Name: LabVIEW-betriebenen Novel Nanoliter Osmometer für Ice Binding Protein Untersuchungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem nanoliter Osmometer die thermische Hysterese von Eisbindungsproteinen messen. Diese Methode ermöglicht präzise Temperaturkontrolle für Kryobiologie-Forschung und Kryokonservierungsanwendungen.

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Diese Arbeit wurde von der ISF, NSF und ERC unterstützt. Wir möchten technische Hilfe mit der Temperatur Etappe von Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer und Jeremy Dennison anzuerkennen. Unterstützung bei der Software-Entwicklung wurde von Oder Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy und Sumit Bhattachary vorgesehen. Wir möchten unsere Mitarbeiter Prof. Peter L. Davies und Dr. Laurie A. Graham für den Mp IBP Protein und hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch lab Mitglieder Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr. Yeliz Celik, Dr. Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy und Shlomit Guy für ihre Benutzer-Feedback.

0. Vorläufige Verfahren <ol><li> Glas zur Herstellung Injektionskapillare. Mit einer Kapillare Abzieher (Narishige, Tokyo, Japan), bereiten Sie einen scharfen Pipette mit einer feinen Öffnung von einer Glaskapillare Mikro-Schlauch (Brand GmbH, Wertheim, Deutschland). Die Größe der Öffnung sollte, indem Luft durch die Kapillare, um feine Blasen in sauberem Wasser zu erhalten verifiziert werden. Wenn die Kapillare geschlossen ist, dann kann es durch das Brechen der Kante zu öffnen. Dies kann durch Drücken oder Kratzen sie sanft gegen das Wasser mit Rohrwänden erreicht werden. Bereiten Sie die Kapillare, so dass die Öffnung blockiert ist, sondern annähernd ausreichend zu öffnen, um die Bildung von Blasen im Submillimeterbereich zu ermöglichen. </li><li> Copper Disc Reinigung. Beschallen die Kupfer-Discs für 10 min in 0,1% Micro-90 Seife (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), dann waschen mit doppelt destilliertem Wasser. Führen Sie die Discs in einem Isopropanol (technische) Lösung und beschallen erneut für 10 min. FlosseVerbündeter, trocknen die Scheiben mit gefilterter Luft. Diese Reinigungsstufe ist entscheidend für die IBP Kontamination zwischen den Experimenten zu vermeiden. </li><li> Double-Layer-Deckglas Montage. Ein Deckglas Versammlung war bereit, für Probenbeobachtung ohne Kondensation von Feuchtigkeit auf dem Deckglas Oberfläche zu ermöglichen. Dies wurde durch Platzieren eines Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) Teilchen (2 mm Durchmesser) zwischen zwei Deckgläsern, die dann mit einer Heißklebepistole klebten erreicht. Diese Konfiguration verhindert Kondensation, die die Sicht versperren könnte, wenn die Probe auf niedrige Temperaturen abgekühlt und entfernt die Notwendigkeit, trockene Luft auf die Beobachtungsfenster zu blasen. </li></ol> Ein. Cooling Stage Set-up <ol><li> Verbinden Sie den Wasserfluss Einlass und Auslass der Kühlstufe bis 4 mm Innendurchmesser Tygon Röhren (Saint-Gobain, Paris, Frankreich), und schließen Sie den Wasserfluss Einlassrohr mit einer Wasserpumpe. </li><li> Verbinden einer 4 mm Innendurchmesser Tygon Röhre zu dem Einlaß der Kühlstufe to liefern trockene Luft. Die Luft wurde getrocknet unter Verwendung einer in-line Drierite Spalte. </li><li> Betreiben Sie die Luft-und Wasserpumpen. Beachten Sie, dass die Kühlelemente nicht ohne einen Kühlkörper betrieben werden. </li><li> Schalten Sie den Temperaturregler, Kamera und LabVIEW-Routine. </li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Legen Sie eine 3-4 ul Tropfen Immersionsöl B (Cargille Labors, Cedar Grove, New Jersey, USA) auf der Rückseite eines 7 mm Durchmesser Kupfer Scheibe mit 500 um Löcher durch die Platte gebohrt. </li><li> Positionieren Sie den Kupfer-Disc auf der Kühlstufe mit dem Immersionsöl nach unten. </li><li> Verbinden des Kapillarrohrs (die stumpfe Kante) zu einer 0,7 mm Innendurchmesser Tygon Rohrs an dem anderen Ende mit einer 2-ml-Glas-Spritze (Poulten-Graf, Wertheim, Deutschland) verbunden ist. </li><li> Vor der Verwendung des Kapillarrohr, überprüfen Sie die kleine Öffnung der Kapillare, um sicherzustellen, dass die Öffnung eine geeignete Größe ist (siehe die vorläufigen Verfahren). </li><li> Langsam legen Sie die glass in die vorbereitete IBP Protein Probenröhrchen (2,4 uM Mp IBP-GFP in 20 mM CaCl 2 und 25 mM Tris-HCl bei pH 8, siehe Referenz 10 zur Herstellung Details) Kapillare und ziehen Sie das Glas Spritze, bis die Glaskapillare enthält 0,1 ul der Proteinlösung. </li><li> Beginnen Videoaufzeichnung über die LabVIEW-Software. </li><li> Das spitze Kante der Glaskapillare (das Protein enthaltenden Lösung) in einem der Löcher in der Scheibe auf dem Kupfer Kühlstufe. </li><li> Während der Beobachtung durch das Mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan, 10fach Objektiv), sorgfältig durchdringen die Immersionsöl Schicht mit der Glaskapillare Spitze, und drücken Sie die Glasspritze (sehr fein), um eine kleine Menge (ca. 10 nl) des Proteins liefern Lösung, um eine 200 um Tropfen zu erzeugen. </li><li> Verschließen Sie das Loch in der Kühlstufe mit dem Double-Layer-Deckglas-Baugruppe (siehe die vorläufigen Procedures). </li></ol> 3. TH Activity Measurement <ol><li> Press die Kühlung Taste und stellen Sie die Temperatur auf -40 ° C. </li><li> Zunächst wird die Lösung Tropfen klar sein. Bei niedrigen Temperaturen, typischerweise im Bereich von -30 ° C bis -35 ° C, das Tröpfchen die Farbe ändert, was anzeigt, dass die Lösung eingefroren wurde. Unmittelbar nachdem die Probe eingefroren, erhöhen Sie die Temperatur langsam bis die Masse Eis beginnt zu schmelzen. Eine schrittweise Erhöhung der Temperatur ist erforderlich, um ein Überschwingen der Temperatur, die in dem vollständigen Schmelzen der Probe führen könnten, zu vermeiden. </li><li> Wechseln Sie zu einem 50x Objektiv und beginnen, um das Eis durch Einstellen der Temperatur schmelzen. Diese Anpassung ist interaktiv und die letzten Schritte sind typischerweise unter Verwendung von kleinen Schritten Temperatur von 0.002 ° C. Weiter zu schmelzen, bis ein Einkristall bleibt. Die endgültige Größe des Kristalls sollte etwa 10 um betragen. Die höchste Temperatur, bei der Schmelztemperatur aufgehört hat festgestellt wird der Schmelzpunkt zu sein und ist genau in der späteren Videoanalyse Stufe bestimmt. </li> &lt;li&gt; Stellen Sie die Temperatur um ein paar Hundertstel Grad Celsius unter dem Schmelzpunkt des Kristalls und beginnen einen Temperaturanstieg mit einer 10 min Verspätung. Passen Sie die Anstiegsrate wie gewünscht. Während dieser Zeit wird der Kristall mit den IBPs ausgesetzt werden. </li><li> Nach Abschluss der 10 min Einwirkzeit wird die Temperatur automatisch zu verringern, unter der Kontrolle des LabVIEW Routine. </li><li> Beachten Sie die Kristallform, wenn die Temperatur sinkt. An einem gewissen Punkt kann die plötzlichen Platzen der Eiskristall beobachtet werden. Die Temperatur, bei der dies der Fall ist, wie der Kristall Bersttemperatur vermerkt. </li><li> Verwenden Videoanalyse um die genaue Schmelzpunkt und die Burst Temperatur zu bestimmen. Erstens, indem Videoanalyse, finden Sie die genaue Schmelzpunkt. Erinnern, dass die höchste Temperatur, bei der das Schmelzen aufgehört hat bestimmt wird, der Schmelzpunkt ist. Dokumentieren Sie dieses Schmelzpunkt in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Dann bestimmen die genaue crystal Bersttemperatur und dokumentieren diesen Wertsowie. Der Unterschied zwischen dem Schmelzpunkt und dem Gefrierpunkt oder Kristall Bersttemperatur ist die thermische Hysterese-Aktivität des IBP Lösung. </li></ol> 4. Die Messung der Zeit-abhängigen TH Activity <ol><li> Folgen dem Protokoll in Abschnitte von 3,1 bis 3,3 beschrieben, um einen Einkristall aus Eis herzustellen. </li><li> Nach der Bildung des Kristalls, die Verzögerungszeit der Rampe wie gewünscht, und schalten Sie auf die Rampe. </li><li> Die Temperatur wird mit einem festen Zinssatz zu verringern (nach der Betreiber-Anforderungen) automatisch, sobald die Rampe Verzögerungszeit abgelaufen ist. </li><li> Dokumentieren die Temperatur, bei der der Kristall-Burst auftritt. Berechnen der Belichtungszeit (die Zeit zwischen Kristallbildung und dem Kristall Burst). </li><li> Wiederholen des Versuchs für verschiedene Verzögerungszeiten und Plotten der TH-Aktivität in Abhängigkeit von der Belichtungszeit, um die Zeit-Abhängigkeit der TH-Aktivität zu bewerten. </li></ol>

<ol><li>DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+as+biological+antifreeze+agents+in+antarctic+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes.</a> Science. 172, 1152-1155 (1971).</li>
<li>Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrot+leucine-rich-repeat+protein+that+inhibits+ice+recrystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization.</a> Science. 282, 115-117 (1998).</li>
<li>Raymond, J. A., Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice+binding%2C+recrystallization+inhibition%2C+and+cryoprotective+properties+of+ice-active+substances+associated+with+Antarctic+sea+ice+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms.</a> Cryobiology. 46, 174-181 (2003).</li>
<li>Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+composition%2C+and+physical+properties+of+a+thermal+hysteresis+%22antifreeze%22+protein+from+larvae+of+the+beetle%2C+Tenebrio+molitor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor.</a> Biochemistry. 21, 716-721 (1982).</li>
<li>Kiko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+freeze+protection+in+a+sea-ice+crustacean+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Polar+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer.</a> Polar Biology. 33, 543-556 (2010).</li>
<li>Robinson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+adaptation+in+Arctic+and+Antarctic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi.</a> New Phytol. 151, 341-353 (2001).</li>
<li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150, 171-180 (2004).</li>
<li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).</li>
<li>Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).</li>
<li>Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superheating+of+ice+crystals+in+antifreeze+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).</li>
<li>Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolarity+of+tear+microvolumes+in+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca.</a> Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).</li>
<li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive%2C+Ca2%2B-dependent+antifreeze+protein+in+an+Antarctic+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).</li>
<li>Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+of+persistence+exponents+in+two-dimensional+ostwald+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening.</a> Phys. Rev. Lett. 103, (2009).</li>
<li>Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+determining+ice+recrystallization+inhibition+by+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Bioph.+Res.+Co%22%5BJournal%5D)">A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).</li>
<li>Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solute+Effects+on+Ice+Recrystallization+-+an+Assessment+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique.</a> Cryobiology. 25, 55-60 (1988).</li>
<li>Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).</li>
<li>Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Arbeit zeigt, das den Betrieb eines computergesteuerten Nanoliter Osmometer, die genaue Messungen der TH-Aktivität ermöglicht außerordentlich Temperaturregelung. In jeder Temperatur-sensiblen System müssen unerwünschte Temperaturgradienten vermieden werden. Um Temperaturgradienten in der hier dargestellten Vorrichtung zu vermeiden, muss die Testlösung Tröpfchens in der Mitte ein Loch in der Kupferscheibe Kühlstufe (Schritt 2,7) positioniert werden. Außerdem sollte der Einkristall in der Mitte des Tropfens statt der Nähe der Ränder sein (in den meisten Fällen ist diese spontan geschehen). Die Zeitabhängigkeit beschrieben anzeigt, dass die Abkühlrate kann die TH Messwerte beeinflussen. Somit schlagen wir mit einem Bericht mit der Zeit, während der der Kristall zu der Lösung wurde vor dem Abkühlen ausgesetzt sowie der Abkühlgeschwindigkeit. Wir in der Regel warteten 10 Minuten vor dem Herunterfahren der Temperatur, bei 0,01 ° C Schritten zu je 4 sec. Die LabVIEW-gesteuerte ZusammenarbeitOling Stufe wurde für die Verwendung mit einem inversen Mikroskop, auf der mikrofluidischen Vorrichtungen thermisch manipuliert werden könnten angepasst. Dieses System erleichtert die Durchführung der Lösung Austausch Experimente mit Eiskristallen und IBPs mit eGFP 9, 10, 16 markiert. Die LabVIEW-gesteuerte System kann zu einer Clifton Bühne, indem Sie das 3040 Temperaturregler über ein bestimmtes Anpassung Stromkreis angepasst werden. Ein solches System ist im Labor Davies 17 betrieben. Die Software NI LabVIEW und der designierte Anpassung Stromkreis Entwurf für das Clifton Bühne sind auf Anfrage erhältlich. Abschließend beschreiben wir eine Nanoliter Osmometer, die das empfindliche Kontrolle und Manipulation der Temperatur und die Geschwindigkeit des Temperaturanstiegs Zunahme und Abnahme (mit 0,002 ° C Empfindlichkeit), mit einem Video-Schnittstelle über eine LabVIEW-Routine für die Echtzeit-Analyse koordiniert erleichtert. Dieses System kann reproduzierbaren Rate-kontrollierte Experimente, die importan sindt zur Untersuchung der Kinetik der IBP Interaktionen mit Eis. Solche Experimente angehen können mehrere lange diskutierte Fragen rund um den Wirkmechanismus von IBPs.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Catalog Number / model </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Immersionsöl Typ B </td><td> Cargille Laboratories </td><td> 16484 </td><td></td></tr><tr><td> Drierite </td><td> WA Hammond Drierite </td><td> 043063 2270g </td><td></td></tr><tr><td> Micro 90 Reinigungslösung </td><td> Cole-Parmer </td><td> <a href="http://www.coleparmer.com/Product/Cole_Parmer_small_sup_reg_sup_small_Micro_90_small_sup_reg_sup_small_cleaning_solution_case_of_four_4_Liter_bottles/EW-18100-11" target="_blank">EW-18.100-11</a> </td><td></td></tr><tr><td> Kapillar-Abzieher </td><td> Narishige </td><td> PB-7 </td><td></td></tr><tr><td> Glaskapillarrohre </td><td> Marke GnbH </td><td> 7493 21 </td><td> 75 mm lang, 1,15 Durchmesser </td></tr><tr><td> TemperaturRegler </td><td> Newport, Irvine, Kalifornien, USA </td><td> Modell 3040 </td><td> Modell 3040 </td></tr><tr><td> Lichtmikroskop </td><td> Olymp </td><td> Modell BH2 </td><td></td></tr><tr><td> Objektiv 10x </td><td> Olymp </td><td></td><td> S Plan 10, 0,3, 160/0.17 </td></tr><tr><td> 50x Ziel </td><td> Nikon </td><td></td><td> CF Plan, 50X/0.55 EPI ELWD </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Provideo </td><td> CVC-140 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon Rohren </td><td> Saint-Gobain, Paris, Frankreich </td><td></td><td> Tygon Formulierung S-50-HL Tubing </td></tr><tr><td> Glasspritze (2 ml) </td><td> Poulten-Graf, Wertheim, Deutschland </td><td> 7 10227 </td><td></td></tr><tr><td> GPIB-PCI-Karte </td><td> National Instruments, Austin, Texas, USA </td><td> 778032-01 </td><td></td></tr><tr><td> Video Frame graBBER IMAQ-PCI-1407 </td><td> National Instruments, Austin, Texas, USA </td><td> 322156B-01 </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW System Design Software </td><td> National Instruments, Austin, Texas, USA </td><td> Version 8 </td><td></td></tr><tr><td> DivX Author Software </td><td> DiVx LLC, San Diego, CA, USA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

labview-betriebenen novel nanoliter osmometer für ice binding protein untersuchungen

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Eis-Bindungsproteine (EBPs), darunter Antifreeze-Proteine, Eisstrukturierungsproteine, thermische Hysterese-Proteine und Proteine, die die Eisrekristallisation hemmen, kommen in kälteangepassten Organismen vor und schützen diese vor Erfrierungsschäden, indem sie mit Eiskristallen interagieren. EBPs finden sich bei einer Vielzahl von Organismen, darunter Fische1, Pflanzen2, 3, Arthropoden4, 5, Pilze6 und Bakterien7. EBPs adsorbieren an den Oberflächen von Eiskristallen und verhindern, dass Wassermoleküle am Adsorptionsort des EBP in das Eislattice eingebaut werden. Das auf der Kristalloberfläche zwischen den adsorbierten EBPs wachsende Eis entwickelt eine starke Krümmung, wodurch die Temperatur, bei der die Eiskristalle weiterwachsen, abgesenkt wird – ein Phänomen, das als Gibbs-Thomson-Effekt bezeichnet wird. Diese Absenkung erzeugt eine Lücke (thermische Hysterese, TH) zwischen Schmelzpunkt und Nichtgleichgewichts-Frierpunkt, innerhalb derer das Eiswachstum gestoppt ist8–10, siehe Abbildung 1. Eines der wichtigsten Werkzeuge in der EBP-Forschung ist das Nanoliter-Osmometer, das die Messung der TH-Aktivität von EBP-Lösungen ermöglicht. Nanoliter-Osmometer, wie das Clifton-Gerät (Clifton Technical Physics, Hartford, NY) und das Otago-Gerät (Otago Osmometers, Dunedin, Neuseeland), wurden ursprünglich entwickelt, um die Osmolarität einer Lösung durch Bestimmung der Schmelzpunktserniedrigung von Tröpfchen im Nanoliter-Volumenbereich zu messen. Diese Geräte wurden zur Messung der Osmolarität biologischer Proben, wie beispielsweise Tränenflüssigkeit11, eingesetzt und erwiesen sich als nützlich für die EBP-Forschung. Die manuelle Steuerung dieser Nanoliter-Osmometer beschränkte jedoch die experimentellen Möglichkeiten. Temperaturänderungsraten konnten nicht zuverlässig geregelt werden, der Temperaturbereich des Clifton-Geräts war auf 4.000 mOsmol (etwa -7,5 °C) begrenzt, und die Aufzeichnung der Temperatur als Funktion der Zeit war bei diesen Geräten nicht verfügbar.
Wir haben ein maßgeschneidertes, computerkontrolliertes Nanoliter-Osmometersystem unter Verwendung einer LabVIEW-Plattform (National Instruments) entwickelt. Die zuvor beschriebene Kältestufe9, 10 enthält einen Metallblock, durch den Wasser zirkuliert und der somit als Wärmeableiter fungiert, siehe Abbildung 2. An diesem Block sind thermoelektrische Kühler angebracht, die mit einem handelsüblichen Temperaturregler angesteuert werden können, der über LabVIEW-Module gesteuert wird, siehe Abbildung 3. Weitere Einzelheiten werden weiter unten angegeben. Der wesentliche Vorteil dieses Systems liegt in der empfindlichen Temperaturregelung, siehe Abbildung 4. Eine automatisierte Temperaturregelung ermöglicht die Synchronisation eines konstanten Temperaturanstiegs mit einer videomikroskopischen Aufzeichnung, die zusätzliche experimentelle Details enthält.
Um die Zeitabhängigkeit der TH-Aktivität zu untersuchen, testeten wir ein 58 kDa großes hyperaktives IBP aus dem antarktischen Bakterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. Dieses Protein war in einem von der Gruppe von Peter Davies (Queens University) entwickelten Konstrukt mit verbesserten grün fluoreszierenden Proteinen (eGFP) markiert10. Wir zeigten, dass das Temperaturänderungsprofil die TH-Aktivität beeinflusste. Eine exzellente Kontrolle über das Temperaturprofil verbesserte in diesen Experimenten die TH-Messungen erheblich. Mit dem Nanoliter-Osmometer konnten wir zudem die Rekrystallisationshemmung von IBPs untersuchen5, 13. Im Allgemeinen ist Rekrystallisation ein Phänomen, bei dem große Kristalle auf Kosten kleinerer Kristalle weiterwachsen. IBPs hemmen die Rekrystallisation effizient, selbst bei niedrigen Konzentrationen14, 15. Mithilfe unseres mit LabVIEW gesteuerten Osmometers verfolgten wir die Rekrystallisation von Eis quantitativ und hielten mithilfe einer simultanen Echtzeit-Videobildanalyse sowie einer Temperatur-Rückkopplung aus der Probenkammer einen konstanten Eisanteil aufrecht13. Die Echtzeit-Berechnungen bieten zusätzliche Steuerungsmöglichkeiten während eines experimentellen Ablaufs. Eine Halterung für ein inverses Mikroskop wurde entwickelt, um temperaturgesteuerte mikrofluidische Vorrichtungen aufzunehmen, die an anderer Stelle beschrieben werden16.
Das Kältestufen-System
Die Kältestufenanordnung (Abbildung 2) besteht aus einer Reihe von thermoelektrischen Kühlelementen, die eine Kupferplatte kühlen. Die Wärme wird von der Stufe abgeführt, indem kaltes Wasser durch einen geschlossenen Hohlraum unterhalb der thermoelektrischen Kühler geleitet wird. Eine Bohrung mit 4 mm Durchmesser in der Mitte der Kupferplatte dient als Sichtfenster. Eine in der Ebene liegende Bohrung mit 1 mm Durchmesser wurde für den Thermistor angebracht. Eine speziell angefertigte Kupferscheibe (7 mm Durchmesser) mit mehreren Löchern (500 μm Durchmesser) wurde auf die Kupferplatte gesetzt und mit dem Sichtfenster ausgerichtet. Luft wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 35 ml/s eingeleitet und mittels Drierite (W.A. Hammond) getrocknet. Die trockene Luft diente dazu, eine trockene Umgebung an der Kühlstufe sicherzustellen. Die Stufe war über einen 9-poligen Anschluss an eine Temperaturregelung (Modell 3040 oder 3150, Newport Corporation, Irvine, Kalifornien, USA) angeschlossen. Die Temperaturregelung war über ein Kabel mit einer GPIB-PCI-Karte im Computer (National Instruments, Austin, Texas, USA) verbunden.

Messung der Zeitabhängigkeit TH Die LabVIEW-betriebenen Nanoliter Osmometer erleichtert die Durchführung von genauen TH-Aktivität Messungen. Die konstante Temperatur Reduktionsrate erlaubt die Messung der Zeitabhängigkeit TH. Die genaue Temperatursteuerung durch die Nanoliter Osmometer aktiviert war entscheidend für diese Experimente. Die Belichtungszeit von einem Eiskristall zu den IBPs in Lösung wird als die Zeitdauer von der Bildung des Kristalls (das Ende der Schmelzvorgang), bis der plötzliche Wachstum von Eis um den Kristall (Kristall Burst) definiert. Wir fanden, dass die Belichtungszeit der Eiskristalle zu den IBPs entscheidend die TH-Aktivität beeinflusst. Kurze Zeiträume IBP Exposition (ein paar Sekunden) produziert eine geringe TH-Aktivität in der Mp IBP-GFP-Lösung (2,4 uM) (Abbildung 5). Der TH-Aktivität mit IBP Belichtungszeit erhöht, bis sie ein Plateau bei 4 min IBP Exposition erreicht. Bei höheren IBP Konzentrationen, die Platteau wurde in kürzeren Zeiten erreicht. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung IBPs Eis adsorbiert. Angenommen mit Genehmigung vom 10. <img alt="Abbildung 2" fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Kühlstufe. A) zu Rohren auf dem Mikroskop verbunden. B) Ohne die obere Führung. C) Schematische Darstellung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig2large.jpg" target="_blank"> </a><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig3.jpg" /> Abbildung 3. Screenshot des LabVIEW-Schnittstelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig3large.jpg" target="_blank">Cl</a>ick hier, um größere Zahl anzuzeigen. <img alt="Abbildung 4" fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4.jpg" /> Abbildung 4. Temperaturstabilität graph. Der Temperaturregler wurde eingestellt, um die Temperatur 0,01 ° C alle 15 Sekunden zu senken. <img alt="Abbildung 5" fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5.jpg" /> Abbildung 5. Mp IBP TH-Aktivität als Funktion der Eiskristall Belichtungszeit auf den IBPs. Jeder Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 3-6 Experimenten.

Eis Bindungsproteine ​​(IBPs), auch als Frostschutzmittel Proteine ​​bekannt, hemmen Eiswachstum und sind eine vielversprechende Additiv zur Verwendung bei der Kryokonservierung von Gewebe. Das wichtigste Instrument zur IBPs zu untersuchen ist die Nanoliter Osmometer. Wir haben ein Haus entworfen Kühlstufe auf einem optischen Mikroskop montiert und kontrolliert über eine custom-built LabVIEW Routine. Die Nanoliter Osmometer hier beschriebenen manipulierten die Temperatur der Probe in einem ultra-sensitive Art und Weise.

LabVIEW-betriebenen Novel Nanoliter Osmometer für Ice Binding Protein Untersuchungen

Eisbindende Proteine (IBPs), einschließlich Antifreeze-Proteine, Eisstrukturierungsproteine, thermische Hystereseproteine und Proteine zur Hemmung der Eisrekristallisation ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die thermische Hysterese von Eiskristall-bindenden Proteinen und anderen Materialien, die das Eiswachstum beeinflussen, zu messen. Dazu wird zunächst ein Kapillarrohr mit einer engen Öffnung hergestellt und ein Tropfen der Proteinlösung aufgesaugt. Das Kapillarrohr mit der Probe wird anschließend auf eine temperaturgesteuerte Probehalterung platziert.Der zweite Schritt besteht darin, die Lösung durch Abkühlen auf niedrige Temperaturen einzufrieren, um Eis in den Tropfen einzubringen. Anschließend wird der Tropfen erwärmt, um das meiste Eis zu schmelzen. Um einen einzelnen Kristall im Tropfen aufrechtzuerhalten.Der letzte Schritt besteht darin, das Eis erneut abzukühlen, bis es sich schnell zu vergrößern beginnt. Abschließend wird eine Video-Mikroskopie-Analyse verwendet, um die Differenz zwischen Schmelztemperatur und Gefriertemperatur zur Bestimmung der thermischen Hysterese zu berechnen sowie zur Ermittlung der Eiskristallform und zur Messung der Eiswachstumsgeschwindigkeit. Der Hauptvorteil des von uns entwickelten Laborkontrollsystems Nanoliter SM gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sehr lange oder sehr schnelle Messungen genau und wiederholt durchgeführt werden können.Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der Eiskristall-bindenden Proteine beantwortet werden, beispielsweise die zeitliche Abhängigkeit der ther. Beginnen Sie damit, eine Glas-Kapillare für die Lösungsinjektion vorzubereiten. Verwenden Sie einen Kapillarzieher, um aus einer Glas-Kapillar-Mikroröhre eine scharfe Pipette mit feiner Öffnung herzustellen.Die Größe der Öffnung sollte überprüft werden, indem Luft durch die Kapillare geleitet wird, um feine Bläschen in leicht blubberndem Wasser zu erzeugen. Bereiten Sie die Kapillare so vor, dass die Öffnung nahezu blockiert ist, aber ausreichend geöffnet bleibt, um die Bildung von Submillimeter-Bläschen zu ermöglichen. Falls die Kapillare geschlossen ist, öffnen Sie sie, indem Sie ihre Kante vorsichtig gegen die Wände des wasserhaltigen Rohrs drücken oder kratzen.Stellen Sie eine doppelte Abdeckung aus Deckgläsern her, indem Sie ein trockenes Trockenmittel zwischen zwei Deckgläser legen. Kleben Sie die Deckgläser mit einer Heißklebepistole zusammen. Die doppelte Deckglasanordnung ermöglicht die Probeneinsicht, ohne dass Feuchtigkeit auf der Oberfläche des Deckglases kondensiert.Um die Kühlstufe vorzubereiten, verbinden Sie den Wasserzulauf und -ablauf der Kühlstufe mit vier Millimeter im Durchmesser liegenden Schläuchen. Verbinden Sie den Wassereinlassschlauch mit einer Wasserpumpe. Schließen Sie einen vier Millimeter im Durchmesser liegenden Teflon-Schlauch an den Einlass der Kühlstufe an, um getrocknete Luft zuzuführen, die zuvor getrocknet wurde.Unter Verwendung einer Inline-Trockeneis-Säule die Luft- und Wasserpumpen betreiben. Beachten Sie, dass die Kühlelemente nicht ohne Wärmesenke betrieben werden dürfen. Schalten Sie die Temperaturregelung, die Kamera und die LabVIEW-Routine ein.Um die Probenpräparation zu beginnen, geben Sie einen Tropfen von drei bis vier Mikrolitern Immersionsöl B auf die Rückseite einer sieben Millimeter durchmessenden Kupferscheibe, die 500 Mikrometer große Löcher enthält. Platzieren Sie die Kupferscheibe mit der Seite des Immersionsöls nach unten auf der Kühlstufe. Verbinden Sie das stumpfe Ende des Kapillarrohrs mit einem 0,7 Millimeter durchmessenden Tigonrohr.Am anderen Ende an eine zwei Milliliter fassende Glas-Spritze angeschlossen. Führen Sie die Glas-Kapillare langsam in das vorbereitete Röhrchen mit eisbindendem Protein oder IBP-Probe ein und ziehen Sie die Glas-Spritze so lange, bis die Glas-Kapillare 0,1 Mikroliter der Proteinlösung enthält. Starten Sie die Videoaufnahme über die Lab-View-Software.Stechen Sie die scharfe Kante der gefüllten Glaskapillare in eine der Öffnungen der Kupferscheibe auf der Kühlstufe. Beobachten Sie dabei durch das Mikroskop und dringen Sie mit der Kapillarspitze äußerst vorsichtig durch die Immersionsölschicht. Drücken Sie die Glas-spritze, um eine kleine Menge der Proteinlösung abzugeben und einen 200 µm-Tropfen zu erzeugen.Decken Sie das Loch in der Kühlstufe mit der Doppelschicht-Abdeckung aus Deckgläsern ab. Drücken Sie die Kühl-Taste und stellen Sie die Temperatur auf minus 40 Grad Celsius ein. Anfangs ist der Lösungstropfen bei niedrigen Temperaturen klar, typischerweise im Temperaturbereich von minus 30 Grad Celsius bis minus 35 Grad Celsius.Die Tröpfchen verfärben sich, was anzeigt, dass die Lösung unmittelbar nach dem Gefrieren der Probe eingefroren wurde. Erhöhen Sie die Temperatur langsam, bis das makroskopische Eis zu schmelzen beginnt. Eine schrittweise Erhöhung der Temperatur ist erforderlich, um eine Überschreitung der Temperatur zu vermeiden, die zum vollständigen Schmelzen der Probe führen könnte. Wechseln Sie zu einem 50-fach-Objektiv und beginnen Sie, das Eis durch Anpassen der Temperatur zum Schmelzen zu bringen.Diese Einstellung erfolgt interaktiv, und die letzten Schritte werden typischerweise mit kleinen Temperaturschritten von 0,002 Grad Celsius durchgeführt, bis nur noch ein einzelner Kristall übrig bleibt. Die endgültige Größe des Kristalls sollte etwa 10 Mikrometer betragen. Die höchste Temperatur, bei der das Schmelzen eingestellt hat, wird als Schmelzpunkt bestimmt und später in der Videoanalysephase genau ermittelt.Als Nächstes stellen Sie die Temperatur auf einige Hundertstel Grad Celsius unterhalb des Schmelzpunkts des Kristalls ein und beginnen eine Temperaturrampe mit einer Verzögerung von 10 Minuten; stellen Sie die Aufheizgeschwindigkeit nach Wunsch ein. Während dieser Zeit wird der Kristall den ips ausgesetzt. Nach Ablauf der 10-minütigen Belichtungszeit wird die Temperatur automatisch unter Kontrolle der LabView-Routine gesenkt. Beobachten Sie die Kristallform, während die Temperatur abnimmt.An einem bestimmten Punkt kann das plötzliche Aufblühen von Eiskristallen beobachtet werden. Die Temperatur, bei der dies auftritt, wird als Kristallisationsstoßtemperatur notiert. Verwenden Sie eine Videoanalyse, um den genauen Schmelzpunkt und die Stoßtemperatur zu bestimmen.Zunächst mithilfe einer Videoanalyse den genauen Schmelzpunkt ermitteln. Beachten Sie, dass die höchste Temperatur, bei der das Schmelzen abgeschlossen ist, als Schmelzpunkt bestimmt wird. Dokumentieren Sie diesen Schmelzpunkt in einem Tabellenkalkulationsprogramm.Bestimmen Sie anschließend die genaue Kristallbruchtemperatur und dokumentieren Sie diese ebenfalls. Die Differenz zwischen Schmelzpunkt und Erstarrungspunkt bzw. Kristallbruchtemperatur entspricht der thermischen Hystereseaktivität der IBP-Lösung. Um die zeitabhängige TH-Aktivität zu messen, schmelzen Sie das Eis so lange, bis nach der Kristallbildung, wie zuvor, nur noch ein einzelner Kristall verbleibt.Stellen Sie die Verzögerungszeit der Rampe nach Wunsch ein und schalten Sie die Rampe ein. Hier wurde beispielsweise die Verzögerungszeit auf eine Minute festgelegt. Die Temperatur sinkt automatisch mit einer konstanten Rate. Sobald die Verzögerungszeit der Rampe abgelaufen ist, notieren Sie die Temperatur, bei der das Kristallzerplatzen auftritt.Berechnen Sie die Belichtungszeit, also die Zeit zwischen Kristallbildung und Kristallausbruch. Wiederholen Sie das Experiment für verschiedene Verzögerungszeiten und tragen Sie die TH-Aktivität in Abhängigkeit von der Belichtung auf. Zeit, um die Zeitabhängigkeit der TH-Aktivität zu bewerten.Die präzise Temperaturkontrolle, die durch den Nanoliter-OSM-Monitor ermöglicht wurde, war entscheidend für die genaue Messung der TH-Aktivität und deren zeitlicher Abhängigkeit. Die Expositionszeit eines Eiskristalls gegenüber dem IPS in Lösung ist definiert als der Zeitraum von der Bildung des Kristalls bis zum plötzlichen Wachstum des Eises um den Kristall herum. Die Expositionszeit der ICE-Kristalle gegenüber dem IPS beeinflusste die TH-Aktivität entscheidend.Kurze Zeiträume der IBP-Exposition führten zu einer geringen TH-Aktivität in der MP I-B-P-G-F-P-Lösung. Die TH-Aktivität stieg mit der Dauer der IBP-Exposition an, bis nach vier Minuten bei höheren IBP-Konzentrationen ein Plateau erreicht wurde. Bei kürzeren Zeiträumen wurde das Plateau früher erreicht. Die Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit Mikrofluidikgeräten, die eine ähnliche Love-View-Regelungsstufe nutzen, kann verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Anreicherung von Eiskristall-bindenden Proteinen auf der Oberfläche von Eiskristallen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine thermische STERIS-Messung durchgeführt wird, mit der die Aktivität von Eisanspruchproteinen bewertet wird.

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Forschung

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Chemie

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