Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, elektrogesponnene biologisch abbaubare Gerüste herzustellen, die sterilisiert werden können und eine ausreichende Dicke sowie geeignete mechanische Festigkeit für die klinische Gewebeengineering-Anwendung aufweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst biologisch abbaubare Polymere mittels Elektrospinnen in primäre Architekturen – entweder zufällig ausgerichtet oder gezielt orientiert bzw. sequenziell geschichtet – umgewandelt werden. Der zweite Schritt besteht darin, den Gerüsten nach dem Spinnvorgang Modifikationen zuzuführen, indem mehrere Schichten zusammengefügt und sterilisiert werden.

Anschließend werden Zellen in die Gerüste eingebracht, und ihre Leistung während und nach der Kultivierung wird bewertet. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen einem Trainingsprogramm auszusetzen, um die physiologische Belastung nachzuahmen, der sie im Körper begegnen werden, um sie auf die Transplantation vorzubereiten. Letztendlich können wir die Reaktion der Zellen auf körperliche Belastung beurteilen, indem wir die von ihnen als Antwort auf dynamische Spannung produzierte extrazelluläre Matrix messen.

Diese Technik ist vielseitig und flexibel und ermöglicht die Herstellung einer großen Vielfalt an Gerüsten mit Eigenschaften, die spezifisch für die jeweilige Anwendung modifiziert werden können. Beispielsweise können Gerüste entwickelt werden, um schwierige Zustände zu behandeln, bei denen eine Gewebereparatur erforderlich ist, wie etwa den Ersatz umfangreichen Hautverlusts bei stark verbrannten Patienten oder die Reparatur beschädigter oraler Mukosa nach Krebserkrankung oder Trauma. Obwohl dieses Video die dauerhafte Produktion von Zellen als Marker dynamischen Stresses zeigt, könnten Sie auch eine Reihe von extrazellulären Matrixproteinen berücksichtigen sowie viele weitere Aspekte der Zellbiologie unter Verwendung von belasteten oder nicht belasteten Zellen untersuchen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, reproduzierbare Gerüste herzustellen, da der Elektrospinnprozess von vielen Variablen beeinflusst wird. Eine visuelle Demonstration der Verarbeitung von elektrogesponnenen Gerüsten nach dem Spinnen ist wichtig. Dies wird selten besprochen.

Kenntnisse über den Prozess sind notwendig, damit die Technik erfolgreich in der Klinik angewendet werden kann. Beginnen Sie damit, einen rotierenden Spulenkollektor mit einer Aluminiumfolie zu überziehen, wobei die glänzende Seite nach außen zeigt. Stellen Sie anschließend vier Fünf-Milliliter-Spritzen, die jeweils mit fünf Millilitern des interessierenden Polymers beladen sind, auf.

Hier wird Polylactid in eine Spritzenpumpe eingebracht. Stellen Sie die Flussrate auf 40 Mikroliter pro Minute pro Spritze ein und den Arbeitsabstand auf 17 Zentimeter zwischen Nadelspitze und Walze. Laden Sie danach die Spritzennadeln mit plus 17.000 Volt auf und elektrospinnen Sie aus dem geeigneten Abstand auf die mit Aluminiumfolie beschichtete Walze, um ausgerichtete Fasern zu erhalten.

Drehen Sie die Scheibe bei 1000 U/min für zufällige Fasern. Drehen Sie die Scheibe bei 200 U/min. Elektrogesponnene Scaffolds können nach dem Elektrospinnen des PHBV Lotus-Sekundärpolymers vier Monate lang auf Aluminiumfolie in einem verschlossenen Behälter bei vier Grad Celsius in Gegenwart eines Trockenmittels aufbewahrt werden.

Erneut gilt: PLA hat eine Schichtbildung auf der PHBV-Oberfläche gezeigt, wobei die Parameter und Normalbedingungen für das Spin-Coating dieses Polymers verwendet wurden. Auch hier baut sich durch diesen zusätzlichen Prozess eine doppelte Schicht des Gerüsts auf, wodurch mittels Heizung ein zweilagiges Gerüst zur Erzeugung eines mehrschichtigen Gerüsts entsteht.

Legen Sie vier PLGA-Blätter flach übereinander und erwärmen Sie die Blätter dann drei Stunden lang auf 60 Grad Celsius, um mittels Dampf-Bindung einen mehrschichtigen Scaffold herzustellen. Geben Sie 10 Milliliter Dichlormethan oder DCM in ein passendes Behältnis. Legen Sie danach vier PLGA-Blätter flach übereinander und hängen Sie sie zwei Zentimeter über dem DCM auf.

Schließlich den Behälter eine Stunde lang bei Raumtemperatur versiegeln, um die aseptische Herstellung von Gerüsten durch Elektrospinnen zu gewährleisten, medizinische Polymere, die durch Inkubation in DCM sterilisiert wurden, auflösen und anschließend elektrospinnen. Die Polymelösung auf sterile Folie auftragen, die um einen sterilisierten Dorn gewickelt ist. Danach im sterilen Flachstromwerk die Gerüste für den entsprechenden Zeitraum in antibiotikafreiem Wachstumsmedium inkubieren, um die Sterilität der Proben gemäß der experimentellen Ethanol-Desinfektion zu überprüfen.

Die Scaffolds 15 Minuten lang in eine Ethanol- und destilliertes Wasser-Lösung geben. Zur Sterilisation mit Peressigsäure. Die Scaffolds drei Stunden lang in eine Peressigsäure- und PBS-Lösung eintauchen.

Bei Raumtemperatur für die Gamma-Sterilisation die Gerüste mit einer Dosis von drei Kilogray unter Verwendung einer Caesium-Quelle bestrahlen, anschließend die Gerüste in Rechtecke von fünf Millimeter mal 20 Millimeter schneiden. Danach die Dicke der Gerüste mit einem Messschieber bestimmen. Anschließend die Rechtecke in ein Bose Electro Force 3100-Instrument geben.

Berechnen Sie den Elastizitätsmodul und die Elastizität aus der Last in Abhängigkeit von der Verschiebung als Spannungs-Dehnungs-Kurve, die vom Instrument dargestellt wird. Beginnen Sie damit, die Zellen vor dem Ansäen mit einem fluoreszierenden Farbstoff zu markieren. Inkubieren Sie dann konfluente humane Dermalfibroblasten fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Trypsin und EDTA.

Anschließend die abgelösten Zellen 10 Minuten bei 150 × g und Raumtemperatur zentrifugieren und das Zellpellet in fünf Milliliter DMEM resuspendieren. Nach der Zellzählung die Zellkonzentration für die Aussaat einstellen und die Zellen auf die Scaffolds säen. Danach die Oberfläche der markierten Scaffolds mit einem Fluoreszenzmikroskop abbilden, um die Einwanderung der Zellen tiefer in die Scaffolds zu untersuchen; hierfür kann ein Multiphotonen-Konfokalmikroskop verwendet werden.

Dadurch kann eine Penetration von etwa 200 Mikrometern in die meisten Gerüste mit oder ohne Zellen erreicht werden. Anschließend die beimpften Gerüste nach der Kultivierung 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Milliliter Formaldehyd in PBS fixieren. Nach der Fixierung die Proben dreimal mit je einem Milliliter PBS waschen und danach jeweils 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in 200 Mikrolitern Elastin-Primärantikörper inkubieren.

Spülen Sie die Proben dreimal mit jeweils einem Milliliter PBS und inkubieren Sie anschließend die Proben 30 Minuten lang in einer Lösung mit sekundärem Antikörper in PBS, die DPI enthält. Schließlich, nach einem letzten Spülschritt der Proben in PBS, nehmen Sie die Proben am Fluoreszenzmikroskop mit 365 Nanometer Anregung und 460 Nanometer Emission für DPI sowie 480 Nanometer Anregung und 533 Nanometer Emission für den sekundären Antikörper auf. Sterilisieren Sie zunächst die Durchflussregelungsvorrichtung und den Ballon im Autoklaven, bringen Sie diese dann in einem Reinraum unter einer laminarer Luftströmungskabine in Position, um Elektrospinnen durchzuführen.

Als Nächstes eine 50-Milliliter-Spritze, die mit PBS gefüllt ist, an den Seitenhahn eines Dreiweghahns anschließen und den Ballon mit PBS aufblasen, bis er straff ist. Anschließend das gewünschte Polymer mittels Elektrospinnens auf den Ballon auftragen. Unter Verwendung der üblichen Spinnbedingungen und einem Arbeitsabstand von 10 Zentimetern sind die feuchten Fasern klebrig genug, um an der Oberfläche des Ballons zu haften, ohne sich danach wieder zu lösen.

Nachdem das Gerüst getrocknet ist, wird der Ballon in ein steriles Gefäß gegeben und das Gefäß anschließend in eine laminare Flussabsaughaube transportiert, die für die Zellkultur geeignet ist. Die Kultivierung von Zellen auf einem Gerüst an einem aufgeblasenen Ballon, um die Zellen einer biomechanischen Belastung auszusetzen, ist der schwierigste Teil dieses Verfahrens. Es ist entscheidend, den Ballon wiederholt mit der Zelllösung zu bestreichen, um so viele Zellen wie möglich am Gerüst anzubringen.

Wir stellen fest, dass dies etwa 20 Minuten dauert. Entfernen Sie im Abzug den Ballon aus dem Gefäß und legen Sie ihn auf eine sterile Oberfläche, wie hier die verwendete Petrischale, und pipettieren Sie alle 20 Sekunden Zellsuspension auf den beschichteten Ballon, um über einen Zeitraum von 20 Minuten eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Ballonoberfläche zu erreichen. Danach setzen Sie den Ballon zurück in das Kulturgefäß und geben vorgewärmtes, für den Zelltyp geeignetes Medium hinzu.

Schließen Sie schließlich das Aufblasgerät an eine Spritzenpumpe an und pumpen Sie den Ballon nach Bedarf auf und ab, um eine biaxiale Dehnung zu erzielen. Eine computergesteuerte Spritzenpumpe kann verwendet werden, um ein komplexeres Dehnungsregime zu erreichen. Das Elektrospinnen kann genutzt werden, um Gerüste mit zufälligen und geordneten Architekturen herzustellen.

Das ist wiederholbar, und die Fasern sind gleichmäßig. Zum Beispiel können senkrecht zueinander stehende Fasern hergestellt werden, indem man eine Reihe ausgerichteter Fasern durch Elektrospinnen auf eine Aluminiumfolie aufbringt, die Folie anschließend um 90 Grad dreht und unmittelbar danach eine zweite Reihe ausgerichteter Fasern direkt darüber elektrospinnt. Viele Arten von Polymeren können elektrogesponnen werden, wobei die Eigenschaften erheblich variieren können, wie hier für P-L-A-P-H-B-V-P-C-L und PLGA gezeigt. Beachten Sie, dass P-L-A-P-C-L und PLGA allesamt mikrofasrige, gleichmäßige Gerüste sind.

PHBV wird als Perlenkette mit Nanofasern gesponnen, die Perlen von fünf bis 20 Mikrometern verbinden. Hier wurden die Gerüste zunächst aus PHBV gesponnen, anschließend wurden die Spritzen mit PLA befüllt und dieses auf die PHBV-Gerüste aufgesponnen. Diese Bilder zeigen repräsentative einzelne PHBV- und PLA-Schichten.

Dieses Bild veranschaulicht, wie ein Querschnitt eines A-P-H-B-V-P-L-A-Bilagers mit einer dichten nano-fasrigen Par-Halskette, einer PHBV-Schicht und einer offeneren mikro-fasrigen PLA-Schicht aussehen könnte. Alle drei Gerüsttypen fördern die Zelladhäsion und -proliferation. Falls dickere Gerüste benötigt werden, können Dampf und Heizung zum Verschmelzen von Gerüstsichten verwendet werden, wie in den folgenden Bildern gezeigt. Verschmolzene Gerüstsichten delaminieren nicht, und es kann sehr schwierig sein, die Grenzfläche zwischen den Schichten zu erkennen.

Dieses Bild zeigt einen Ausschnitt durch einen Dampf- und Knie-PLA-Gerüst, bei dem anfängliche faserige Gerüste mit einer Dicke von etwa 150 Mikrometern zusammengefügt wurden. Anschließend wurde DCM-Dampf verwendet, um deutlich dickere Gerüste mit bis zu 500 Mikrometern Dicke herzustellen. Dieses Bild zeigt denselben Ausschnitt des Dampf-Nil-Zweischichtverbunds mit einer etwa zweimal höheren Vergrößerung. In dieser Aufnahme ist zu erkennen, wie das Gerüst aus Schichten deutlich dickerer Fasern besteht, die mit Schichten dünnerer Fasern, die durch Heizung und Knieen erzeugt wurden, verwoben sind, wodurch durch die Kombination von dünnen und dicken Faserschichten Gerüste mit komplexen mechanischen Eigenschaften entstehen.

Auch hier wird erneut das gleiche beheizte Knie-Implantat im Vierfach vergrößert dargestellt. Die vorherige Vergrößerung durch Schichtmembranen kann mit verschiedenen Zelltypen durchgeführt werden, wobei jeweils ein separater Zelltyp auf einer eigenen Membran kultiviert wird, ohne dass es zu einer Durchmischung kommt, wie in diesen Aufnahmen von menschlichen dermalen Fibroblasten gezeigt, die mit zwei unterschiedlichen fluoreszierenden Zelltracer-Farbstoffen gefärbt wurden. Die erste Abbildung zeigt Fibroblasten auf Electrospun PLA.

Die Zellen wurden fixiert und mit hier gefärbten Fibroblasten, die auf elektrogesponnenes PHBV ausgesät wurden. In diesem Experiment wurden die Fibroblasten vorab mit dem Vitalfarbstoff Cell Tracker Green gefärbt. Beachten Sie, dass sich die Zellen auf der PLA-Seite der Doppelschicht befinden.

Dieses Bild zeigt einen repräsentativen Ausschnitt durch einen Doppelschichtverbund mit rot angefärbten Fibroblasten auf der unteren PHBV-Oberfläche und grün angefärbten Fibroblasten auf der oberen PLA-Oberfläche. In dieser Aufnahme wurden die Fibroblasten vorab mit dem Zelltracerrrot angefärbt, während sie auf der A-P-H-B-V-Oberfläche wuchsen. Die Verwendung lebensverträglicher fluoreszierender Farbstoffe bietet somit eine praktische Methode, um die Verteilung von Zellen auf einem Gerüst zu untersuchen, während die Zellen noch wachsen.

Die Sterilisationsmethode beeinflusst das Gerüst und die anschließende Zellkultur. Dieses Liniendiagramm veranschaulicht die Auswirkungen von Peressigsäure, Gamma-Bestrahlung und Ethanol auf die Zugfestigkeit und das Elastizitätsmodul eines PLG-Gerüsts.

Jede der Sterilisationsmethoden verändert die Zugfestigkeit und die Elastizität der Scaffolds. Die Kultivierung von Zellen auf diesen Scaffolds verringert deren maximale Zugspannung weiter, erhöht jedoch die Elastizität. Dieses Balkendiagramm veranschaulicht den Einfluss der Sterilisationsmethode auf den Faserdurchmesser eines einzelnen Scaffolds.

Die Gammabestrahlung hat keine signifikante Wirkung auf den Faserdurchmesser, während Parazetinsäure und Ethanol den Faserdurchmesser um etwa 50 % verringern. Daher ist der beste Weg, sterile Gerüste herzustellen, die Herstellung unter aseptischen Bedingungen. Diese letzte Bildserie zeigt, dass die Zellen während der dynamischen Dehnung lebensfähig bleiben und zudem erhöhte Mengen an Elastin produzieren. Beachten Sie die Entwicklung der dunkelblauen Färbung, die von den wachsenden Zellen erzeugt wird, wie mit einem metabolischen Indikator, MTT, nachgewiesen wurde.

Hier bildeten die in blau dargestellten auf einem Ballon kultivierten Zellen unter biaxialer Dehnung Elastinfasern aus, wie durch die grüne Färbung angezeigt. Dies steht im deutlichen Gegensatz zum Fehlen von Elastin, wenn dieselben Zellen unter statischen Bedingungen auf einem identischen Ballongerüst gehalten werden. Nach dieser Vorgehensweise können andere Methoden wie die statische Kultur und die Durchströmung der Zellen in den Gerüsten durchgeführt werden, um zu untersuchen, wie die Zellen auf verschiedene Kulturbedingungen reagieren.

Die Entwicklung der Kultivierung von Zellen auf einem Gerüst an einem Ballon, der aufgeblasen werden kann, hat sich als sehr nützlich erwiesen, da sie es Forschern auf dem Gebiet des Gewebetechnik ermöglicht hat, nun den Effekt einer dynamischen Belastung von Zellen in gewebetechnischen Konstrukten zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Hochspannungsnetzgeräten, Lösungsmitteln, Lasern und menschlichen Zellen gefährlich sein kann und dass stets eine angemessene Ausbildung und Vorsichtsmaßnahmen zu beachten sind, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.