Name: Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect Cryptosporidium Und Giardia spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Lernen Sie die Tangentialfluss-Hohlfaser-Ultrafiltration zur Detektion von Cryptosporidium und Giardia in Wasserproben. Diese kostengünstige Methode kombiniert Immunomagnetische Separation mit Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Wir möchten Ann Grimm und Michael Zimmermann für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Doug Hamilton für seine technische Unterstützung danken.

1. Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration Vorgehensweise <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: Elutionslösung (1 l): Um 1 L analysenreines Wasser hinzufügen, 0,1 g Natriumpolyphosphat, 0,1 ml Tween-80 und 0,01 ml Y-30 Entschäumer. </li><li> Bereiten Filteranordnung (Abbildung 1) in einem biologischen Sicherheitsschrank: <ol><li> Legen Sie Masterflex I / P 73 Labor-Schlauch durch eine Masterflex I / P Easy-Load Pumpenkopf verbunden mit einer Masterflex I / P Präzisions Brushless-Antrieb. </li><li> Sichern Sie den Schlauch mit einer 0-60 psi, Glycerin gefüllte Manometer mit NPT-Filiale T-Verbinder vor der Pumpe Kopf mit einer Schraubverbindung ausgestatteten, und zu einem HDPE-T-Stecker hinter dem Pumpenkopf. </li><li> Montieren Sie die Flasche Retentat durch den Einbau eines Nalgene 53-B Befüllung / Entlüftung Verschluss mit Masterflex L / S 15 Labor-Schlauch und ein T-Stück und befestigen Sie sie in einen 1 l Nalgene schwere Polypropylen-Flasche. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 Schlauch wit einem Kneifklemme (Kneifklemme 2) und verbinden Sie es aus dem Retentat Flasche auf dem HDPE-T-Verbinder. </li><li> Verbinden Sie die Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch aus dem Manometer an der Asahi Kasei Rexeed 25S High-Flux-Dialysatoren mit einer Schraubzwinge, und aus dem Dialysegerät zum Retentat Flasche. Verwenden Sie maßgeschneiderte DIN-Adapter entwickelt, um ¼ &quot;ID Schlauch aufnehmen, um den Schlauch an die Hohlfaser-Ultrafiltration zu verbinden. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch mit einer Schlauchklemme (Schlauchklemme 1) und verbinden Sie es mit einer 10 ml Kunststoff-Pipette mit der Spitze und Baumwolle Stecker entfernt werden, um als Probenaufnahme Linie handeln, und befestigen Sie dann den Schlauch mit dem HDPE-T- Stecker. </li><li> Befestigen Sie ein Ende der Masterflex L/S-36 Labor-Schlauch mit einer Rampe spannen und verbinden Sie den Schlauch an den Abwasser-Anschluss in der Nähe der Ausfahrt Ende des Filters befindet. Legen Sie das andere Ende in den Abfallbehälter. </li></ol></li><li> In 0,01% (w / v) Natriumpolyphosphat die 10 L Wasserprobe und Mischen für 3 min. </li><li> Schließen einer Klammer 2und entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche. Alle anderen Klemmen offen sein sollte. </li><li> Stellen Sie die Pumpe Richtung, um die Flüssigkeit aus dem T-Stück bewegen, um das Manometer (von rechts nach links folgende Abbildung 1). Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe auf 25% der maximalen Drehzahl und schalten Sie die Pumpe. </li><li> Wenn das Retentat Flasche 2/3 voll, offene Schlauchklemme 2 ist, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe zum Retentat Flasche. Prüfen Sie alle Leitungen und Armaturen zu gewährleisten, keine Lecks vorhanden sind. </li><li> Steigern Sie langsam die Drehzahl der Pumpe auf den gewünschten Filtrationsrate (ca. 1,5 L / min), Prüfung auf Dichtheit prüfen. Mit einem Messzylinder und einen Timer oder Durchflussmesser, überprüfen Sie das Filtrat des Wassers dem Austritt aus dem Abwasser Linie (blau L / S 36 Schlauch in Abbildung 1). Luftblasen können typischerweise am Ausgangsende des Filters macht es schwierig, einen stabilen Druck und Filtration zu erzielen bilden. Dies wird durch Einklemmen des Abflussleitung von Hand für einen Moment korrigiert. Diese Aktionwird in der Regel Koax die Luftblase zum Filtrat Hafen und über das Abwasser Linie zu verlassen. Wiederholen Sie nach Bedarf, wenn man bedenkt, dass Erbsengröße Luftblasen oft unvermeidlich sind. </li><li> Überwachen Sie die Filtration. Messung und Aufzeichnung des Druckes und der Filtrationsrate nach Bedarf. Der Druck sollte nie mehr als 20 psi. Es wird empfohlen, dass die Filtrationsrate sollte nicht mehr als 2,0 l / min. Es ist wichtig, dass das Volumen des Wassers in der Flasche Retentat überwacht, um sicherzustellen, dass es nie entleert werden. Es ist normal, das Volumen zu erhöhen oder zu verringern leicht. Wenn die Wassermenge im Retentat Flasche fällt unter 1/3 voll ist, entfernen Sie dann die Entlüftungskappe und enge Kneifklemme 2 auf dem Retentat Flasche Linie. Bringen Sie die Lautstärke wieder auf etwa 2/3 voll, öffnen Sie die Klemme und schnell ersetzen Sie die Entlüftungskappe, wodurch eine gute Abdichtung. Wenn die Lautstärke im Retentat Flasche fällt schnell und kontinuierlich, dann sicher, das Retentat Flaschendeckel ist dicht und die Entlüftungskappe ist sicher an seinem Platz, und dass die tubing ist immer noch in Kontakt mit der Wasserprobe. Wenn diese Probleme nicht auftreten, dann ist es wahrscheinlich, dass die Dichtung im Retentat Flaschendeckel ist schlecht und sollte ausgetauscht werden. </li><li> Wenn die Probe Behälter leer ist, unmittelbar in der Nähe einer Klammer ein, reduzieren Sie die Drehzahl der Pumpe bis 20% seiner maximalen, entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche und schließen Sie die Rampe Klemme. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf ca. 200 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme Rampe. Nachdem das Volumen beträgt ca. 200 ml, ziehen Sie die Klammer für die Rampe Elutionsschritte (1,11-1,12). </li><li> In 500 ml Elutionslösung auf die Probe und spülen das Innere des Behälters. Legen Sie die 10 ml-Pipette mit dem Probenaufnahme Linie in den Behälter, der die Elutionslösung enthält. Stellen Sie sicher, dass die Rampe Nadelklemme geschlossen ist. Offene Schlauchklemme 1 und 2 nahe Kneifklemme momentan für die Erarbeitung der Elutionslösung. </li><li> Nachdem die 500 ml Elutionslösung erstellt wird, In der Nähe einer Klammer 1 und 2 offene Schlauchklemme. Lassen Sie die Elutionslösung für 5 Minuten mit einer Drehzahl von 20% seiner maximalen zirkulieren. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf etwa 100 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme an der Rampe Abwasser Linie. Ziehen Sie die Rampe Klammer und lassen Sie die Probe für 1 Minute zirkulieren. Vermeiden Ziehen von Luft in der Rohrleitung, indem sie die Menge der Probe in dem Retentat Flasche ist hoch genug, um die L / S 15 Schlauch in die Flasche Retentat bestimmt. </li><li> Umkehren der Richtung der Pumpe, die die Probe in das Retentat zwingt Flasche. Die Pumpe in umgekehrter für 20 Sekunden, was zu einer insgesamt ~ 225 ml Flasche im Retentat ausgeführt. Schalten Sie die Pumpe. </li><li> Entfernen Sie die Masterflex I / P 73 Schläuche aus dem Pumpenkopf und ziehen Sie das Manometer. Trennen Sie die Masterflex L / S 24 Schlauch Verlassen des Hohlfaser-Ultrafiltration. Halten Sie den Schlauch über dem Retentat Flasche, um alle verbleibenden Probe in die KraftRetentat Flasche. </li><li> Trennen Sie alle Schläuche von der Flasche, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe mit einem nicht-Entlüftungskappe. </li><li> Fahren Sie mit dem IMS / IFA Prozedur mit der ~ 225 ml Retentat. </li></ol> 2. Immunomagnetische Trennverfahren <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: <ol><li> Lassen Sie die Puffer in den Dynabeads enthalten: Cryptosporidium / Giardia Combo Kit auf Raumtemperatur bringen. </li><li> 1X SL-Puffer A: 1 ml 10X SL-Puffer A bis 9 ml gereinigtem Wasser. </li></ol></li><li> Übertragen der ~ 225 ml Flüssigkeit aus dem Retentat Flasche mit einer markierten konischen 250 ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Retentat Flasche zweimal mit 10 ml Reagenz Wasser, und fügen Sie die Spülungen an den konischen Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1500 xg für 15 min bei 4 ° C ohne Bremse. </li><li> Vorsichtig Aspiration des Überstands aus der Luft-Wasser-Grenzfläche zu 5 ml oberhalb der verdichteten Pellets für jeden 0,5 ml Pellet-Volumen (dh Anspruch 1 Aspirat5 ml oberhalb einer Pellet-Volumen von 1,3 ml, und saugen bis 5 ml für eine Pellet von 0,5 ml oder weniger). </li><li> Gründlich das Pellet in den Überstand durch Vortexen und / oder Mischen in der Pipette. Übertragen Sie jede 5 ml Volumen der Flüssigkeit auf die flachseitige Dynal L10 Röhrchen mit 1 ml jeder der SL-10X und 10X Puffer A SL-Puffer B. Spülen Sie den konischen Zentrifugenröhrchen zweimal mit 2,5 ml Reagenz Wasser und fügen Sie die zu spülen die L10 Rohr, wodurch das Gesamtvolumen der L10 Rohr 12 ml, einschließlich den Puffern. </li><li> Geben Sie 100 ul jeder der gut gemischten resuspendierten anti-Cryptosporidium und Giardia Dynabeads anti-L10 an die Röhre. Drehen Sie das Rohr L10 bei 18 UpM für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator Mixer. </li><li> Legen Sie die flache Seite der L10 Rohr gegen den MPC-6 Magneten und sanft die Hand Fels das Rohr Ende-zu-Ende, 180 ° für 2 Minuten. </li><li> Halten Sie die L10 Rohr in der MPC-6-Magnet mit dem Magnet nach oben, dekantieren Sie den Überstand weg von der Raupe / (oo) Zyste Komplexe bound auf den Magneten. Entfernen Sie die L10 Rohr vom Magneten und 0,5 ml 1X SL-Puffer A auf das Rohr. Die Suspension unter Verwendung von zwei zusätzlichen Spülungen von 0,5 ml 1X SL-Puffer A in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im MPC-S mit dem Magneten in der vertikalen Position gehalten wird. </li><li> Schütteln Sie die Röhre in den MPC-S Magnet 180 ° für 1 Minute. Mit dem Magneten an Ort und Stelle, Aspiration des Überstands mit einer Pasteurpipette nach unten gerichteten der Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> 1 ml 1X PBS, um die Vorderseite des Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen Sie den Magneten und rocken das Rohr nur sanft, bis die Beads resuspendiert werden. Ersetzen Sie den Magneten in die senkrechte Position und schaukeln das Rohr um 180 ° für 1 Minute. Saugen Sie das PBS spülen, ohne das Pellet Perle, mit einer Pasteurpipette, um so viel Schmutz wie möglich zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie den Magneten und 50 l Reagens Wasser auf die Rückseite des Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Röhre bei voller Geschwindigkeit für 50 Sekunden,dann Inkubieren der Röhrchen bei 80 ° C für 10 Minuten gefolgt von 30 Sekunden Wirbels folgt. Ersetzen Magnet in den MPC-S in der angeschrägten Position, die Bindung der Kügelchen an dem Magneten und Verlassen der (oo) Zysten in der Flüssigkeit. Tragen Sie die (oo) Zyste Suspension auf einen SingleSpot gut gleiten. </li><li> Wiederholen Schritt 2.10, Aufbringen der Flüssigkeit auf der gleichen Quelle, welche die erste Dissoziation. Objektträger auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 1 Stunde, um die Suspension auf den Objektträger gut trocknen lassen. </li></ol> 3. Färbung und Untersuchung <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: Arbeiten DAPI-Lösung: Fügen Sie 25 ul DAPI-Stammlösung (2 mg / ml in Methanol) zu 25 ml 1X PBS. Shop Lager und funktionierende Lösungen zwischen 1 ° C und 10 ° C im Dunkeln. </li><li> Bewerben 50 ul Methanol zu der Folie gut und lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen. </li><li> Dann werden 50 ul der Arbeiterklasse DAPI-Lösung auf den Objektträger gut und inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe, die DAPI aus dem Brunnen Docht. Bewerben 50 ul EasyStain. Bei 35 ° C für 30 Minuten. </li><li> Wick den Fleck weg das auch mit einem Kimwipe, und dann langsam 300 pl kaltem EasyStain Befestigung Puffer, so dass sie gut über den Rand fließen. Inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe, um den Puffer aus dem Brunnen Docht und anwenden 10 ul EasyStain Eindeckmedium. </li><li> Tragen Sie vorsichtig ein Deckgläschen werden, indem alle Blasen, die auftreten können. Dichten Sie das Deckglas mit klarem Nagellack. </li><li> Scannen Sie die gesamte Folie mit dem FITC-Filter, bei 200facher Gesamtvergrößerung, für eiförmig oder kugelig Apfel-grün fluoreszierende Objekte, die ein Oozysten oder Zysten ähneln. Untersuchen Sie alle diese Objekte mit dem DAPI-Filter bei 1000X Gesamtvergrößerung und dann mit DIC, auch bei 1000X Gesamtvergrößerung. Notieren Sie die Größe mit einem kalibrierten Okularmikrometer und morphologischen Eigenschaften. </li><li> Resultate zu dokumentieren. </li></ol> Hinweis: Weitere InformationenInformationen über die ursprüngliche Prozedur kann in der Dezember-2005-Version von EPA-Methode 1623 12 zu finden. Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration beschriebenen Verfahren wird anstelle Abschnitt 12.0 der EPA-Methode 1623 verwendet. Die Hitze Dissoziation ändert Abschnitt 13.3.3 der EPA-Methode 1623. Das Verfahren beschreibt auch eine zusätzliche PBS während der IMS-Prozess, der in der Dezember-2005-Version von Method 1623 nach Abschnitt 13.3.2.16 eingefügt werden können spülen. Die vollständige Liste der Verbrauchsmaterialien, Reagenzien und Geräte für die EPA-Methode 1623 auch diese Modifikationen verwendet wird in der Anlage aufgeführt. 4. Repräsentative Ergebnisse Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten durch die Prozesse der Filtration und Separation immunomagnetische zurückgewonnen werden durch mikroskopische Analyse nachgewiesen. Bei 200facher Gesamtvergrößerung, zeigt jeder Organismus eine typische Färbemuster, Größe und Form wie in Abbildung 2 gezeigt </strong&gt; sollte weiter beobachtet werden mittels Ölimmersion bei 1000X Gesamtvergrößerung. Dies wird für die Messung und Identifizierung von entweder typisch oder atypisch bestimmenden Merkmale Features, die ausschließen, würde eine positive Identifizierung zu ermöglichen. Cryptosporidium ist ein kugelförmiges Objekt eiförmig bis 4 bis 6 &amp;mgr; m im Durchmesser, die brillante apfelgrün FITC-Fluoreszenz mit hell hervorgehobenen Kanten (Abbildung 3A zeigt ). Mit DAPI UV, wird ein Oozysten weisen eine der folgenden Kategorien typisches Merkmal: hellblau interne Färbung mit einem grünen Rand und ohne deutliche Kerne (DAPI negativ), intensiv blaue Färbung interne oder bis zu vier verschiedene, himmelblauen Zellkerne (DAPI positiv - 3B). Atypische Features sind Abweichungen in Farbe, Struktur oder DAPI-Fluoreszenz (zB zu viele gefärbte Zellkerne, rot fluoreszierende internen Strukturen). Wenn das fluoreszierende Objekt Kriterien für typische FITC und DAPI-Färbung erfüllt hat, wird untersucht, mit Differential-Interferenz-conKontrast (DIC). Die Aufgabe wird für atypische äußeren oder inneren morphologischen Merkmalen wie Zellwand Ornamente oder ein oder zwei große Kerne Füllen der Zelle untersucht. Wenn atypische Strukturen nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere oder amorphe Struktur mit 1-4 Sporozoiten vorhanden (Abbildung 3C). Ebenso werden Giardia-ähnliche Objekte in Bezug auf FITC und DAPI-Färbung sowie DIC Eigenschaften, wie Axonemen, Median Körper und Kernen untersucht Giardia Zysten sind rund bis eiförmig brillante apfelgrün Objekte, 8 -. Von 18 &amp;mgr; m lange 5 - 15 mu m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (3D). Mit UV-DAPI wird die Giardia Zyste zeigen DAPI-negative Färbung, oder DAPI-positiven Eigenschaften (3E). Das fluoreszierende Aufgabe wird durch DIC für typischen und atypischen Merkmalen in der gleichen Weise untersucht wie Cryptosporidium beschrieben.Wenn atypische Merkmale nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere haltige amorphe Struktur, oder mit einem oder mehreren Art der internen Strukturen vorhanden (3F). Jeder Organismus, der beobachtet, dass atypische Merkmale aufweisen wird, sollte nicht als ein (oo) Zyste gezählt werden. Die mikroskopische Analyse von Umweltproben kann eine Herausforderung sein, da es Organismen, die Auto-fluoreszieren oder kann mit dem FITC-konjugierten anti-Cryptosporidium und / oder anti-Giardia Antikörper ein kreuzreagieren. Es wird empfohlen, ein Analyst vertraut mit aquatischen Mikroben und Kritik Dutzende von Dias zu identifizieren Erfahrung Cryptosporidium und Giardia zu gewinnen. Mindestens drei (oo) Zysten an der positiven Färbung Kontrollen sollten vor jeder Sitzung am Mikroskop charakterisiert werden. Qualitätskontrolle Proben können mit (oo) Zysten versetzt werden, um die Prozent rec bestimmenOvery für jedes Protozoon mit der Berechnung: (Oo) Zyste prozentuale Ausbeute = ((QC Probe Graf - Graf von unversetzten Sample) / Spike) x 100. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grafische Darstellung der Tangentialströmung Hohlfaser-Ultrafiltration. Der Schlauch wird farbkodiert, um zu helfen ist die Montage des Systems. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vertreter Fluoreszenzbild Cryptosporidium und Giardia (oo) Zysten. Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden mit FITC-markiertem anti-Cryptosporidium / Giardia Antikörpern gefärbt. Arrows, Giardia Zysten, Pfeilspitzen, Cryptosporidium-Oozysten. Insgesamt vier Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden sechs in der Ebene der Fokus gefunden. Die Proben beobachtbareed unter 200-facher Vergrößerung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Abbildung 3 Vertreter mikroskopische Aufnahmen von Cryptosporidium-Oozysten und Zysten Giaridia zur Charakterisierung herangezogen Cryptosporidium-Oozysten (A - C).. Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von kugelförmigen Objekten von 4 bis 6 &amp;mgr; m im Durchmesser mit hell hervorgehobenen Kanten (A) mit bis zu vier verschiedene, himmelblauen DAPI Kerne (B) und 03.59 Sporozoiten (S) pro Oozysten (C). Giardia-Zysten (D - F). Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von rund bis eiförmig Objekte von 8 bis 18 mu m lang und 5 bis 15 &amp;mgr; m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (D) mit bis zu vier himmelblauen DAPI Kernen (E) und mit einem oder mehreren erkennbaren inneren Struktur solcher als Kerne (N), mittleren Körper (M) und Axonemen oder (A) (F). Weiße Pfeile, brillante apfelgrün Fluoreszenzfärbung Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wBesserwisser, weiße Pfeilspitzen, DAPI positiven Kernen. Proben beobachtet unter 1000-facher Vergrößerung.

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Die United States Environmental Protection Agency durch ihr Amt für Forschung und Entwicklung in Zusammenarbeit mit dem Amt für Boden-und Trinkwasser der Technical Support Center finanzierte die Forschung hier beschrieben. Alle Arbeiten wurden vor Ort bei der US-EPA, Cincinnati, Ohio unterstützt. Obwohl die Informationen in diesem Artikel beschrieben wurde ganz oder teilweise von der United States Environmental Protection Agency unter Vertrag (Contract EP-C-06-031) zu Shaw Environmental and Infrastructure, Inc finanziert wird, ist es nicht unbedingt die Meinung der Agentur und nicht offiziell ist rein zufällig. Es ist zu Agentur Kritik unterzogen wurde und zur Veröffentlichung freigegeben.

Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration ist eine alternative und effiziente Technik für die anfängliche Konzentration von Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Cysten aus Wasser. Hohlfaser-Ultrafiltration ist weniger teuer als herkömmliche Filter. Da es die Möglichkeit, Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten aus einer Vielzahl von verschiedenen Matrices Wasser konzentrieren muss, ist es eine sinnvolle Alternative zu den derzeitigen Filtertechniken für EPA-Methode 1623 verwendet. Wie bei den meisten anderen Filtrationsverfahren ist Hohlfaser-Ultrafiltration anfällig für Verschmutzung mit extrem trüben Proben. Hoher Wasserdruck würde aus dem Filter Fouling führen, daher empfiehlt es sich, den Druck während der Filtration Lauf zu überwachen. Neben Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten, hat Hohlfaser-Ultrafiltration der Lage gezeigt, konzentrieren Bakterien und Viren 1-3,5,8. Hohlfaser-Ultrafiltration outlined in dieser Methode können mehrere Organismen in einer einzigen Probe zu konzentrieren. Es ist bemerkenswert, dass die Erzielung einer endgültigen Volumen zwischen 200 und 250 ml ist die kritische letzte Schritt in der Konzentration Prozedur, so daß zusätzliche Zentrifugationsschritte, die in (oo) Zyste Verlust zur Folge haben, vermieden werden (Schritt 2.2). Allerdings kann damit das Volumen in der Flasche bis zu stark abnimmt haben ungünstige Auswirkungen auf die Erholungen da es nicht genug Flüssigkeitsvolumen, um alle Oozysten oder Zysten in das Retentat Flasche zu zwängen. Daher empfiehlt es sich um ein Endvolumen von 200 bis 250 ml zu erhalten. Wärme-Dissoziation ist eine Alternative zu der Säure Dissoziation Schritt in Method 1623. Diese Alternative Schritt hat sich gezeigt, Cryptosporidium Oozysten Erholung zu verbessern und die Verfahren Variation, wenn entweder von Fluss oder Wasser 9 Reagenz isoliert. Ein Side-by-Side-Vergleich von Säure und Hitze Dissoziation Methoden nachgewiesen, dass unter Anwendung von Wärme zu Dissoziationte die Organismen von den immunomagnetische Kügelchen erzeugt höhere mittlere Wiederfindung sowohl für Cryptosporidium und Giardia. Darüber hinaus war die Genauigkeit der Cryptosporidium und Giardia Einziehungen besser in Proben mit Wärme Dissoziation verarbeitet verglichen mit Säuredissoziationskonstante 9. Der Einbau von HFUF als die Konzentration Schritt ermöglicht eine größere Flexibilität durch die Möglichkeit, mehrere Organismen konzentrieren. Darüber hinaus ist es eine preiswerte Alternative zum aktuellen Methode 1623 Filtration Optionen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ausstattung / Reagent </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R nass Hohlfaser-Ultrafilter </td><td> Wählen Medical </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P-73 (Masterflex R-3603), oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P Präzisions Brushless Antrieb </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P-Easy Load Pumpenkopf </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Schwarze HDPE-T-Stück, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> US-Kunststoffe </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-Verbinder L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene Heavy-Duty-PP 1 L Flasche </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml Pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene Füllung / Entlüftungskappe für 1/4 &quot;-Schlauch, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manometer </td><td> Cole Parmer </td><td> Ein-680-46-10 </td></tr><tr><td> Gerade Verschraubung, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> NPT-Filiale tee, PP-natur </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30.610-75 </td></tr><tr><td> Quetschklemmen, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> CuStom fit DIN-Adapter </td><td> Molded Products Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Ring-Stand </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Ring Stativklammern </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05 bis 769-6Q </td></tr><tr><td> Keck Rampe Klammer, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Natriumpolyphosphat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Natriumthiosulfatpentahydrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Entschäumer Y-30-Emulsion </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L Faltbarer High-Density-Polyethylen Cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren Flaschenregal </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Einweg-Trichter </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122 bis 10 </td></tr><tr><td> Waschflasche </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06.252-40 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Ausschwingrotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Zentrifugenbecher Adapter für 250 ml konischen Röhrchen </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 pl großen Bohrung Pipettenspitzen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> Vacushield Filter </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml Pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia Combo Kit </td><td> IchDexx </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Falke </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 flachwandigen Rohre </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6-Magnet </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml Pipetten </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml geringe Haftung Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9-Zoll-Pasteurpipetten </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S Magnet </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Wirbel </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads Rotator Mixer </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Rüstung Perlen </td><td> Lab Rüstung </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Digital-Thermometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung 1X pH 7,4 (PBS 1X) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Single-Spot-Dias </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain direkten Kit </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Klaren Nagellack </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Boekel Scientific </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> schieben wärmer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Immersionsöl, Typ A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Nikon 90i-Mikroskop mit DIC-Fähigkeiten </td><td> Nikon </td><td> MBA-77000 </td></tr><tr><td> Plan APO 100x Öl-Objektiv </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Planen Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC-Filter </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI-Filter </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-Cite Fluoreszenzilluminator </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Objektiv-Papier </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard Einweg-Beutel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard Kanülenbox </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3% Wasserstoffperoxid </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Bleichmittel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

eine Änderung, die epa-methode 1623 tangential flow hohlfaser-ultrafiltration und wärme dissoziationsstufen nutzt, um auf wasserbasis detect<em&gt; cryptosporidium</em&gt; und<em&gt; giardia spp.</em

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium und Giardia Arten sind zwei der häufigsten Protozoen, die Ursache wässrigen Durchfall-Ausbruch von Krankheiten weltweit. Zur besseren Charakterisierung der Prävalenz dieser Erreger, EPA-Methode 1623 wurde entwickelt und verwendet, um Mengen dieser Organismen in der US-Trinkwasser zu überwachen liefert 12. Verfahren besteht aus drei Hauptteilen: Das erste ist die Probenkonzentration, bei dem mindestens 10 l Wundfläche Wasser gefiltert wird. Die Organismen und eingeschlossen Trümmer werden dann aus dem Filter eluiert und zentrifugiert, um weitere Konzentration der Probe. Der zweite Teil der Methode wird ein immunomagnetische Trennverfahren, wo die konzentrierte Wasserprobe zu immunomagnetische Kügelchen, die spezifisch an den Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten ermöglicht für bestimmte Entfernung der Parasiten aus der konzentrierten Schutt angewendet wird. Diese (oo) Zysten werden dann von den magnetischen Beads durch eine Säure-Dissoziations-Verfah abgelöstDure. Der letzte Teil des Verfahrens ist die Immunfluoreszenzfärbung und Aufzählung, wo (oo) Zysten zu einer Folie, gebeizt angewendet werden, und aufgezählt durch Mikroskopie. Methode 1623 hat vier börsennotierte Probenkonzentration Systeme zu Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten in Wasser einzufangen: Envirochek Filter (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV-Filter (Pall Corporation), Filta-Max-Filter (IDEXX, Westbrook, MA), oder Continuous Flow Zentrifugation (Haemonetics, Boston, MA). Allerdings haben Cryptosporidium und Giardia (oo) Zyste Erholungen stark abhängig von der Quelle Wasser-Matrix und Filtern eingesetzt 1,14 variiert. Eine neue Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration (HFUF)-System wurde vor kurzem gezeigt, dass effizienter und robust Gewinnen Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten aus verschiedenen Matrices Wasser, außerdem ist es günstiger als andere Kapsel-Filter-Options und kann mehrere Erreger gleichzeitig konzentrieren 1-3,5-8,10,11. Darüber hinaus zeigten frühere Studien von Hill und Kollegen, dass die HFUF deutlich Cryptosporidium-Oozysten Erholungen verbessert, wenn sie direkt mit den Envirochek HV-Filter 4 verglichen. Zusätzliche Änderungen an den gegenwärtigen Methoden sind auch berichtet worden, um die Leistungsfähigkeit der Methode zu verbessern. Austauschen der Säuredissoziationskonstante Verfahren mit Wärme Dissoziation wurde gezeigt, dass sie wirksam bei der Abtrennung Cryptosporidium aus den magnetischen Kügelchen in einigen Matrizen 9,13. Dieses Protokoll beschreibt eine modifizierte Methode 1623, die das neue System verwendet HFUF Filtration mit der Hitze Dissoziation Schritt. Die Verwendung von HFUF mit diesem modifizierten Verfahren ist eine preiswerte Alternative zum aktuellen EPA-Methode 1623 Filtration Optionen und bietet mehr Flexibilität durch die Möglichkeit der Konzentration mehrerer Organismen.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration Probenkonzentration und eine Wärme Dissoziation als alternative Schritte zum Nachweis von wässrigen<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Und<em&gt; Giardia</em&gt; Arten der amerikanischen Umweltschutzbehörde EPA-Methode 1623.

Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Und<em&gt; Giardia spp.</em

*Cryptosporidium*- und *Giardia*-Spezies gehören zu den am weitesten verbreiteten Protozoen, die weltweit Ausbrüche von wassergebundenen diarrhöischen Erkrankungen verursachen. Um ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, wasserbürtige Cryptosporidium- und Giardia-Arten nachzuweisen und sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Wasserprobe mittels tangentialer Flussfiltration mit Hohlfasermembranen durch Ultrafiltration angereichert wird. Im zweiten Schritt werden die Organismen eluiert und die Verunreinigungen durch eine Zentrifugierstufe aus dem Filter zurückgehalten.Mittels immungestützter magnetischer Trennung ist eine selektive Abtrennung der Parasiten von dem konzentrierten Zelltrümmern möglich. Die magnetischen Kügelchen werden durch thermische Dissoziation von den Parasiten gelöst und mithilfe eines Magneten entfernt. Anschließend werden die Zysten und O-Zysten auf einen Objektträger gegeben, und die Probe wird zur Visualisierung per Immunfluoreszenzmikroskopie angefärbt.Der Hauptvorteil der hofi-Filtration gegenüber bestehenden Techniken liegt darin, dass der Ultrafilter deutlich kostengünstiger ist und zusätzlich zu Cryptosporidium und Giardia auch mehrere andere Mikroorganismen wie Viren und Bakterien abtrennt. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Immunoisolation sind, durch die Menge und Art von Verunreinigungen, die mit unterschiedlichen Proben aus sehr variierenden klimatischen Bedingungen einhergehen, vor Herausforderungen gestellt. Beginnen Sie damit, die Ultrafiltrationsapparatur innerhalb eines Sicherheitswerkbanks zu montieren.Nach der Montage funktioniert die Apparatur wie folgt: Die Wasserprobe tritt in das System ein, indem sie durch den schwarzen T-Anschluss fließt, und bewegt sich dann durch den Pumpenkopf, das Manometer und in den Hohlfaser-Ultrafilter. Das gefilterte Wasser tritt seitlich aus dem Filter aus und gelangt in den Abfallbehälter. Das zurückgehaltene Wasser, das die Organismen enthält, wird in die Retentatflasche gedrückt und durch das System erneut zirkuliert, bis das Wasservolumen reduziert ist. Um mit dem Verfahren zu beginnen, entfernen Sie die Entlüftungskappe und öffnen Sie alle Schellen, mit Ausnahme der Schlauchklemme zwei, die geschlossen bleiben sollte, damit die Retentatflasche sich mit Wasser füllen kann. Stellen Sie die Pumpenrichtung so ein, dass die Wasserprobe in den Filter fließt.Danach die Pumpengeschwindigkeit auf 25 % einstellen und die Pumpe einschalten, wenn die Permeatflasche zu zwei Dritteln gefüllt ist. Schlauchklemme zwei abdrücken und die Flasche schnell mit der Belüftungskappe dicht verschließen. Alle Leitungen und Anschlüsse überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Leckagen vorliegen.Erhöhen Sie dann langsam die Pumpgeschwindigkeit auf etwa 1,5 Liter pro Minute, wobei Sie einen Messzylinder und einen Timer oder ein Durchflussmessgerät verwenden, und überprüfen Sie, ob die Filtratgeschwindigkeit – also die Geschwindigkeit des Wassers, das aus der Ablaufleitung austritt – tatsächlich 1,5 Liter pro Minute beträgt. Beobachten Sie den Filtrationsprozess, wobei sichergestellt werden muss, dass die Retentflasche niemals leerläuft, obwohl das Volumen leicht ansteigen oder abnehmen kann. Wenn das Volumen unter ein Drittel fällt, nehmen Sie die Entlüftungskappe ab und schließen Sie die Schlauchklemme zwei.Lassen Sie das Volumen in der Flasche erneut auf zwei Drittel ansteigen. Danach setzen Sie die Entlüftungskappe fest wieder auf und öffnen Sie die Klemme zwei erneut. Sobald der Probengefäß leer ist, schließen Sie die Schraubklemme eins unverzüglich, verringern Sie die Pumpengeschwindigkeit auf 20 %, entfernen Sie die Entlüftungskappe von der Retentatflasche und schließen Sie die Rampenklemme, die das Abflussrohr der Filterkolonne mit dem Abwassertank verbindet.Stellen Sie mithilfe der Rampenklemme das Volumen in der Retentatflasche auf etwa 200 Milliliter ein. Anschließend ziehen Sie die Rampenklemme für die Eluierung fest, um die Probe zu eluieren. Geben Sie zunächst 500 Milliliter Eluierungslösung zum Probenbehälter hinzu und spülen dabei die Innenseite des Behälters aus.Danach die 10-Milliliter-Pipette, die mit der Probenentnahmleitung verbunden ist, in den Eluierlösung-Behälter stellen. Den Schraubklemmverschluss eins öffnen und den Schraubklemmverschluss zwei kurzzeitig schließen, um die Eluierlösung aufzusaugen. Sobald die gesamte Lösung aufgenommen wurde, Schraubklemmverschluss eins schließen, Schraubklemmverschluss zwei öffnen und die Lösung fünf Minuten lang bei einer Pumpengeschwindigkeit von 20 % zirkulieren lassen. Die Rampe-Klemme anziehen oder lockern, um das Probenvolumen im Renat-Fläschchen auf etwa 100 Milliliter einzustellen.Danach die Rampenklammer vollständig festziehen und die Probe eine Minute lang umlaufen lassen. Anschließend die Pumpenrichtung für 20 Sekunden umkehren. Dadurch sammeln sich etwa 225 Milliliter Probe in der Tate-Flasche an.Schalten Sie dann die Pumpe aus. Entfernen Sie den Schlauch vom Pumpenkopf und den Schlauch, der aus dem Filter austritt, und halten Sie den Schlauch über die Sammelflasche, um die restliche Probe in die Flasche zu befördern. Trennen Sie anschließend alle Schläuche von der Flasche und ersetzen Sie die belüftete Kappe durch eine nicht belüftete Kappe.Überführen Sie die konzentrierte Probe in ein kegelförmiges Zentrifugenröhrchen mit 250 Milliliter Fassungsvermögen. Spülen Sie die Renatflasche zweimal mit je 10 Milliliter Reagenzwasser aus und geben Sie die Spüllösung in das Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe bei mindestens 1500 ×g für 15 Minuten.Verwenden Sie keinen Bremsvorgang, um die Zentrifugation zu beenden. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand bis auf fünf Milliliter über dem Pellet abpipettieren. Es ist besondere Vorsicht geboten, stets im oberen Bereich der Flüssigkeitsoberfläche zu bleiben und das Absaugen von O-Zysten sowie von Zysten, die sich im Pellet befinden, zu vermeiden.Vortexen Sie das Röhrchen, um das Pellet gründlich zu resuspendieren. Überführen Sie die Probe anschließend in ein flachseitiges Dyal L 10-Röhrchen, das jeweils ein Milliliter 10 X SL Puffer A und Puffer B enthält. Spülen Sie das Zentrifugenröhrchen zweimal mit je 2,5 Milliliter Reagenzwasser aus und geben Sie die Spüllösung zum Dyal L 10-Röhrchen hinzu. Geben Sie jeweils 100 Mikroliter magnetische Perlen-konjugierte Antikörper gegen *Cryptosporidium* und *Giardia* hinzu, um das Endvolumen auf 12 Milliliter aufzufüllen.Danach die Röhre eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Mischer mit 18 U/min rotieren lassen. Die flache Seite der Röhre gegen das MP-sechs-Magnet führen und die Röhre zwei Minuten lang vorsichtig schaukeln, ohne die Röhre vom Magnet zu nehmen. Die flache Seite nach oben halten und den Überstand vorsichtig abgießen.Unter Vorsicht, die auf der flachen Seite des Rohrs nahe dem Magneten zurückgehaltenen Perlen nicht zu stören. Entfernen Sie das Probenrohr vom Magneten und spülen Sie die flache Seite des Rohrs dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern Puffer A ab, wobei Sie die Partikel auf der runden Seite des Rohrs vermeiden. Überführen Sie jede Spüllösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das sich innerhalb eines MPCS-Magneten befindet.Bei senkrechter Position des Magneten. Schließen Sie das Gefäß und schaukeln Sie es sanft für eine Minute. Danach, bei angebrachtem Magneten, saugen Sie mit einer Pasteurpipette, die am Boden des Gefäßes positioniert ist, den Überstand ab und geben Sie vorsichtig ein Milliliter PBS in das Gefäß.Stellen Sie sicher, dass das Pellet mit den Perlen nicht gestört wird. Befestigen Sie das Röhrchen an der Wand neben dem Magneten. Entfernen Sie den Magnetstreifen und schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, bis die Perlen wieder suspendiert sind. Setzen Sie den Magnetenstreifen wieder in die vertikale Position ein. Schütteln Sie das Gefäß vorsichtig für eine Minute und saugen Sie anschließend das Überstand ab, wobei Sie so viel wie möglich an Partikeln entfernen, ohne die Perlen zu stören. Nach dieser Waschung entfernen Sie den Magneten und geben 50 Mikroliter Reagenzwasser direkt auf die Perlenmasse. Versetzen Sie das Gefäß 50 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit im Vortex-Mixer, um die Perlen erneut in Suspension zu bringen. Anschließend inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 80 Grad Celsius, wodurch sich die Giardia-Zysten und Cryptosporidium-O-Zysten von den Perlen lösen. Nach der Inkubation vortexen Sie die Probe erneut 30 Sekunden lang. Danach bringen Sie den Magneten in den MPCS in Schräglage ein, um die Perlen von den in Suspension befindlichen Zysten und O-Zysten zu trennen.Übertragen Sie das Überstandsgemisch mit Zysten und O-Zysten auf einen Objektträger. Wiederholen Sie die Schritte zur Zugabe von Wasser, Vortexen und thermischen Dissoziation erneut, wobei der Überstand demselben Objektträger zugegeben wird. Anschließend platzieren Sie den Objektträger auf einer 37 Grad Celsius warmen Heizplatte, um die Suspension zu trocknen.Beginnen Sie damit, 50 Mikroliter Methanol auf den Objektträger aufzutragen, um die Probe zu fixieren, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur trocknen. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter DPI-Lösung hinzu und inkubieren Sie den Objektträger zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Kerne anzufärben, verwenden Sie ein Kim-Tuch, um die Flüssigkeit vorsichtig aus der Vertiefung zu absorbieren, wobei darauf geachtet werden muss, die Vertiefung nicht zu berühren.Anschießend 50 µL Easy Stain hinzufügen, um die Zellwände der Giardia-Zysten und der Cryptosporidium-O-Zysten anzufärben. Die Probe 30 Minuten bei 35 °C inkubieren. Die Färbung wie zuvor mit dem Kim-Tuch entfernen.Anschließend langsam 300 µL kaltes Easy-Stain-Fixierpuffer hinzufügen, indem die Pipettenspitze vorsichtig außerhalb der Vertiefung platziert wird, sodass die Flüssigkeit in die Vertiefung fließen kann. Die Probe zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach den Puffer mit einem Kim-Wipe entfernen und 10 µL Einbettmedium auftragen. Vorsichtig ein Deckglas auf die Probe legen, dabei entstehende Blasen entfernen, und das Deckglas mit klarem Nagellack versiegeln. Mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops die Probe bei einer 200- bis 1000-fachen Vergrößerung sowie mit einem FSE- und DPI-Filter bei 200-facher Vergrößerung untersuchen; Zysten und O-Zysten erscheinen als leuchtend apfelgrüne, fluoreszierende ovale Strukturen mit hell hervorgehobenen Rändern.Cryptosporidium-O-Zysten sind rund und variieren in der Größe zwischen vier und sechs Mikrometern. Giardia-Zysten sind größer, mit einer Breite von fünf bis 15 Mikrometern und einer Länge von acht bis 18 Mikrometern, und können bei einer 1000-fachen Vergrößerung rund oder ovoid erscheinen. Mithilfe des DPI-Filters lässt sich die innere Struktur der Zysten und CYS besser beurteilen.Typischerweise sind innerhalb der *Cryptosporidium*-Oo- und *Giardia*-Zysten bis zu vier Sporozoiten sichtbar, die als HPI-Färbungskerne in himmelblauer Färbung erscheinen. Die DIC-Mikroskopie kann ebenfalls zur korrekten Identifizierung der Parasiten beitragen, da zusätzliche morphologische Merkmale besser erkennbar sind. *Cryptosporidium*-Sporozoiten können mittels DIC sichtbar gemacht werden; *Giardia*-Zysten weisen häufig eine oder mehrere deutlich erkennbare innere Strukturen auf, wie sichtbare Kerne, halbmondförmige Organellen, die als mittlere Körper bezeichnet werden, sowie innere Geißelstrukturen, die als Axoneme bekannt sind.Es ist wichtig zu beachten, dass das Ultrafiltrationsverfahren mit Holo-Fasern die Fähigkeit besitzt, mehrere Mikroorganismen nachzuweisen. Außerdem können andere Nachweismethoden wie QPCR und Genotypisierung auf die konzentrierten Proben angewendet werden, wodurch diese Methode flexibler und besser an Ihre Anwendungen anpassbar wird. Vielen Dank fürs Zuschauen und lassen Sie uns wissen, falls Sie Fragen haben.

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