Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, wasserbürtige Cryptosporidium- und Giardia-Arten nachzuweisen und sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Wasserprobe mittels tangentialer Flussfiltration mit Hohlfasermembranen durch Ultrafiltration angereichert wird. Im zweiten Schritt werden die Organismen eluiert und die Verunreinigungen durch eine Zentrifugierstufe aus dem Filter zurückgehalten.

Mittels immungestützter magnetischer Trennung ist eine selektive Abtrennung der Parasiten von dem konzentrierten Zelltrümmern möglich. Die magnetischen Kügelchen werden durch thermische Dissoziation von den Parasiten gelöst und mithilfe eines Magneten entfernt. Anschließend werden die Zysten und O-Zysten auf einen Objektträger gegeben, und die Probe wird zur Visualisierung per Immunfluoreszenzmikroskopie angefärbt.

Der Hauptvorteil der hofi-Filtration gegenüber bestehenden Techniken liegt darin, dass der Ultrafilter deutlich kostengünstiger ist und zusätzlich zu Cryptosporidium und Giardia auch mehrere andere Mikroorganismen wie Viren und Bakterien abtrennt. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Immunoisolation sind, durch die Menge und Art von Verunreinigungen, die mit unterschiedlichen Proben aus sehr variierenden klimatischen Bedingungen einhergehen, vor Herausforderungen gestellt. Beginnen Sie damit, die Ultrafiltrationsapparatur innerhalb eines Sicherheitswerkbanks zu montieren.

Nach der Montage funktioniert die Apparatur wie folgt: Die Wasserprobe tritt in das System ein, indem sie durch den schwarzen T-Anschluss fließt, und bewegt sich dann durch den Pumpenkopf, das Manometer und in den Hohlfaser-Ultrafilter. Das gefilterte Wasser tritt seitlich aus dem Filter aus und gelangt in den Abfallbehälter. Das zurückgehaltene Wasser, das die Organismen enthält, wird in die Retentatflasche gedrückt und durch das System erneut zirkuliert, bis das Wasservolumen reduziert ist. Um mit dem Verfahren zu beginnen, entfernen Sie die Entlüftungskappe und öffnen Sie alle Schellen, mit Ausnahme der Schlauchklemme zwei, die geschlossen bleiben sollte, damit die Retentatflasche sich mit Wasser füllen kann. Stellen Sie die Pumpenrichtung so ein, dass die Wasserprobe in den Filter fließt.

Danach die Pumpengeschwindigkeit auf 25 % einstellen und die Pumpe einschalten, wenn die Permeatflasche zu zwei Dritteln gefüllt ist. Schlauchklemme zwei abdrücken und die Flasche schnell mit der Belüftungskappe dicht verschließen. Alle Leitungen und Anschlüsse überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Leckagen vorliegen.

Erhöhen Sie dann langsam die Pumpgeschwindigkeit auf etwa 1,5 Liter pro Minute, wobei Sie einen Messzylinder und einen Timer oder ein Durchflussmessgerät verwenden, und überprüfen Sie, ob die Filtratgeschwindigkeit – also die Geschwindigkeit des Wassers, das aus der Ablaufleitung austritt – tatsächlich 1,5 Liter pro Minute beträgt. Beobachten Sie den Filtrationsprozess, wobei sichergestellt werden muss, dass die Retentflasche niemals leerläuft, obwohl das Volumen leicht ansteigen oder abnehmen kann. Wenn das Volumen unter ein Drittel fällt, nehmen Sie die Entlüftungskappe ab und schließen Sie die Schlauchklemme zwei.

Lassen Sie das Volumen in der Flasche erneut auf zwei Drittel ansteigen. Danach setzen Sie die Entlüftungskappe fest wieder auf und öffnen Sie die Klemme zwei erneut. Sobald der Probengefäß leer ist, schließen Sie die Schraubklemme eins unverzüglich, verringern Sie die Pumpengeschwindigkeit auf 20 %, entfernen Sie die Entlüftungskappe von der Retentatflasche und schließen Sie die Rampenklemme, die das Abflussrohr der Filterkolonne mit dem Abwassertank verbindet.

Stellen Sie mithilfe der Rampenklemme das Volumen in der Retentatflasche auf etwa 200 Milliliter ein. Anschließend ziehen Sie die Rampenklemme für die Eluierung fest, um die Probe zu eluieren. Geben Sie zunächst 500 Milliliter Eluierungslösung zum Probenbehälter hinzu und spülen dabei die Innenseite des Behälters aus.

Danach die 10-Milliliter-Pipette, die mit der Probenentnahmleitung verbunden ist, in den Eluierlösung-Behälter stellen. Den Schraubklemmverschluss eins öffnen und den Schraubklemmverschluss zwei kurzzeitig schließen, um die Eluierlösung aufzusaugen. Sobald die gesamte Lösung aufgenommen wurde, Schraubklemmverschluss eins schließen, Schraubklemmverschluss zwei öffnen und die Lösung fünf Minuten lang bei einer Pumpengeschwindigkeit von 20 % zirkulieren lassen. Die Rampe-Klemme anziehen oder lockern, um das Probenvolumen im Renat-Fläschchen auf etwa 100 Milliliter einzustellen.

Danach die Rampenklammer vollständig festziehen und die Probe eine Minute lang umlaufen lassen. Anschließend die Pumpenrichtung für 20 Sekunden umkehren. Dadurch sammeln sich etwa 225 Milliliter Probe in der Tate-Flasche an.

Schalten Sie dann die Pumpe aus. Entfernen Sie den Schlauch vom Pumpenkopf und den Schlauch, der aus dem Filter austritt, und halten Sie den Schlauch über die Sammelflasche, um die restliche Probe in die Flasche zu befördern. Trennen Sie anschließend alle Schläuche von der Flasche und ersetzen Sie die belüftete Kappe durch eine nicht belüftete Kappe.

Überführen Sie die konzentrierte Probe in ein kegelförmiges Zentrifugenröhrchen mit 250 Milliliter Fassungsvermögen. Spülen Sie die Renatflasche zweimal mit je 10 Milliliter Reagenzwasser aus und geben Sie die Spüllösung in das Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe bei mindestens 1500 ×g für 15 Minuten.

Verwenden Sie keinen Bremsvorgang, um die Zentrifugation zu beenden. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand bis auf fünf Milliliter über dem Pellet abpipettieren. Es ist besondere Vorsicht geboten, stets im oberen Bereich der Flüssigkeitsoberfläche zu bleiben und das Absaugen von O-Zysten sowie von Zysten, die sich im Pellet befinden, zu vermeiden.

Vortexen Sie das Röhrchen, um das Pellet gründlich zu resuspendieren. Überführen Sie die Probe anschließend in ein flachseitiges Dyal L 10-Röhrchen, das jeweils ein Milliliter 10 X SL Puffer A und Puffer B enthält. Spülen Sie das Zentrifugenröhrchen zweimal mit je 2,5 Milliliter Reagenzwasser aus und geben Sie die Spüllösung zum Dyal L 10-Röhrchen hinzu. Geben Sie jeweils 100 Mikroliter magnetische Perlen-konjugierte Antikörper gegen *Cryptosporidium* und *Giardia* hinzu, um das Endvolumen auf 12 Milliliter aufzufüllen.

Danach die Röhre eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Mischer mit 18 U/min rotieren lassen. Die flache Seite der Röhre gegen das MP-sechs-Magnet führen und die Röhre zwei Minuten lang vorsichtig schaukeln, ohne die Röhre vom Magnet zu nehmen. Die flache Seite nach oben halten und den Überstand vorsichtig abgießen.

Unter Vorsicht, die auf der flachen Seite des Rohrs nahe dem Magneten zurückgehaltenen Perlen nicht zu stören. Entfernen Sie das Probenrohr vom Magneten und spülen Sie die flache Seite des Rohrs dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern Puffer A ab, wobei Sie die Partikel auf der runden Seite des Rohrs vermeiden. Überführen Sie jede Spüllösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das sich innerhalb eines MPCS-Magneten befindet.

Bei senkrechter Position des Magneten. Schließen Sie das Gefäß und schaukeln Sie es sanft für eine Minute. Danach, bei angebrachtem Magneten, saugen Sie mit einer Pasteurpipette, die am Boden des Gefäßes positioniert ist, den Überstand ab und geben Sie vorsichtig ein Milliliter PBS in das Gefäß.

Stellen Sie sicher, dass das Pellet mit den Perlen nicht gestört wird. Befestigen Sie das Röhrchen an der Wand neben dem Magneten. Entfernen Sie den Magnetstreifen und schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, bis die Perlen wieder suspendiert sind.

Setzen Sie den Magnetenstreifen wieder in die vertikale Position ein. Schütteln Sie das Gefäß vorsichtig für eine Minute und saugen Sie anschließend das Überstand ab, wobei Sie so viel wie möglich an Partikeln entfernen, ohne die Perlen zu stören. Nach dieser Waschung entfernen Sie den Magneten und geben 50 Mikroliter Reagenzwasser direkt auf die Perlenmasse.

Versetzen Sie das Gefäß 50 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit im Vortex-Mixer, um die Perlen erneut in Suspension zu bringen. Anschließend inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 80 Grad Celsius, wodurch sich die Giardia-Zysten und Cryptosporidium-O-Zysten von den Perlen lösen. Nach der Inkubation vortexen Sie die Probe erneut 30 Sekunden lang. Danach bringen Sie den Magneten in den MPCS in Schräglage ein, um die Perlen von den in Suspension befindlichen Zysten und O-Zysten zu trennen.

Übertragen Sie das Überstandsgemisch mit Zysten und O-Zysten auf einen Objektträger. Wiederholen Sie die Schritte zur Zugabe von Wasser, Vortexen und thermischen Dissoziation erneut, wobei der Überstand demselben Objektträger zugegeben wird. Anschließend platzieren Sie den Objektträger auf einer 37 Grad Celsius warmen Heizplatte, um die Suspension zu trocknen.

Beginnen Sie damit, 50 Mikroliter Methanol auf den Objektträger aufzutragen, um die Probe zu fixieren, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur trocknen. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter DPI-Lösung hinzu und inkubieren Sie den Objektträger zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Kerne anzufärben, verwenden Sie ein Kim-Tuch, um die Flüssigkeit vorsichtig aus der Vertiefung zu absorbieren, wobei darauf geachtet werden muss, die Vertiefung nicht zu berühren.

Anschießend 50 µL Easy Stain hinzufügen, um die Zellwände der Giardia-Zysten und der Cryptosporidium-O-Zysten anzufärben. Die Probe 30 Minuten bei 35 °C inkubieren. Die Färbung wie zuvor mit dem Kim-Tuch entfernen.

Anschließend langsam 300 µL kaltes Easy-Stain-Fixierpuffer hinzufügen, indem die Pipettenspitze vorsichtig außerhalb der Vertiefung platziert wird, sodass die Flüssigkeit in die Vertiefung fließen kann. Die Probe zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach den Puffer mit einem Kim-Wipe entfernen und 10 µL Einbettmedium auftragen. Vorsichtig ein Deckglas auf die Probe legen, dabei entstehende Blasen entfernen, und das Deckglas mit klarem Nagellack versiegeln. Mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops die Probe bei einer 200- bis 1000-fachen Vergrößerung sowie mit einem FSE- und DPI-Filter bei 200-facher Vergrößerung untersuchen; Zysten und O-Zysten erscheinen als leuchtend apfelgrüne, fluoreszierende ovale Strukturen mit hell hervorgehobenen Rändern.

Cryptosporidium-O-Zysten sind rund und variieren in der Größe zwischen vier und sechs Mikrometern. Giardia-Zysten sind größer, mit einer Breite von fünf bis 15 Mikrometern und einer Länge von acht bis 18 Mikrometern, und können bei einer 1000-fachen Vergrößerung rund oder ovoid erscheinen. Mithilfe des DPI-Filters lässt sich die innere Struktur der Zysten und CYS besser beurteilen.

Typischerweise sind innerhalb der *Cryptosporidium*-Oo- und *Giardia*-Zysten bis zu vier Sporozoiten sichtbar, die als HPI-Färbungskerne in himmelblauer Färbung erscheinen. Die DIC-Mikroskopie kann ebenfalls zur korrekten Identifizierung der Parasiten beitragen, da zusätzliche morphologische Merkmale besser erkennbar sind. *Cryptosporidium*-Sporozoiten können mittels DIC sichtbar gemacht werden; *Giardia*-Zysten weisen häufig eine oder mehrere deutlich erkennbare innere Strukturen auf, wie sichtbare Kerne, halbmondförmige Organellen, die als mittlere Körper bezeichnet werden, sowie innere Geißelstrukturen, die als Axoneme bekannt sind.

Es ist wichtig zu beachten, dass das Ultrafiltrationsverfahren mit Holo-Fasern die Fähigkeit besitzt, mehrere Mikroorganismen nachzuweisen. Außerdem können andere Nachweismethoden wie QPCR und Genotypisierung auf die konzentrierten Proben angewendet werden, wodurch diese Methode flexibler und besser an Ihre Anwendungen anpassbar wird. Vielen Dank fürs Zuschauen und lassen Sie uns wissen, falls Sie Fragen haben.