 Zellen (2C, D) injiziert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Abbildung 1. Nachweis von spontanen Metastasen von nicht-transduzierten (i-iv) und lacZ-transduzierten (v-viii) Dunn (A) und LM8 (B) Zellen im nicht-perfundierten (i, ii, v, vi) und perfundierten (iii, iv, vii, viii) Lungen in C3H-Mäusen. Metastasen in repräsentativen X-Gal-stained ganzen Lunge (v, vii in A und B) und die entsprechenden Nahaufnahmen (vi, viii in A und B) blau erscheinen. Macrometastatic Brennpunkte (&gt; 0,1 mm) in den Organen von Mäusen mit nicht-markierten Zellen LM8 (i-iv in B) eingespritzt sind durch Sternchen gekennzeichnet. Bereiche, in Nahaufnahmen sind repräsentativ für die gesamte Lunge. Maßstab Balken zeigen 1 mm in Bildern ganzer Lunge und 0,1 mm in Nahaufnahmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Abbildung 2. Erkennung von Dunn und LM8 Mikrometastasen in der Lunge Kryoschnitten. Abschnitte von OCT eingebettet Lungengewebe wurden in X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer inkubiert und dann gegengefärbt mit Kernechtrot. Pfeile zeigen auf mikrometastatischen Foci in Lungenschnitten von Mäusen mit Dunn-lacZ (B) oder LM8-lacZ-Zellen (D) eingespritzt erfasst. Micrometastases blieb nicht nachweisbar in Lungenschnitten von Mäusen mit nicht-transduzierten Dunn (A) oder LM8 Zellen (C) injiziert. Maßstab Balken zeigen 0,1 mm.

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<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li>
<li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellten Ergebnisse im Dunn/LM8 Maus OS Modells demonstrieren die Macht des neu gegründeten Methode, die die X-Gal-Färbung von lacZ-markierten Tumorzellen mit in-situ Perfusion / Fixierung von Lungengewebe kombiniert. Diese Kombination der beiden Techniken ermöglicht eine hohe Empfindlichkeit Nachweis von Mikrometastasen Läsionen bis zum einzelnen Zellebene und verbessert auch die Visualisierung von Makrometastasen auf der Lungenoberfläche (Abbildung 1) als auch in der Lunge Abschnitten (Abbildung 2). Während die X-Gal-Färbung ermöglicht auch die Detektion von (Mikro-) Metastasen in anderen Organen, in-situ-Perfusion / Fixierung verbessert die Erkennbarkeit der metastatischen Foci in anderen Geweben als der Lunge nur leicht aufgrund der natürlichen Blut-und Gewebe-bezogene Farbe 13 dieser Organe. Selbst wenn die Perfusion einem anderen Organ gerichtet ist, zB der Leber, wären Entfernung des Blutes nur teilweise Verbesserung des Kontrasts Wetteschen X-Gal-Färbung und die natürliche Farbe des Organs. Jedoch ist das Verfahren anwendbar auf jede Art von lacZ-markierten Tumorzellen ist, wird die Gewinnung und Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bis auf die Ebene der ruhenden einzelligen Mikrometastasen und ermöglicht eine einfache und zuverlässige Quantifizierung von Makro-und Mikrometastasen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens und alle anderen Techniken, die auf Reportergenen, einschließlich Luciferase und fluoreszierende Proteine, bezogen sind, ist die Stabilität der Transgen-Expression. Wie in 2d gezeigt ist, werden nicht alle Tumorzellen innerhalb der Herde macrometastatic blau gefärbt, was auf ein Fehlen von beta-Galactosidase-Aktivität. Das könnte im Zusammenhang mit Nekrose, aber es ist wahrscheinlicher, auf einen Verlust der Transgenexpression. Wir beobachteten, dass die Dunn und LM8 Zellen sehr wirksam bei der Herabregulierung von lacZ und andere Transgene auch unter kontinuierlicher Selektion auf Expression sind. Deshalb schaltet in neueren Studien der murinen K12und K7M2 und die menschlichen HOS, 143B und Saos-2 Osteosarcom-Zelllinien, die alle stabil lacZ-Expression in vitro als auch in vivo bis zu 100% der Zeit beibehalten wird. Sobald stabile lacZ-Expression garantiert wird, kann diese Technik in Studien mit genmanipulierte Tumorzellen, zB um mechanistisch untersuchen den Prozess des Gewebes Kolonisierung 13 sowie für die Entwicklung und Erprobung neuer Therapien dem Ziel Tilgung der metastatischen Läsionen 15 angelegt werden , 16. Weiterhin kann als Richtwert für die Verbesserung des aktuellen radiologischen Bildgebung, wie PET, (Mikro-) CT-und MRI, für die frühe Erkennung des metastatischen Läsionen verwendet dienen. In einer kürzlich durchgeführten Studie PET (unveröffentlicht) mit unterschiedlichen Tracer wir überprüft die in vivo nachgewiesen Lungenmetastasen anschließend ex vivo mit dem beschriebenen Protokoll. In einer laufenden Studie mit einem neuen Kleintier Mikro-CT (SkyScan) sind wir so weit able, um Lungenmetastasen in vivo nachzuweisen bis zu einer Größe von 0,5 mm und ex vivo bis zu 0,3 mm, aber wir wollen mit einer Auflösung von 0,1 mm. Interessanterweise ist dies die maximale Größe, die wir zu unterscheiden Makro-von Mikrometastasen mit dem kombinierten Verfahren der in-situ Perfusion und X-Gal-Färbung eingestellt. Dies unterstreicht erneut die Empfindlichkeit und die Nützlichkeit dieses einfache und kostengünstige Technik.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Narketan10 (Ketamin) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Xylazin (Xylazin) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Prequilan (Acepromazin) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Bulldog Typ Serrefine Gefäßklemme </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18051-35 </td><td> gekrümmten, 35 mm </td></tr><tr><td> Plastikbecher mit Deckel </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml Becher mit Deckel </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal); Pulver </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> lösen sich in N, N-Di-Methylformamid bis 40 mg / ml, Lagerung Licht geschützt bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Grundlegende Färbelösung, äquilibriert auf pH 7,1, gelagert Licht geschützt bei 4 ° C für max. 1 Monat </td><td> selbst gemacht </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% Natrium-Desoxycholat </td></tr><tr><td> PolyFreeze Embedding Medium </td><td> Polysciences; Schweizer Vertrieb: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Einbettform </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 Kryostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost Dias </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear-Fast Red - Aluminium-Sulfat-Lösung </td><td> Abteilung Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, Schweizer Vertrieb: HistoCom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung.

verbesserte visualisierung von lungenmetastasen bei single cell auflösung in mäusen durch kombinierte<em&gt; in-situ</em&gt; perfusion des lungengewebes und x-gal färbung von<em&gt; lacz</em&gt;-tagged tumor cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasierung ist die häufigste Todesursache in den meisten Krebsarten und daher ein Schwerpunkt in der Krebsforschung. Allerdings bleiben die Detektion von Mikrometastasen durch radiologische Bildgebung und dem Erfolg in ihrer therapeutischen Tilgung begrenzt. Während Tiermodellen erwiesen haben unschätzbare Werkzeuge für die Krebsforschung 1 sein, bleibt die Überwachung / Visualisierung von Mikrometastasen eine Herausforderung und ungenaue Auswertung der Metastasierung in präklinischen Studien möglicherweise zu enttäuschenden Ergebnissen in klinischen Studien 2. Folglich besteht ein großes Interesse bei der Verfeinerung der Methoden, um endlich zu reproduzierbaren und zuverlässigen Nachweis von Metastasen bis in die einzelne Zelle Ebene in normalem Gewebe. Das Hauptaugenmerk liegt daher auf Techniken, die den Nachweis von Tumorzellen in vivo zu ermöglichen, wie Mikro-Computer-Tomographie (Mikro-CT), Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Biolumineszenz oder Fluoreszenzabbildung &lt;sup&gt; 3,4. Wir derzeit Optimierung dieser Techniken zur in vivo Überwachung des primären Tumorwachstum und Metastasierung in verschiedenen Modellen Osteosarkom. Einige dieser Techniken können auch für die ex vivo-Analyse von Metastasen neben klassischen Methoden wie qPCR 5, 6 oder FACS verschiedenen histologischen Färbung verwendet werden. Als Maßstab haben wir in der vorliegenden Studie stellte die stabile Transfektion oder Transduktion der Tumorzellen mit dem lacZ Gen, das das bakterielle Enzym β-Galactosidase, die das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D metabolisiert -galactopyranosid (X-Gal) an einen unlöslichen Farbstoff Indigoblau 7 und ermöglicht hochempfindlichen und selektiven histochemische Färbung der Tumorzellen in der Maus Gewebe ex vivo auf der einzigen Zelle Ebene wie hier dargestellt. Dies ist ein Low-Cost-und nicht Geräte-intensive Werkzeug, das eine präzise Validierung von Metastasen 8 in Studien, in denen neue ein ermöglichtticancer Therapien 9-11. Ein limitierender Faktor X-gal-Färbung ist die geringe Unterschied zu blutsverwandten rote Färbung von gut vaskularisierten Geweben wie zB. Im Lungengewebe kann dieses Problem durch in-situ Lungenperfusion, eine Technik, die vor kurzem von Borsig et al. 12, der die Lungen von Mäusen unter Narkose perfundiert, um sie aus dem Blut zu löschen und zu fixieren und diese in-situ unter etabliert gelöst werden Inflation durch die Luftröhre. Diese Methode verhindert auch den Zusammenbruch der Lunge und hält dadurch die Morphologie der funktionellen Lungenalveolen, die die Qualität des Gewebes für die histologische Analyse verbessert. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein neues Protokoll, das ausnutzt einer Kombination von X-gal-Färbung von lacZ-exprimierenden Tumorzellen und in-situ-Perfusion und Fixierung von Lungengewebe. Dieses elegante Protokoll ermöglicht hochempfindliche Nachweis von einzelnen metastatischen Zellen in der Lunge und es uns ermöglicht, in einer aktuellen Studie zu derwähle &quot;ruhend&quot; Lunge Mikrometastasen in einem Maus-Modell 13, die ursprünglich beschrieben wurde als nicht-metastasiertem 14.

Das erfindungsgemäße Protokoll in der vorliegenden Studie berichtet ermöglicht selektiven Nachweis von Lungenmetastasen in einzelne Zelle Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Lungenperfusion und Fixierung und X-Gal-Färbung von<em&gt; LacZ</emTumorzellen&gt;-Tag.

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Metastasierung ist die Haupttodesursache bei der Mehrheit der Krebsarten und folglich ein zentraler Schwerpunkt in der Krebsforschung. Die Detektion von ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Detektion von Mikrometastasen in der ex vivo behandelten Mauslunge zu verbessern, wobei die aufgeblähte Lungenarchitektur erhalten bleiben soll. Dies wird erreicht, indem die Lunge zunächst in situ mit PBS perfundiert wird, um das Blut zu entfernen, das die Hauptquelle für die Farbhintergrundfärbung in diesem Gewebe darstellt. Die nächsten Schritte bestehen darin, die Lunge durch Injektion von PFA aufzublasen und anschließend abzuklemmen, um das Lungengewebe in aufgeblähtem Zustand zu fixieren.Anschließend wird die Lunge entfernt und entweder in PFA nachfixiert oder einzelne Lungenlappen für die Kryoschnitteinbettung aufbereitet. Die abschließenden Schritte bestehen darin, die Gewebe in Xal-Lösung zu färben und die LA zag Tumorzellen schließlich sichtbar zu machen, sodass Metastasen an gesamten Lungenlappen oder in Lungen-gewebsschnitten bis auf Einzelzellniveau mit einem Binokularmikroskop oder einem Lichtmikroskop nachgewiesen werden können. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wie dem sky standing on its own liegt darin, dass die Nachweisbarkeit von Mikrometastasen durch die Entfernung des blutbedingten Hintergrunds erheblich verbessert wird.Beginnen Sie das Protokoll, indem Sie eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin, Xylazin und Acepromazin in etwa 150 µL PBS betäuben. Wenn bei der Maus keine Schmerzreflexe mehr feststellbar sind, fixieren Sie sie auf dem Operationstisch. Rasieren Sie den Bereich rückwärts und glätten Sie das Fell mit 70 %igem Ethanol.Öffnen Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals. Ziehen Sie die Haut zur Seite oder entfernen Sie sie. Öffnen Sie vorsichtig das Peritoneum im Thorax, um das Durchtrennen großer Gefäße wie der Vena jugularis zu vermeiden.Dadurch wird die Effizienz der Perfusion verbessert. Schneiden Sie nun die Vena cava cardis unterhalb der Leber mit einer 20-Milliliter-Spritze und einer Nadel der Größe 21 bis 24 Gauge durch. Injizieren Sie langsam 10 bis 15 Milliliter PBS in den rechten Ventrikel des schlagenden Herzens, bis die Lunge vollständig weiß ist und das Herz aufhört zu schlagen.Drücken Sie dann die Blutgefäße oberhalb der Leber und des Zwerchfells mit einer vaskulären Klemme ab. Füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit 3 % Paraformaldehyd und spritzen Sie mit einer Nadel der Größe 21 bis 24 Gauge etwa zwei Milliliter in das rechte Ventrikel.Freilegen Sie die Trachea außerhalb des Thorax und blasen Sie die Lunge auf, indem Sie von außerhalb des Thorax etwa drei Milliliter Aldehyd in die Trachea injizieren. Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel klemmen Sie die Trachea direkt an der Einstichstelle mit einer vaskulären Klemme ab und warten Sie 10 Minuten, um die Fixierung zu ermöglichen. Anschließend durchtrennen Sie die Blutgefäße oberhalb der vaskulären Klemme.Entfernen Sie dann die Klemme und injizieren Sie etwa zwei Milliliter PBS in das rechte Ventrikel, um überschüssiges Puffer-Formaldehyd zu entfernen. Stich mit einer Nadel in die unteren Abschnitte aller Lungenlappen und entfernen Sie die vaskuläre Klemme an der Trachea. Injizieren Sie nun drei bis fünf Milliliter verdünnte Einbettungslösung in die Trachea, wobei die Injektion der vorherigen nachempfunden wird.Stoppen Sie die Injektion, sobald der Paraform in den Lungenlappen durch die Lösung ersetzt wurde. Entfernen Sie die Lunge vorsichtig, indem Sie mit einer Pinzette am Herzen ziehen und die Bindegewebsbänder, Blutgefäße und die Luftröhre durchtrennen. Achten Sie darauf, dass das Herz mit den Lungen verbunden bleibt.Stellen Sie ein Läppchen für Kryoschnitte beiseite und verwenden Sie das verbleibende Lungengewebe für die Ganzorgan-Färbung. Geben Sie die Lunge in einen Plastikbecher mit dicht schließendem Deckel und fixieren Sie sie mit 2 % Formaldehyd in PBS. Legen Sie ein Stück Gaze auf die Lunge, um sie in der Lösung zu halten, und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen.Nach einer halben Stunde die Fixierungslösung entfernen und das Gewebe gründlich dreimal mit PBS waschen. Die gebrauchsfertige Xal-Lösung frisch herstellen, indem man einen Milliliter Xal-Stammlösung 1:40 in der grundlegenden Färbungslösung verdünnt, und mindestens 10 Milliliter davon in das Gefäß geben. Die Lunge mit einem Stück Mullbinde unter Flüssigkeit tauchen. Den Deckel locker befestigen, um den Luftaustausch zu ermöglichen, und bei 37 Grad Celsius drei bis fünf Stunden im Dunkeln inkubieren.Nach der Inkubation die Xal-Lösung entfernen. Die Lungen einmal mit PBS spülen, um restliche Xal-Lösung zu entfernen, und mindestens 10 Milliliter 4 % Paraformaldehyd in PBS hinzufügen. Das Gewebe ist nun bereit für die Histologie und kann langfristig in 4 % PFA bei vier Grad Celsius gelagert werden.Füllen Sie zunächst ein Drittel einer Einbettform mit unverdünntem Poly-Forze-Einbettmedium. Anschließend wird das Lungenlappen in die Form gegeben und weiteres Medium hinzugefügt, bis der Lappen vollständig bedeckt ist. Vermeiden Sie sorgfältig die Bildung von Luftblasen und inkubieren Sie den eingebetteten Lappen dann bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.Bereiten Sie als Nächstes die eingebetteten Lungen zum Schneiden vor, indem Sie sie langsam in einer Mischung aus Trockeneis und Isopentan einfrieren. Bei Bedarf können sie nun zur Lagerung in einen minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank überführt werden. Schneiden Sie am Kryostaten sieben bis zehn Mikrometer dicke Kryoschnitte des Lappens und montieren Sie die Schnitte auf handelsübliche Kryoschnittrutschen. Nach dem Aufbringen inkubieren Sie die Schnitte unverzüglich 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer Xal-Färbungslösung in einer befeuchteten Kammer. Am folgenden Tag spülen Sie die Objektträger zweimal mit PBS, jeweils fünf Minuten pro Spülgang.Danach eine kurze Spülung mit destilliertem Wasser durchführen. Anschließend die Objektträger mit Nuclear Fast Red für 10 Sekunden kontrastfärben, um eine schwache Gegengegenfärbung zu erzielen, wodurch das Xal stärker hervortritt, und die Gegengegenfärbung unmittelbar mit destilliertem Wasser abspülen. Für eine intensivere Gegengegenfärbung die Färbezeit auf bis zu 30 Sekunden oder länger verlängern.Die Objektträger mit Immuno Mount eindecken. Die Bildung von Metastasen in den behandelten LM acht Maus-OS-Modellen wurde erneut untersucht. Unter Verwendung der hier beschriebenen repräsentativen Bilder von perfundierten und nicht perfundierten Lungen von Mäusen, die gleichzeitig mit laxy-transduzierten und nicht-transduzierten kontrollierten behandelten und LM acht Zellen sowie mit kontrollierten behandelten Zellen injiziert wurden.Makroskopische und mikroskopische Metastasen blieben in nicht perfundierten und perfundierten Lungen nachweisbar. Doch interessanterweise zeigte bei Mäusen, die mit Dun LA Z-Zellen injiziert worden waren, die Xgl-Färbung blaue mikrometastatische Herde aus Einzelzellen oder kleinen Zellclustern auf der Oberfläche der nicht perfundierten Lungen. Eine in-situ-Perfusion und Fixation der Lungen verbesserte die Nachweisbarkeit der Dun LA Z-Mikrometastasen weiter, das Wachstum zu makroskopischen Herden wurde jedoch bei Mäusen, die mit Kontroll-LM-acht-Zellen injiziert worden waren, nicht beobachtet. Durchscheinende, kaum erkennbare makrometastatische Herde mit einem Durchmesser von mehr als 0,1 Millimeter wurden in nicht perfundierten Lungen erkannt. Die Perfusion der Lunge verbesserte die Detektion dieser Herde nicht.Jedoch wurden bei Mäusen, die mit ate LAC Z-Zellen injiziert worden waren, mehrere X-gal-gefärbte blaue makroskopische Metastasen auf der Oberfläche nicht perfundierter Organe nachgewiesen. Mikroskopische Metastasen wurden ebenfalls auf der Oberfläche nicht perfundierter Organe detektiert. Darüber hinaus verbesserte die Perfusión der Lungen die Nachweisbarkeit sowohl makroskopischer als auch mikroskopischer Metastasen weiter.Dadurch wurden Mikro- und Makrometastasen mit höherer Dichte und überwiegend in größerer Zahl sichtbar, hauptsächlich aufgrund der Durchsichtigkeit des perfundierten Gewebes, wodurch auch Herde unterhalb der Organoberfläche sichtbar wurden. Eine zusätzliche histologische Analyse unter Verwendung von Kryoschnitten des Lungengewebes bestätigte die verbesserte Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bei Mäusen, die mit LAX Z-transduzierten D1 und LM8-Zellen sowie bei Mäusen mit Primärtumoren, die von Dun LAX Z-Zellen abstammten, injiziert worden waren. Mikrometastasen oder sogar Einzelzellherde wurden in Lungschnitten erkannt.Dies wurde bei Mäusen mit primären Tumoren der jeweiligen Kontrollzellen nicht beobachtet. Darüber hinaus waren Makrometastasen bei Mäusen, die mit LM acht LA C-Zellen injiziert wurden, deutlicher sichtbar als bei Tieren mit den Kontroll-LM-acht-Zellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Lungenperfusion und -fixierung in ZI zwei sowie die anschließende Exzi-Färbung der Metastasen in den entnommenen Lungen durchführt.Diese Technik stellt eine äußerst empfindliche Endpunktanalyse für die Metastasenverteilung in der Lunge in jeder Art von Krebsstudie dar und kann zudem als Referenz dienen, um die derzeitigen in-vivo-Bildgebungsverfahren wie Mikro-CT, PET und MRT, die zur Früherkennung metastatischer Läsionen eingesetzt werden, zu verbessern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf...

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen.

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Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Einem Tiermodell wird benötigt, um die Rolle der zirkulierende Tumorzellen (CTC) bei der Förderung der Lunge Kolonisation in Krebsmetastasen zu entschlüsseln. Hier wir etabliert und erfolgreich durchgeführt eine in Vivo assay, speziell Test das Erfordernis der Polymeren Fibronektin (PolyFN) Montage auf CTCs zur Besiedlung der Lunge.

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Wir beschreiben ein Xenotransplantat-Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen, die durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten entzündlichen Brustkrebszelllinie erzeugt werden.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Hier stellen wir ein Protokoll zur operativen Implantation eines dauerhaft verweilbaren optischen Fensters für den murinen Thorax vor, das eine hochauflösende, intravitale Bildgebung der Lunge ermöglicht. Die Permanenz des Fensters macht es gut geeignet für die Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse in der Lunge, insbesondere solcher, die sich langsam entwickeln, wie z.B. das metastatische Fortschreiten von disseminierten Tumorzellen.

Ein permanentes Fenster zur Untersuchung von Krebsmetastasen in der Lunge

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Eine große Herausforderung bei der Entwicklung neuer Therapien für Lungenkrebs besteht darin, die Mikroumgebung des Tumors zu modellieren, wenn die regionale Erkrankung zu einer metastasierenden Erkrankung fortschreitet. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Etablierung eines orthotopen syngenen Modells von Lungenkrebs, das eine In-vivo-Verfolgung der Krankheit im Zeitverlauf ermöglicht.

Eine minimalinvasive Methode zur Generierung eines syngenen orthotopen Mausmodells für Lungenkrebs

Erfahren Sie die verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Einzelzellauflösung in Mäusen durch kombinierte In-situ-Perfusion und X-Gal-Färbung von lacZ-markierten Tumorzellen.

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte In-situ Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von LacZ-Tagged Tumor Cells (Video) | JoVE Journal

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte

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