A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zyten aus wilden Raupen zu extrahieren, zu visualisieren und zu zählen. Dies wird erreicht, indem die Raupe zunächst betäubt wird, indem man sie auf Eis legt, ihr eine Pufferlösung injiziert, die ein Antikoagulans enthält, und die Raupe wieder auf das Eis zurückbringt, damit die Raupen vor der Extraktion wieder in den Kreislauf gelangen können. Der zweite Schritt besteht darin, mit einem sauberen Skalpell einen flachen Schnitt am hinteren Ende der Raupe zu machen.

Anschließend wird die Raupe mit einer weichen Pinzette sanft zusammengedrückt. Dann wird die Hämolymphmischung aus der Pufferlösung mit einer Mikropipette aspiriert und in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. Der letzte Schritt besteht darin, die Hämolymphlösung vorsichtig mit einem gleichen Volumen Pufferlösung zu mischen und 10 Mikroliter der Lösung auf ein Hämozytometer zu übertragen, um die Anzahl der Zyten sichtbar zu machen und zu zählen.

Letztendlich kann diese Methode zur Extraktion von Hämozyten als schnelle und effektive Methode zur Zählung der Zyten verschiedener Raupenarten verwendet werden und als Werkzeug zur Untersuchung physiologischer Aspekte der zellulären Immunantwort der Insekten dienen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Extraktion von Hämosots aus Raupen mit sehr reduziertem Prox verwendet werden kann. Andere Raupenmodelle werden entblutet, indem einer der Profis geschnitten wird, ohne die Zyten aus der austretenden Flüssigkeit zu extrahieren.

Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um den Hämotyp anderer Insektenarten zu extrahieren. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Öko-Immunologie beantworten, z.B. wie sich die zelluläre Immunantwort von Insekten je nach Ernährungsqualität, Entwicklungsstadium oder Exposition gegenüber verschiedenen Krankheitserregern unterscheidet. Um dieses Verfahren zu beginnen, betäuben Sie die vorletzten Larven im Stadium, indem Sie sie vor der Hämozytenextraktion 20 Minuten lang auf Eis kühlen.

Stecken Sie danach das stumpfe Ende einer sauberen 16-Gauge-Kapillarnadel in den Schlauch, der mit einer 20-Milliliter-Glasspritze verbunden ist. Lassen Sie das Röhrchen mit der Auffanglösung offen auf dem Labortisch. Füllen Sie die Kapillare langsam mit ca. 10 bis 15 Mikrolitern Puffer.

Legen Sie dann die Nadel auf eine Tonkugel, die neben dem Präpariermikroskop platziert wird. Lege die Raupe in eine Petrischale. Das Insekt sollte auf der Seite positioniert werden, so dass die Kugeln gut sichtbar sind.

Halten Sie die Raupe unter einem Präpariermikroskop mit einer Pinzette an Ort und Stelle und platzieren Sie die Nadel in der Nähe einer der Kugeln, wo die Kutikula des Insekts im Allgemeinen weicher ist. Drücken Sie dann die Kapillarnadel vorsichtig gegen den Körper des Insekts. Sobald die Nadel in die Nagelhaut eingedrungen ist, injizieren Sie das gesamte Volumen der Lösung in die Raupe.

Der Körper der Raupe schwillt nach der Injektion an, sollte aber nicht platzen oder nässen. Lege die Raupe wieder in die eisgekühlte Petrischale. Positionieren Sie das Insekt dorsal, um zu verhindern, dass der Puffer aus der Wunde austritt.

Wiederholen Sie die Injektionen für jede Raupe, die für die Hämolabkextraktion verwendet wird. Lassen Sie dann alle Insekten 30 Minuten auf Eis abkühlen. Legen Sie nun die Raupe in eine Petrischale unter das Präpariermikroskop.

Machen Sie vorsichtig einen etwa zwei bis drei Millimeter langen flachen Schnitt im hinteren Bereich der Raupe mit einem sterilen Skalpell, ohne den Darm oder andere innere Organe zu beschädigen. Drücken Sie dann die Raupe vorsichtig mit einer flexiblen Kunststoffzange zusammen, während Sie etwa 10 bis 20 Mikroliter der hämo schlaffen Mischung mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze auffangen. Achten Sie auch hier darauf, das innere Gewebe nicht zu verletzen.

Danach die Raupenreste entsorgen. Sammeln Sie das Hämo-Hinken von jeder Raupe in separat beschrifteten silikonisierten 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie dann etwa 10 bis 20 Mikroliter der Inkubationslösung zu jeder hämoschlaffen Probe, die von einer einzelnen Raupe entnommen wurde.

Bewahren Sie die Hämolymphproben in diesem Schritt immer auf Eis auf. Mischen Sie die Hämolymphprobe und die Inkubationslösung unmittelbar vor der Auszählung. Er cytes.

Diese Behandlung ermöglicht eine ordnungsgemäße Trennung der Zyten und verhindert die Verklumpung. Verwenden Sie eine saubere Pipettenspitze, um 10 Mikroliter Hämolymphprobe, gemischt mit der Inkubationslösung, auf ein Hämozytometer zu übertragen. Zählen Sie dann mit einem Verbundmikroskop und notieren Sie die Anzahl der Zyten in mindestens 15 der großen Quadrate des zentralen Gitters des Hämozytometers.

Addieren Sie diese Werte, um eine Gesamtsumme der Anzahl der Hämozyten in den 15 Quadraten zu erhalten. Spülen Sie anschließend das Hämozytometer und seinen Objektträger gründlich mit einer Waschflasche mit destilliertem und entionisiertem Wasser aus. Wischen Sie es dann mit Kim-Tüchern trocken.

Wiederholen Sie die Verfahren für den Rest der Hämoschlaffproben und berechnen Sie die mittlere Anzahl der Zyten pro Milliliter Hämoschlaffvolumen für jede Raupe. Das Hellfeldmikroskopie-Bild zeigt die extrahierten Zytoten aus den Raupen des Kerns in ai bei einer 20-fachen Vergrößerung. Nach diesem Verfahren könnten die gesammelten Hämozyten verwendet werden, um die zelluläre Immunantwort zu untersuchen und Assays wie Phagozytose und Kappe, selektive Verkapselung und pH-Oxidase-Aktivität einzurichten.

Darüber hinaus können R-N-A-D-N-A und Protein ungenutzt für weitere Assays gesammelt werden, um diese zelluläre Immunantwort bei Insekten zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Raupen zum Zwecke der Extraktion von Hämolymphe injiziert und wie man Hämolymphe mit lebenden Hämozyten sammelt.