Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Detektion von Mikrometastasen in der ex vivo behandelten Mauslunge zu verbessern, wobei die aufgeblähte Lungenarchitektur erhalten bleiben soll. Dies wird erreicht, indem die Lunge zunächst in situ mit PBS perfundiert wird, um das Blut zu entfernen, das die Hauptquelle für die Farbhintergrundfärbung in diesem Gewebe darstellt. Die nächsten Schritte bestehen darin, die Lunge durch Injektion von PFA aufzublasen und anschließend abzuklemmen, um das Lungengewebe in aufgeblähtem Zustand zu fixieren.

Anschließend wird die Lunge entfernt und entweder in PFA nachfixiert oder einzelne Lungenlappen für die Kryoschnitteinbettung aufbereitet. Die abschließenden Schritte bestehen darin, die Gewebe in Xal-Lösung zu färben und die LA zag Tumorzellen schließlich sichtbar zu machen, sodass Metastasen an gesamten Lungenlappen oder in Lungen-gewebsschnitten bis auf Einzelzellniveau mit einem Binokularmikroskop oder einem Lichtmikroskop nachgewiesen werden können. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wie dem sky standing on its own liegt darin, dass die Nachweisbarkeit von Mikrometastasen durch die Entfernung des blutbedingten Hintergrunds erheblich verbessert wird.

Beginnen Sie das Protokoll, indem Sie eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin, Xylazin und Acepromazin in etwa 150 µL PBS betäuben. Wenn bei der Maus keine Schmerzreflexe mehr feststellbar sind, fixieren Sie sie auf dem Operationstisch. Rasieren Sie den Bereich rückwärts und glätten Sie das Fell mit 70 %igem Ethanol.

Öffnen Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals. Ziehen Sie die Haut zur Seite oder entfernen Sie sie. Öffnen Sie vorsichtig das Peritoneum im Thorax, um das Durchtrennen großer Gefäße wie der Vena jugularis zu vermeiden.

Dadurch wird die Effizienz der Perfusion verbessert. Schneiden Sie nun die Vena cava cardis unterhalb der Leber mit einer 20-Milliliter-Spritze und einer Nadel der Größe 21 bis 24 Gauge durch. Injizieren Sie langsam 10 bis 15 Milliliter PBS in den rechten Ventrikel des schlagenden Herzens, bis die Lunge vollständig weiß ist und das Herz aufhört zu schlagen.

Drücken Sie dann die Blutgefäße oberhalb der Leber und des Zwerchfells mit einer vaskulären Klemme ab. Füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit 3 % Paraformaldehyd und spritzen Sie mit einer Nadel der Größe 21 bis 24 Gauge etwa zwei Milliliter in das rechte Ventrikel.

Freilegen Sie die Trachea außerhalb des Thorax und blasen Sie die Lunge auf, indem Sie von außerhalb des Thorax etwa drei Milliliter Aldehyd in die Trachea injizieren. Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel klemmen Sie die Trachea direkt an der Einstichstelle mit einer vaskulären Klemme ab und warten Sie 10 Minuten, um die Fixierung zu ermöglichen. Anschließend durchtrennen Sie die Blutgefäße oberhalb der vaskulären Klemme.

Entfernen Sie dann die Klemme und injizieren Sie etwa zwei Milliliter PBS in das rechte Ventrikel, um überschüssiges Puffer-Formaldehyd zu entfernen. Stich mit einer Nadel in die unteren Abschnitte aller Lungenlappen und entfernen Sie die vaskuläre Klemme an der Trachea. Injizieren Sie nun drei bis fünf Milliliter verdünnte Einbettungslösung in die Trachea, wobei die Injektion der vorherigen nachempfunden wird.

Stoppen Sie die Injektion, sobald der Paraform in den Lungenlappen durch die Lösung ersetzt wurde. Entfernen Sie die Lunge vorsichtig, indem Sie mit einer Pinzette am Herzen ziehen und die Bindegewebsbänder, Blutgefäße und die Luftröhre durchtrennen. Achten Sie darauf, dass das Herz mit den Lungen verbunden bleibt.

Stellen Sie ein Läppchen für Kryoschnitte beiseite und verwenden Sie das verbleibende Lungengewebe für die Ganzorgan-Färbung. Geben Sie die Lunge in einen Plastikbecher mit dicht schließendem Deckel und fixieren Sie sie mit 2 % Formaldehyd in PBS. Legen Sie ein Stück Gaze auf die Lunge, um sie in der Lösung zu halten, und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Nach einer halben Stunde die Fixierungslösung entfernen und das Gewebe gründlich dreimal mit PBS waschen. Die gebrauchsfertige Xal-Lösung frisch herstellen, indem man einen Milliliter Xal-Stammlösung 1:40 in der grundlegenden Färbungslösung verdünnt, und mindestens 10 Milliliter davon in das Gefäß geben. Die Lunge mit einem Stück Mullbinde unter Flüssigkeit tauchen. Den Deckel locker befestigen, um den Luftaustausch zu ermöglichen, und bei 37 Grad Celsius drei bis fünf Stunden im Dunkeln inkubieren.

Nach der Inkubation die Xal-Lösung entfernen. Die Lungen einmal mit PBS spülen, um restliche Xal-Lösung zu entfernen, und mindestens 10 Milliliter 4 % Paraformaldehyd in PBS hinzufügen. Das Gewebe ist nun bereit für die Histologie und kann langfristig in 4 % PFA bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Füllen Sie zunächst ein Drittel einer Einbettform mit unverdünntem Poly-Forze-Einbettmedium. Anschließend wird das Lungenlappen in die Form gegeben und weiteres Medium hinzugefügt, bis der Lappen vollständig bedeckt ist. Vermeiden Sie sorgfältig die Bildung von Luftblasen und inkubieren Sie den eingebetteten Lappen dann bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.

Bereiten Sie als Nächstes die eingebetteten Lungen zum Schneiden vor, indem Sie sie langsam in einer Mischung aus Trockeneis und Isopentan einfrieren. Bei Bedarf können sie nun zur Lagerung in einen minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank überführt werden. Schneiden Sie am Kryostaten sieben bis zehn Mikrometer dicke Kryoschnitte des Lappens und montieren Sie die Schnitte auf handelsübliche Kryoschnittrutschen. Nach dem Aufbringen inkubieren Sie die Schnitte unverzüglich 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer Xal-Färbungslösung in einer befeuchteten Kammer. Am folgenden Tag spülen Sie die Objektträger zweimal mit PBS, jeweils fünf Minuten pro Spülgang.

Danach eine kurze Spülung mit destilliertem Wasser durchführen. Anschließend die Objektträger mit Nuclear Fast Red für 10 Sekunden kontrastfärben, um eine schwache Gegengegenfärbung zu erzielen, wodurch das Xal stärker hervortritt, und die Gegengegenfärbung unmittelbar mit destilliertem Wasser abspülen. Für eine intensivere Gegengegenfärbung die Färbezeit auf bis zu 30 Sekunden oder länger verlängern.

Die Objektträger mit Immuno Mount eindecken. Die Bildung von Metastasen in den behandelten LM acht Maus-OS-Modellen wurde erneut untersucht. Unter Verwendung der hier beschriebenen repräsentativen Bilder von perfundierten und nicht perfundierten Lungen von Mäusen, die gleichzeitig mit laxy-transduzierten und nicht-transduzierten kontrollierten behandelten und LM acht Zellen sowie mit kontrollierten behandelten Zellen injiziert wurden.

Makroskopische und mikroskopische Metastasen blieben in nicht perfundierten und perfundierten Lungen nachweisbar. Doch interessanterweise zeigte bei Mäusen, die mit Dun LA Z-Zellen injiziert worden waren, die Xgl-Färbung blaue mikrometastatische Herde aus Einzelzellen oder kleinen Zellclustern auf der Oberfläche der nicht perfundierten Lungen. Eine in-situ-Perfusion und Fixation der Lungen verbesserte die Nachweisbarkeit der Dun LA Z-Mikrometastasen weiter, das Wachstum zu makroskopischen Herden wurde jedoch bei Mäusen, die mit Kontroll-LM-acht-Zellen injiziert worden waren, nicht beobachtet. Durchscheinende, kaum erkennbare makrometastatische Herde mit einem Durchmesser von mehr als 0,1 Millimeter wurden in nicht perfundierten Lungen erkannt. Die Perfusion der Lunge verbesserte die Detektion dieser Herde nicht.

Jedoch wurden bei Mäusen, die mit ate LAC Z-Zellen injiziert worden waren, mehrere X-gal-gefärbte blaue makroskopische Metastasen auf der Oberfläche nicht perfundierter Organe nachgewiesen. Mikroskopische Metastasen wurden ebenfalls auf der Oberfläche nicht perfundierter Organe detektiert. Darüber hinaus verbesserte die Perfusión der Lungen die Nachweisbarkeit sowohl makroskopischer als auch mikroskopischer Metastasen weiter.

Dadurch wurden Mikro- und Makrometastasen mit höherer Dichte und überwiegend in größerer Zahl sichtbar, hauptsächlich aufgrund der Durchsichtigkeit des perfundierten Gewebes, wodurch auch Herde unterhalb der Organoberfläche sichtbar wurden. Eine zusätzliche histologische Analyse unter Verwendung von Kryoschnitten des Lungengewebes bestätigte die verbesserte Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bei Mäusen, die mit LAX Z-transduzierten D1 und LM8-Zellen sowie bei Mäusen mit Primärtumoren, die von Dun LAX Z-Zellen abstammten, injiziert worden waren. Mikrometastasen oder sogar Einzelzellherde wurden in Lungschnitten erkannt.

Dies wurde bei Mäusen mit primären Tumoren der jeweiligen Kontrollzellen nicht beobachtet. Darüber hinaus waren Makrometastasen bei Mäusen, die mit LM acht LA C-Zellen injiziert wurden, deutlicher sichtbar als bei Tieren mit den Kontroll-LM-acht-Zellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Lungenperfusion und -fixierung in ZI zwei sowie die anschließende Exzi-Färbung der Metastasen in den entnommenen Lungen durchführt.

Diese Technik stellt eine äußerst empfindliche Endpunktanalyse für die Metastasenverteilung in der Lunge in jeder Art von Krebsstudie dar und kann zudem als Referenz dienen, um die derzeitigen in-vivo-Bildgebungsverfahren wie Mikro-CT, PET und MRT, die zur Früherkennung metastatischer Läsionen eingesetzt werden, zu verbessern.