Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Dieses Experiment verwendet komplementäre bildgebende Verfahren, um die Angiogenese in einem Rattenmodell des Brustkrebses nicht-invasiv zu untersuchen. Für die Knochenmetastasierung werden zunächst humane Brustkrebszellen in die Arteria epigastrica superficialis injiziert, um ortsspezifische osteolytische Knochenmetastasen am Hinterbein von nackten Ratten zu induzieren. Nach 25 bis 30 Tagen wird das Tier für die bildgebende Analyse vorbereitet und Daten mittels Magnetresonanztomographie, Computertomographie und Ultraschalluntersuchung erfasst.

Anschließend verwenden Sie die komplementären morphologischen und funktionellen Daten dieser bildgebenden Verfahren, um unterschiedliche Aspekte der Gefäßneubildung in osteolytischen Läsionen zu beschreiben. Zu den erhaltenen Ergebnissen gehören die Architektur größerer Blutgefäße, das lokale Blutvolumen, die Perfusion und Permeabilität sowie die Echtzeit-Bildgebung der Gefäßversorgung von Knochenmetastasen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen zur Rolle der Angiogenese bei der Pathogenese von Knochenmetastasen zu beantworten, was Auswirkungen auf die Bildgebung und Behandlung maligner knöcherner Läsionen hat.

Für das hier beschriebene Tiermodell besteht keine Notwendigkeit, eine knochenspezifische Subzelllinie von N-D-A-M-B 2 3 1 zu verwenden, da die Tumoransiedlungsrate über 90 % beträgt. Beginnen Sie mit einer logarithmisch wachsenden Kultur humaner Brustkrebszellen in RPMI 1640-Medium, das mit 10 % Fötenrinderserum ergänzt ist. Nach der Gewinnung der subkonfluenten Tumorzellen mittels Trypsin erfolgt die Zellzählung mit einer Neubauer-Kammer, anschließend werden die Zellen in RPMI 1640 suspendiert. Alle Experimente wurden von dem zuständigen staatlichen Tierversuchsethikkomitee genehmigt. Betäuben Sie die sechs bis acht Wochen alten Ratten gemäß dem im beigefügten Text für das chirurgische Vorgehen angegebenen Protokoll.

Verwenden Sie ein geeignetes binokulares Operationsmikroskop mit einer 16-fachen Vergrößerung. Beginnen Sie damit, die Haut und das subkutane Gewebe im inguinalen Bereich über eine Länge von zwei bis drei Zentimetern zu schneiden. Dissezieren Sie nun alle Arterien, die vom Arteria-femoralis-Stamm abzweigen, und setzen Sie Clips an der Arteria femoralis proximal zum Ursprung der S CA sowie an der DGA, PA und S SA an, um den lokalen Blutfluss vorübergehend zu unterbinden.

Dann ligieren Sie die A. subclavia (SEA) an ihrem distalen Teil, um die Öffnung dieses Gefäßes ohne Blutung zu ermöglichen. Schneiden Sie die SEA proximal der Ligatur durch und geben Sie eine 1%ige Pipen-Lösung auf die SEA. Schneiden Sie nun etwa die Hälfte des Durchmessers der SEA mit der Schere durch und führen Sie, während Sie das durchtrennte Ende des Gefäßes mit einer Pinzette festhalten, eine Nadel in das Gefäßlumen ein.

Falls möglich, befestigen Sie die Nadel an einem externen Gerät, um unregelmäßige Bewegungen zu verringern, die zu einer Perforation der Gefäßwand führen könnten. Anschließend verbinden Sie eine Spritze mit der Nadel. Entfernen Sie die Klemme von der distalen Arteria femoralis und platzieren Sie sie an der Arteria saphena.

Führen Sie langsam 0,2 Milliliter der MDA-MB-231-Brustkrebszellen in die A. epigastrica superficialis ein. Beachten Sie, dass aufgrund der Clips die Zellen in die DGA und pa geleitet werden. Entfernen Sie die Nadel und ligieren Sie die A. epigastrica superficialis, um Blutungen zu verhindern, bevor Sie die arteriellen Clips entfernen.

Nach der Wundverschluss und Beendigung der Inhalationsanästhesie eine Tumorwachstumsphase von 25 bis 30 Tagen beim Tier zulassen. Verwenden Sie einen speziellen experimentellen MR-Scanner oder ein humanes MR-System mit einer geeigneten Tierradiofrequenzspule wie dieser selbstgebauten Spule für die Hochfrequanregung und -detektion. Nach der Anästhesie der Ratte mit Sauerstoff und ISO-Fluor legen Sie einen Katheter in die Schwanzvene und fixieren Sie ihn am Schwanz.

Verbinden Sie mittels Klebeband eine Spritze, die das Kontrastmittel enthält. Anschließend platzieren Sie die Ratte im MR-System, wobei die Inhalationsanästhesie aufrechterhalten wird. Beginnen Sie mit einer morphologischen MR-Sequenz, um die knöcherne Metastase zu lokalisieren.

Als Nächstes eine Schnittfläche des Knochenmetastasens mit dem größten Durchmesser bestimmen und die Sequenz für D-C-E-M-R-I nach etwa 30 Sekunden starten. Den Kontrastmittel über einen Zeitraum von 10 Sekunden injizieren. Ein geeignetes CT-System auswählen, entweder einen menschlichen oder einen experimentellen Scanner.

Hier verwenden wir einen Prototypen eines flächenbasierten volumetrischen Computertomographen. Nachdem die Ratte mit Sauerstoff und Isofluran anästhesiert wurde, platzieren Sie einen Katheter in der Schwanzvene und befestigen Sie ihn mit Klebeband am Schwanz. Anschließend verbinden Sie eine Spritze, die Kontrastmittel enthält.

Platzieren Sie nun die Ratte unter Inhalationsnarkose auf dem Scanner. Legen Sie die Scan-Parameter für die VCT fest. Für diesen Zweck stehen mehrere experimentelle und klinische Ultraschallsysteme zur Verfügung.

Nach der Anästhesie der Ratte mit Sauerstoff und Isofluran legen Sie einen Katheter in die Schwanzvene ein und befestigen ihn mit einem Klebeband am Schwanz. Anschließend verbinden Sie eine Spritze, die ein Kontrastmittel auf Basis von Mikrobläschen enthält, mit dem Katheter. Befestigen Sie den Ultraschallwandler mit einem Stativ am entsprechenden Hinterbein und tragen Sie Ultraschallgel zwischen dem Wandler und dem Hinterbein auf.

Führen Sie als Nächstes die B-Modus-Bildgebungstransmission durch. Um den größten Durchmesser des Knochenmetastasen zu bestimmen und den Wandler in dieser Position zu fixieren, fügen Sie ein Doppler-Signal zu den B-Modus-Bildern hinzu, um Informationen zur Gewebedurchblutung zu erhalten. Beachten Sie dabei, dass nur Läsionen, die den kortikalen Knochen beeinträchtigen, für Ultraschallwellen zugänglich sind.

Bei der dynamischen kontrastverstärkten Ultraschalluntersuchung stellen Sie das Ultraschallgerät auf Cadence- und Kontrastimpuls-Sequenzierungsmodus ein, injizieren die Mikrobläschen und nehmen eine Aufnahme von 90 Sekunden Dauer auf. Verarbeiten Sie die morphologischen Informationen, die aus MRT, CT und Ultraschall gewonnen wurden, um den Weichteiltumor und die knöcherne Zerstörung der Knochenmetastasen zu charakterisieren. Anschließend bestimmen Sie mithilfe eines DICOM-Ansichtsprogramms für die Angiographie Lage und Volumen der Knochenmetastasen.

Unter Verwendung des eRx DICOM-Viewers die VCT-Daten analysieren, um das Verzweigungsmuster der Gefäße in Knochenmetastasen zu ermitteln. 2D- oder 3D-Bilder unter Nutzung der Informationen der arteriellen Phase mit oder ohne Subtraktionstechniken rekonstruieren. Zur Quantifizierung der funktionellen Parameter der Gefäßversorgung aus D-C-M-R-I-D-C-E-V-C-T und DCE-Ultraschall spezifische Software-Tools für jede Modalität verwenden.

Für die D-C-E-M-R verwende ich Dyna Lab, um die vaskulären Parameter in Verbindung mit dem Blutvolumen und der Austauschgeschwindigkeitskonstante, die mit der Perfusion und der Durchlässigkeit der Gefäße bei Knochenmetastasen assoziiert sind, zu bestimmen. Zur Quantifizierung der D-C-E-V-C-T-Daten führen Sie eine deskriptive Analyse der Daten durch, um Parameter wie die Fläche unter der Kurve oder die maximale Signalverstärkung zu berechnen. Quantifizieren Sie außerdem Informationen aus der Echtzeit-DCE-Ultraschalluntersuchung mithilfe einer Software zur quantitativen Analyse, indem Sie Cine-Loops analysieren. Gemäß dem implementierten Bolus-Injektionsmodell platzieren Sie die Region von Interesse über der Knochenmetastase und ermitteln entweder deskriptive Faktoren wie die Fläche unter der Kurve oder quantitative Parameter aus farbkodierten Karten.

Die intraarterielle Injektion von M-D-A-M-B 2 31-Zellen in die A. epigastrica superficialis (SEA) wurde verwendet, um ortsspezifische Knochenmetastasen im entsprechenden Hinterbein der Nude-Ratte zu erzeugen. Diese Abbildung zeigt das Verzweigungsmuster der A. femoralis, einschließlich der A. epigastrica superficialis, A. circumflexa femoris lateralis, A. poplitea und A. saphena. Die arteriellen Klammern werden an der A. saphena, A. poplitea und proximalen A. femoralis angebracht, zusätzlich erfolgt die Ligatur der A. epigastrica superficialis.

Die A. epigastrica superficialis (SEA) wurde dann proximal der Ligatur durchtrennt und nach Zugabe von Papin die Muskulatur der Gefäßwand mit einer Pinzette entspannt. Die SEA wird eingeschnitten und eine Nadel mithilfe einer externen Fixiervorrichtung für die Nadel in die SEA eingeführt. Menschliche Brustkrebs-Tumorzellen werden über die SEA injiziert und in die A. dorsalis genitalis (DGA) sowie die A. pudenda externa (pa) geleitet.

Aufgrund der clipse-osteolytischen Läsionen können, die auf den Femur, die Tibia und die Fibula beschränkt sind, mithilfe von MRT, CT und Ultraschall ab etwa 25 bis 30 Tagen nach der Injektion nichtinvasiv bildlich dargestellt und über mehrere Wochen verfolgt werden. Alle drei bildgebenden Verfahren können sequenziell am selben Ratzen verwendet werden. Die MRT zeigt die Morphologie des metastatischen Knochengewebes an, das anfangs auf die Knochenmarkhöhle beschränkt ist und im Verlauf der Entwicklung die kortikale Knochenstruktur überschreitet.

In diesen axialen Schnitten zeigt das T2-gewichtete MRT-Bild den Weichteilanteil der Knochenmetastase, und die DCE-MRT-Farb-Karten stellen die Werte für die Amplitude A und die Austauschgeschwindigkeitskonstante innerhalb der knöchernen Läsionsstruktur dar. Insbesondere werden osteolytische Veränderungen in den Metastasen mittels VCT in hoher Auflösung ergänzend zu den MRT-Befunden beurteilt. OSTEOLYTISCHE Läsionen liegen benachbart zum intramedullären Tumorwachstum. Die VCT-Angiographie zeigt die veränderte Architektur der Makrogefäße der Knochenmetastasen, und die DCE-VCT zeigt entsprechende Aspekte der Mikrozirkulation infolge lokaler Zerstörung des kortikalen Knochens in metastatischen Läsionen. Mithilfe von B-Bild- und Doppler-Techniken ist die Sonographie geeignet, morphologische und funktionelle Merkmale des Weichteiltumors zu beurteilen.

Bei Anwendung von Mikrobläschen ermöglicht die Kontrastmittelsonographie (DCE-Ultraschall) die Echtzeit-Bildgebung der Gefäßversorgung von Knochenmetastasen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Tumorzellen zur standortspezifischen Bildgebung von Brustkrebs und Knochenmetastasen inoculiert werden, um morphologische und funktionelle Aspekte der Angiogenese in diesen Läsionen nichtinvasiv abzubilden.