Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect Cryptosporidium Und Giardia spp.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, wasserbürtige, Kryptosporidium- und Giardia-Arten zu erkennen und sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem die Wasserprobe zunächst mit Tangentialströmung, Hohlfaser und Ultrafiltration konzentriert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Organismen zu eluieren und nach einem Zentrifugationsschritt Schmutz aus dem Filter aufzufangen.

Die immunomagnetische Trennung ermöglicht eine selektive Trennung der Parasiten von den konzentrierten Ablagerungen. Magnetkügelchen werden durch Wärmedissoziation von den Parasiten gelöst und mit Hilfe eines Magneten entfernt. Zysten und O-Zysten werden dann auf einen Objektträger gelegt, und die Probe wird für die Visualisierung durch Immunfluoreszenzmikroskopie gefärbt.

Der Hauptvorteil der hofi-Filtration gegenüber bestehenden Techniken besteht darin, dass der Ultra-Filter deutlich kostengünstiger ist und neben Cryptosporidium und Giardia auch mehrere Mikroorganismen wie Viren und Bakterien auffängt. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Immuntrennung sind, durch die Menge und Art des Rückstands herausgefordert, der mit verschiedenen Proben aus sehr klimatischen Bedingungen verbunden ist. Beginnen Sie mit dem Zusammenbau des Ultrafiltrationsgeräts in einer Biosicherheitswerkstatt.

Nach dem Zusammenbau funktioniert das Gerät wie folgt: Die Wasserprobe gelangt durch den schwarzen T-Anschluss in das System und bewegt sich durch den Pumpenkopf, das Manometer und in den Hohlfaser-Ultrafilter, das gefilterte Wasser gelangt aus der Seite des Filters in den Abfallbehälter. Das zurückgehaltene Wasser, das die Organismen enthält, wird in die Retent-Tape-Flasche gepresst und durch das System zirkuliert, bis das Wasservolumen reduziert ist. Um den Vorgang zu starten, entfernen Sie die Entlüftungskappe und öffnen Sie alle Klemmen mit Ausnahme der Quetschklemme zwei, die geschlossen sein sollte, damit sich die Retenflasche mit dem Wasser füllen kann, und stellen Sie die Pumpenrichtung so ein, dass die Wasserprobe in den Filter fließt.

Stellen Sie dann die Pumpendrehzahl auf 25 % ein und schalten Sie die Pumpe ein, wenn die Renate-Flasche zu zwei Dritteln vollständig geöffnet ist. Klemmklemme zwei und verschließen Sie die Flasche schnell fest mit der Entlüftungskappe. Überprüfen Sie alle Leitungen und Armaturen, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind.

Erhöhen Sie dann langsam die Pumpendrehzahl auf etwa 1,5 Liter pro Minute mit einem Messzylinder und einem Timer oder Durchflussmesser, stellen Sie sicher, dass die Filtratrate die Geschwindigkeit des aus der Abwasserleitung austretenden Wassers tatsächlich 1,5 Liter pro Minute beträgt. Überwachen Sie den Filtrationsprozess und stellen Sie sicher, dass sich die Retenflasche nie entleert, obwohl das Volumen leicht zunehmen oder abnehmen kann. Wenn die Lautstärke unter ein Drittel fällt, entfernen Sie die Entlüftungskappe und schließen Sie die Quetschklemme zwei.

Lassen Sie das Volumen in der Flasche wieder auf zwei Drittel anwachsen. Setzen Sie dann die Entlüftungskappe fest auf und öffnen Sie die Klemme zwei wieder. Sobald der Probenbehälter leer ist, schließen Sie die Quetschklemme und reduzieren Sie sofort die Pumpendrehzahl auf 20 %, entfernen Sie die Entlüftungskappe von der Retentflasche und schließen Sie die Rampenklemme, die das Abwasserrohr der Filtersäule mit dem Abwassertank verbindet.

Ziehen Sie die Rampenklemme fest oder lösen Sie sie, um das Volumen in der Flasche auf ca. 200 Milliliter einzustellen. Ziehen Sie dann die Rampenklemme fest, damit der Elucian die Probe eluieren kann. Geben Sie zunächst 500 Milliliter elucianische Lösung in den Probenbehälter und spülen Sie dabei das Innere des Behälters.

Legen Sie dann die 10-Milliliter-Pipette, die mit der Probenaufnahmeleitung verbunden ist, in den Behälter für die elucianische Lösung. Öffnen Sie die Quetschklemme eins und schließen Sie die Quetschklemme zwei kurzzeitig, um die elucianische Lösung aufzuzeichnen. Sobald die gesamte Lösung geladen ist, schließen Sie die Quetschklemme eins, öffnen Sie die Quetschklemme zwei und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang mit einer Pumpendrehzahl von 20 % zirkulieren. Ziehen Sie die Rampenklemme fest oder lockern Sie sie, um das Probenvolumen in der Renatflasche auf etwa 100 Milliliter einzustellen.

Ziehen Sie dann die Rampenklemme vollständig fest und lassen Sie die Probe eine Minute lang zirkulieren. Kehren Sie an dieser Stelle die Richtung der Pumpe für 20 Sekunden um. Dies führt zu einer Ansammlung von etwa 225 Millilitern Probe in der Tate-Flasche.

Schalten Sie dann die Pumpe aus. Entfernen Sie den Schlauch vom Pumpenkopf und den aus dem Filter austretenden Schlauch und halten Sie den Schlauch über die Tate-Flasche, um die verbleibende Probe in die Flasche zu drücken. Trennen Sie dann alle Schläuche von der Flasche und ersetzen Sie die Entlüftungskappe durch eine nicht entlüftungsfähige Kappe.

Übertragen Sie die konzentrierte Probe in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 250 Millilitern. Spülen Sie die Renatflasche zweimal mit 10 Millilitern Reagenzwasser und geben Sie die Spülflüssigkeit in das Zentrifugenröhrchen. Die Probe wird 15 Minuten lang mindestens 1500 Mal G zentrifugiert.

Verwenden Sie keine Pause, um die Zentrifugation zu stoppen. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig bis zu fünf Milliliter über dem Pellet abgesaugt. Es sollte besonders darauf geachtet werden, dass der Flüssigkeitsstand am oberen Rand bleibt und das Ansaugen von O-Zysten und Zysten, die sich im Pellet befinden, vermieden wird.

Wirbeln Sie das Rohr vor, um das Pellet gründlich wieder aufzuwirbeln. Übertragen Sie dann die Probe in ein flaches Dyal L 10-Röhrchen, das je einen Milliliter 10 X SL Puffer A und Puffer B enthält.Spülen Sie das Zentrifugenröhrchen zweimal mit 2,5 Millilitern Reagenzwasser und geben Sie die Spüllösung in das Dyal L 10 Röhrchen. Bringen Sie das Endvolumen auf 12 Milliliter und geben Sie jeweils 100 Mikroliter magnetische bead-konjugierte, Anti-Cryptosporidium- und Anti-Giardia-Antikörper in das Röhrchen.

Drehen Sie dann das Rohr nach der Drehung eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Mischer. Legen Sie die flache Seite des Rohrs gegen den MP six-Magneten und bewegen Sie das Rohr zwei Minuten lang vorsichtig, ohne das Rohr vom Magneten zu nehmen. Halten Sie die flache Seite nach oben und dekantieren Sie den Überstand.

Achten Sie darauf, die Perlen, die sich auf der flachen Seite des Rohrs in der Nähe des Magneten befinden, nicht zu stören. Nehmen Sie das Probenröhrchen vom Magneten und spülen Sie die flache Seite des Röhrchens dreimal mit 500 Mikrolitern Puffer A aus, um Schmutz auf der runden Seite des Röhrchens zu vermeiden. Übertragen Sie jedes Spülvolumen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das in einem MPCS-Magneten gehalten wird.

Mit dem Magneten in vertikaler Position. Schließen Sie die Tube und schaukeln Sie sie eine Minute lang vorsichtig. Dann, wenn der Magnet an Ort und Stelle ist, saugen Sie den Überstand mit einer Weidepipette am Boden des Röhrchens ab und geben Sie vorsichtig einen Milliliter PBS in das Röhrchen.

Achten Sie darauf, das Wulstpellet nicht zu stören. Befestigen Sie es an der Wand des Rohrs neben dem Magneten. Entfernen Sie den Magnetstreifen und bewegen Sie die Röhre vorsichtig, bis die Perlen wieder aufgewirbelt sind.

Setzen Sie den Magnetstreifen wieder in die vertikale Position ein. Wiegen Sie das Rohr eine Minute lang vorsichtig und saugen Sie den Überstand an, um so viel Schmutz wie möglich zu entfernen, ohne die Kügelchen zu stören. Entfernen Sie nach dieser Wäsche den Magneten und geben Sie 50 Mikroliter Reagenzwasser direkt auf die Perlenpalette.

Wirbeln Sie die Röhre 50 Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit ein, um die Perlen wieder aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Probe dann 10 Minuten lang bei 80 Grad Celsius, damit sich die Giardia-Zysten und Cryptosporidium-o-Zysten von den Kügelchen lösen können. Nach der Inkubation wirbeln Sie die Probe 30 Sekunden lang ein. Legen Sie dann den Magnetstreifen in der Schräglage in das MPCS, um die Kügelchen von den Zysten und O-Zysten in Suspension zu trennen.

Übertragen Sie den Überstand mit den Zysten und O-Zysten auf einen Vertiefungsträger. Wiederholen Sie die Schritte der Wasserzugabe, des Wirbels und der Wärmedissoziation ein zweites Mal, indem Sie den Überstand auf dieselbe Schiene geben. Na dann lege die Rutsche auf einen 37 Grad Celsius warmen Rutschenwärmer, um die Suspension zu trocknen.

Beginnen Sie damit, 50 Mikroliter Methanol auf den Objektträger aufzutragen, um die Probe zu fixieren und bei Raumtemperatur trocknen zu lassen. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter DPI-Lösung hinzu und inkubieren Sie den Objektträger zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Kerne zu färben, verwenden Sie ein Kim-Tuch, um den Klopf aus dem Brunnen zu entfernen, und achten Sie darauf, den Brunnen nicht zu berühren.

Fügen Sie dann 50 Mikroliter Easy Stain, um die Zellwand der Giardia-Zysten und Cryptosporidium-O-Zysten zu färben. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 35 Grad Celsius. Entfernen Sie den Fleck mit dem Kim-Tuch wie zuvor.

Fügen Sie dann langsam 300 Mikroliter kalten Fleckenfixierpuffer hinzu, indem Sie die Pipettenspitze vorsichtig außerhalb der Vertiefung platzieren und die Flüssigkeit in die Vertiefung ziehen lassen. Inkubieren Sie den Objektträger zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann den Puffer mit einem Kim-Tuch und tragen Sie 10 Mikroliter Eindeckmedium auf. Legen Sie vorsichtig einen Deckschirm auf die Probe, entfernen Sie alle Blasen und versiegeln Sie den Deckglas mit klarem Nagellack. Untersuchen Sie den Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer 200-fachen bis 1000-fachen Vergrößerung und einem fse-DPI-Filter bei einer 200-fachen Vergrößerung. Zysten und O-Zysten erscheinen als leuchtend apfelgrün fluoreszierende eiförmige Strukturen mit hellen hervorgehobene Kanten.

Cryptosporidium O-Zysten sind rund und haben eine Größe von vier bis sechs Mikrometern. Giardia-Zysten sind mit einer Breite von fünf bis 15 Mikrometern und einer Länge von acht bis 18 Mikrometern größer und können bei einer 1000-fachen Vergrößerung rund oder eiförmig sein. Und mit dem DPI-Filter kann die innere Struktur der Zysten und des CYS besser wahrgenommen werden.

Typischerweise sind bis zu vier Sporozoiten, die als himmelblaue DPI-Färbekeime erscheinen, in den Cryptosporidium O cys und Giardia Cys.DIC sichtbar. Die Mikroskopie kann auch bei der korrekten Identifizierung von Parasiten helfen, da zusätzliche morphologische Merkmale geschätzt werden können. Cryptosporidium-Sporozoiten können durch DIC sichtbar sein. Giardia-Zysten weisen oft eine oder mehrere erkennbare innere Strukturen auf, wie z. B. sichtbare Kerne, sichelförmige Organellen, die als Mediankörper bezeichnet werden, und innere Flagellenstrukturen, die Axone genannt werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass das Holofaser-Ultrafiltrationsverfahren in der Lage ist, mehrere Mikroorganismen einzufangen. Darüber hinaus können andere Detektionsassays wie QPCR und Genotypisierung auf die konzentrierten Proben angewendet werden, was diese Methode flexibler und anpassungsfähiger an Ihre Anwendungen macht. Vielen Dank fürs Zuschauen und lassen Sie es uns wissen, wenn Sie Fragen haben.