Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

Das übergeordnete Ziel des folgenden Versuchs ist es, den Bakterien eine adhärente Eigenschaft zu verleihen, um ihre Trennung von flüssigen Medien zu erleichtern. Dies wird erreicht, indem zunächst ein synthetischer Lockenstab entwickelt wird, der die komplexe genetische Regulation umgeht und eine einfache und massive Produktion von klebrigen Polymeren ermöglicht. In einem zweiten Schritt wird ein anhaftendes Bakterium sichtbar gemacht und auf Polystyrol quantifiziert, was eine schnelle Abschätzung der Effizienz des synthetischen Geräts ermöglicht.

Als nächstes wird ein anhaftendes Bakterium durch konfokale Mikroskopie auf Glas sichtbar gemacht. Um den Biofilm direkt zu beobachten und Informationen über seine Struktur zu gewinnen, werden Ergebnisse erhalten, die eine signifikante Erhöhung der Adhärenz in dem Stamm zeigen, der das synthetische Gerät beherbergt, und zwar sowohl auf der Grundlage der Adhärenz, der prozentualen Messung als auch auf mikroskopischen Beobachtungen. Der Hauptvorteil des Ansatzes der synthetischen Biologie gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen Klonierung besteht darin, dass Konstrukte, die nur die absolut eindeutig benötigten Gene mit entsprechenden Signalen enthalten, sehr schnell erhalten werden können.

Diese Methode kann dazu beitragen, eine Schlüsselfrage im Bereich der Bioremediation zu beantworten, wie z. B. die Herausforderung der Entfernung metallbeladener Bakterien aus radioaktiven Abfällen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da grundlegende Kenntnisse über genetische regulatorische Signale und den Umgang mit Datenbanken erforderlich sind. Die visuelle Demonstration konzentriert sich auf die Quantifizierung und Visualisierung von Biofilmen, da diese beiden Schritte aufgrund der Fragilität von Bioframes sehr schwer zu erlernen sind.

Der erste Schritt zur Entwicklung des synthetischen Aas besteht darin, die genetische Organisation der lockigen Gene zu bestimmen und ihre endogenen, transkriptionellen und translationalen Signale zu lokalisieren. Dies geschieht mit Hilfe von spezialisierten Datenbanken wie REON DB oder eco gene. Der nächste Schritt besteht darin, die fünf für die Curly-Synthese unbedingt erforderlichen Gene CSGB und CSGA auszuwählen und die Fasermonomere und C-S-G-E-C-S-G-F und CSGG zu kodieren, den Curling-Sekretionskomplex zu kodieren, die ausgewählten Sequenzen aus der Datenbank in einem schnelleren Format zu extrahieren und die Voranalyse in silico mit der Clone-Manager-Software durchzuführen, da der C-S-G-G-F-E-Cluster im E-Coli-Genom Antisense ist.

Diese Sequenz muss in ihr Gegenstück mit umgekehrtem Komplement umgewandelt werden. Verwenden Sie die Klon-Manager-Werkzeuge, Operationen, Prozessmolekül, Molekül invertieren, fügen Sie die C-S-G-E-F-G-Sequenz hinter C-S-G-B-A ein, indem Sie die Funktion ligate verwenden. Fügen Sie als nächstes den entsprechenden Promotor PRCN vor der C-S-G-B-A-E-F-G iCal-Sequenz hinzu.

Der RCN-Locus kodiert eine FLX-Pumpe RCNA, die für die Nickel- und Kobaltentgiftung verantwortlich ist, und ihren verwandten Metallo-Regler RCNR. In Abwesenheit von Kobalt oder Nickel bindet der Repressor RCNR an die RCNR-Box auf der DNA und verhindert die vollständige Aktivierung der Transkription der nachgeschalteten Gene. Steigt die intrazelluläre Konzentration von Kobalt oder Nickel an, verhindert die Bindung von Kobalt oder Nickel an das RCNR-Protein die Fixierung des Repressors an den Promotor und die transkriptionelle Aktivität von P-R-C-N-A nimmt zu, indem die fünf ausgewählten lockigen Gene unter die Kontrolle des Promotors gestellt werden.

Es wird prognostiziert, dass PRCN-Locken in Gegenwart von Kobalt und Nickel überproduziert werden. Optimieren Sie anschließend die transkriptionellen Signale, indem Sie eine perfekte Ribosomenbindungsstelle oder RBS vor das erste A TG der CS gba, DNA-Sequenz und ein zweites perfektes RBS vor die C-S-G-E-F-G-Sequenz einfügen. Um den I-GM-Standards zu entsprechen, muss das Gerät von einem Standard-Bio-Brick-Präfix flankiert werden, das Restriktionsstellen für ECO R one und X-bar one enthält, und ein Suffix mit Restriktionsstellen für SPE one und PST one, um die weitere Montage zu erleichtern.

Das Bio-Brick-Teil selbst darf keine Erkennungsstellen für ECO R, PST für SPE und X-bar R für One enthalten. Daher wurden diese Stellen durch stille Mutationsänderungen in der silico-Restriktionsanalyse des Geräts eliminiert, die eine PST, eine Stelle in der CSGA-Sequenz, eine PST, eine Stelle in der RCNR-Sequenz und eine ECO R-Stelle im CSGE-Gen ergaben. Diese Stellen wurden durch stille Mutationen verändert.

Sobald das Design des synthetischen Opors abgeschlossen ist, führen Sie eine Translationssimulation mit der Clone-Manager-Software durch. Verwenden Sie das Sequenzausrichtungsprogramm blast, um die perfekte Homologie zwischen den Wildtyp-Curly-Proteinen und den Proteinen zu überprüfen, die von der synthetischen on kodiert werden, um dieses Verfahren für jede Vertiefung einer 24-Well-Polystyrolplatte mit zwei Millilitern M 63 zu beginnen, minimales Medium mit 0,2 % Glukose und inokulieren Sie jede Vertiefung mit 10 bis sechs Zellen einer Bakterienkultur über Nacht. Züchten Sie die Bakterien 18 bis 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius, ohne jede Säule der 24-Well-Platte zu schütteln.

Bei Bedarf wird die richtige Menge an Kobalt und Antibiotikum hinzugefügt. Die ersten drei Reihen werden verwendet, um die A-adhärenten Bakterien durch Mittelung der drei Wiederholungen zu quantifizieren. Die letzte verbleibende Reihe wird verwendet, um den Biofilm durch Kristallviolettfärbung nach 18 bis 48 Stunden sichtbar zu machen, das Supinat, das die Planktonzellen enthält, aus jeder Vertiefung aus den ersten drei Reihen der 24-Well-Platte zu gewinnen und das Supinat in ein Hämolyseröhrchen zu übertragen.

Spülen Sie jede Vertiefung vorsichtig mit einem Milliliter M 63 Medium aus und ziehen Sie die Wäsche mit dem initialen Supinat in das Hämolyseröhrchen. Dieser Pool wird als schwimmende Zellen mit der Bezeichnung S bezeichnet.Der Boden der Vertiefungen in der Mikroplatte ist mit Adhärenzzellen bedeckt. Um den Biofilm wiederherzustellen, geben Sie jeweils einen Milliliter M 63 hinein.

Nun, kratzen Sie mit der Pipettenspitze und pipettieren Sie dann auf und ab und übertragen Sie die Biofilmfraktion in ein neues Hämolyseröhrchen. Wirbeln Sie die Röhre 15 Sekunden lang durch. Sammeln Sie die Biofilmfraktion in Hämolyseröhrchen.

Dieser Pool repräsentiert die oberflächengebundenen Zellen mit der Bezeichnung B, die 200 Mikroliter der Supinat- und Biofilmfraktion von den Hämolyseröhrchen auf eine 96-Well-Platte übertragen. Schätzen Sie die Anzahl der an der Oberfläche haftenden und schwimmenden Bakterien aus der optischen Dichte bei 600 Nanometern. Der Prozentsatz der Adhärenz für jede Modalität wird berechnet, indem die Formel B mal 100 geteilt durch dreimal S plus verwendet wird, B.To den Biofilm nur für die letzte Reihe der 24 Vertiefungen sichtbar machen, verwerfen Sie die Planktonzellen aus diesen Vertiefungen.

Geben Sie je einen Milliliter M 63 in jede Vertiefung, um den Biofilm zu spülen, der sich auf dem Boden der Platte gebildet hat. Trocknen Sie die unbedeckte Platte nach einer Stunde eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius, fügen Sie 100 Mikroliter 20% Kristallviolett für zwei in jede Vertiefung hinzu, gefolgt von ausgiebigen Waschgängen mit Wasser. Für dieses Protokoll ist ein fluoreszierendes Chassis erforderlich.

Ein geeigneter Wirt für das Plasmid, auf dem die synthetische Locke liegt, ist der e coli SCC-Eins-Stamm, der konstitutiv grün fluoreszierendes Protein exprimiert, ohne dass ein Unterschied zum Elternstamm MG 1 16 55 erkennbar ist. Transformieren Sie den Wirtsstamm mit einem Puck-57-Plasmid, das die synthetischen Curli trägt, um den Stamm S 23 zu erhalten. Transformieren Sie den Wirtsstamm mit einem Kontrollplasmid-Puck 18, um den Kontrollstamm zu erhalten.

S 24 züchten über Nacht Vorkulturen der Stämme S 23 und S 24 bei 30 Grad Celsius. In M 63 Medium, ergänzt mit Glukose und Ampicillin, geben Sie am folgenden Tag 20 Milliliter M 63 Medium in eine Petrischale und inokulieren Sie dann 15 Milliliter M 63 in Petrischalen mit 100 Mikrolitern der Vorkulturen. Fügen Sie die entsprechende Konzentration an Kobalt hinzu und vergessen Sie nicht die Negativkontrolle ohne Kobalt.

Führen Sie drei rechteckige Glasabdeckfolien in jede Petrischale ein. Inkubieren Sie die Gerichte über Nacht bei 30 Grad Celsius ohne Schütteln. Bakterien können in den folgenden Tagen direkt unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Es ist wichtig, ein Austrocknen der Probe zu vermeiden, daher müssen die folgenden Schritte sorgfältig, aber schnell durchgeführt werden. Entfernen Sie alle Deckgläser von den Petrischalen und lassen Sie sie vorsichtig abtropfen. Reinigen Sie das untere Gesicht vorsichtig mit einem kleinen, mit 70%igem Ethanol getränkten Wattestäbchen, um alle Bakterienrückstände für die konfokale Betrachtung abzuwischen.

Legen Sie den Deckglas auf einen Objektträger, wobei die Oberseite mit dem Biofilm nach oben bedeckt ist. Anschließend wird der Biofilm mit einem größeren Deckglas abgedeckt, das auf dem Glas fixiert wird. Folie mit Lack.

Kehren Sie den Aufbau um, so dass sich der Biofilm nun auf der unteren Fläche befindet. Platzieren Sie den Aufbau in diesem Experiment unter dem konfokalen Lasermikroskop. In der CT-Mikroplattform kommt ein konfokales Lasermikroskop LSM five 10 von Zeiss zum Einsatz.

Wählen Sie das Ziel für 40-faches Eintauchen in Öl. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen, regen Sie GFP bei 4 88 Nanometern an und sammeln Sie die bakterielle Fluoreszenz im Bereich von 500 bis 600 Nanometern. Verwenden Sie das 40-fache Ölimmersionsobjektiv für die Aufnahme von Bildern.

Im konfokalen Laserscanning-Modus. Scannen Sie die gesamten dreidimensionalen Strukturen der Biofilme von der festen Oberfläche bis zur Grenzfläche mit dem Wachstumsmedium. Mit einem Schritt von einem Mikrometer.

Führen Sie dreidimensionale Projektionen mit einer Maus-Software durch, bestimmen Sie die Biofilmdicke durch die Analyse des durchschnittlichen C-Wertes entlang statistischer Längsschnitte. Quantifizierung von Biofilm, Biovolumina können aus konfokalen Z-Stacks extrahiert werden. Die Adhärenzfähigkeit von E-Coli, die so verändert wurden, dass sie als Reaktion auf Metall zu viel Locken produzieren, kann mit einfachen Methoden bewertet werden.

Zum Beispiel ermöglicht die Kristallviolettfärbung auf 24 gut polierten Irene-Platten eine schnelle Visualisierung der Biofilmbildung am Boden jeder Vertiefung, wie der Unterschied in der violetten Farbintensität zeigt. Es scheint, dass der Wildtyp-Stamm weniger adhärent ist als der manipulierte Stamm. Eine quantitative Methode besteht darin, den prozentualen Anteil der Adhärenz an Polystyrol des Wildtyps und der gentechnisch hergestellten Stämme mit unterschiedlichen Kobaltkonzentrationen zu messen.

Die in dieser Grafik dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die prozentuale Adhärenz des manipulierten Stammes in Abwesenheit von Kobalt 1,5-mal höher ist als die des Wildtyp-Stammes. Darüber hinaus wurde eine signifikante Verstärkung der Adhärenz in Gegenwart steigender Kobaltkonzentrationen in Medien mit Kobaltkonzentrationen von 25 Mikromolaren oder 50 Mikromolaren Prozentsätzen von Adhärenz bei 30 % bzw. 40 % beobachtet. Die Adhärenzfähigkeit kann auch mikroskopisch mit GFP-markierten Bakterien verglichen werden, die auf Objektträgern gezüchtet wurden, Epi-Fluoreszenzmikroskopische Beobachtungen von grünen Bakterien auf schwarzem Hintergrund zeigen, dass der manipulierte Stamm einen Biofilm bildet, während der wilde Trippenstamm nur Mikrokolonien bildet, die durch die Pfeile angezeigt werden.

Die konfokale Mikroskopie ermöglicht einen Gesamtüberblick über die dreidimensionale Struktur des Biofilms. Rekonstruktionen in der Draufsicht sind in den Tafeln A und Rekonstruktionen in der Seitenansicht in den Tafeln B dargestellt. Die Ergebnisse bestätigen, dass der manipulierte Stamm eher ein Adhärent ist und einen dichteren und dickeren Biofilm bildet als der Wildtyp. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, das Betriebsdesign zu überprüfen, z. B. um das Biomediationspotenzial von modifizierten Ecoli oder Schadstoffen im Zusammenhang mit radioaktiven Abwässern zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit der Clone-Manager-Software eine synthetische Öffnung entwerfen und wie Sie die Äußerung von Bakterienstämmen schnell quantifizieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit synthetischen Genen und gentechnisch veränderten Organismen äußerst gefährlich sein kann. Sie müssen den geltenden Gesetzen entsprechen und Vorsichtsmaßnahmen wie das Autoklavieren transformierter Bakterien sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.