Name: Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von S. cerevisiae Zygotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: Lernen Sie eine durchflusszytometriebasierte Methode zur Reinigung von S. cerevisiae-Zygoten mit etwa 90%iger Reinheit. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Zygotenbiologie und dem haploiden zu diploiden Übergang.

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Wir danken Dr. R. Michael Sramkoski für die Hilfe bei der Durchflusszytometrie, Dr. Purnima Jaiswal und Dr. Di Wu für frühere Eingang und Ilya Aylyarov Hilfe zu den Illustrationen. Unterstützt durch NIH Grant R01GM089872 und Cytometry &amp; Imaging Microscopy Core Facility des Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

Ein. Haploid Cell Growth <ol><li> Wachsen S. cerevisiae-Zellen aus dem S288C Hintergrund (BY4741) unter Standardbedingungen 10. </li><li> Transform Haploiden entweder Ausdruck von zwei auffälligen Fluoreszenzmarker 10. Die Markierungen der Wahl sind lösliche GFP im Zytoplasma exprimiert (pEG220, URA3/YIp, linearisiert mit BglII 11) und eine einzige ribosomalen Protein, RPL25 mit mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, aus A. Johnston) fusioniert. Wir erwarten, dass gleich zwei-color Aufreinigungsprotokolle konnte Verwendung anderer hell fluoreszierende Proteine, die von den haploiden parentalen Zellen synthetisiert werden können. Alternativ könnte die Zellwand mit fluoreszierenden Lektine kennzeichnen. </li><li> Am Tag vor Zygote Aufreinigung inokulieren 5 ml Kulturen von jedem Zelltyp und wachsen sie unter Schütteln über Nacht bei 23 ° C bis A600 erreichen höchstens 1,0. Wachsen GFP Transformanten (ATY4442) in kompletten synthetischen Medium mit 2% Glucose (CSM-Glucose) einernd RPL25-mCherry Transformanten (ATY4552) in synthetischer selektiver Medium ohne Uracil 10. Pflegen parallelen Kulturen jedes Zelltyps unter Schütteln bei Raumtemperatur. </li></ol> 2. Die Durchführung einer Kreuz <ol><li> Einstellen der optischen Dichte (A600) jeder Probe auf 1,0 in frischem Medium. [1 Optische Dichte Einheit ~ 3 x 10 7 Zellen / ml] </li><li> Mischen gleicher Volumina der beiden Kulturen Wirbel kurzzeitig 3 mal, um eine längere Vortex für 10 sec, gefolgt. </li><li> Bereiten CSM-Glucose-Platten. Die Platten sind identisch mit denen für die routinemäßige Wachstum verwendet und wurden 45 Minuten nach dem Gießen und Erstarren des Agars 10 getrocknet. </li><li> Verteilen so viele wie 20 ml 40-Tröpfchen des Gemisches 1 cm von der Kante der Oberfläche der CSM-Glucose-Platten. Wenn die Tröpfchen werden zunächst auf die Oberfläche aufgetragen startet den Timer zur Messung verstrichenen Zeit. Sobald die Flüssigkeit aufgesogen ist (ca. 30 min), die Platten abdecken und lassen sie ungestört bei room Temperatur. </li></ol> 3. Harvesting Vorbereitungen <ol><li> Ernteproben nach 1,75-2,5 h bei 23 ° C durch mehrmaliges Waschen einzelnen getrockneten Tröpfchen von der Platte unter Verwendung von 150 ml kaltem CSM-Glucose, halten die Platten auf Eis. Wiederholt waschen das Tröpfchen Bereich 10-20 mal mit dem gleichen Medium zur Erholung zu maximieren. Sammle in 15 ml Falcon-Röhrchen auf Eis. </li><li> Sonde beschallen die Proben 10x bei 60% Amplitude mit einer Fisher FB120 Ultraschallgerät (120Watt, 120Volt, Freq 20kHz) auf Eis. </li><li> Überprüfen Sie in einem Phasenkontrastmikroskop, dass nur wenige oder gar keine Aggregate bleiben. 15-50% der Zellen erwartet gebildet Zygoten an dieser Stelle haben. </li><li> Verlassen das Rohr von Zellen in einer vertikalen Position ungestört auf Eis für 10 min als weitere Sicherungsmaßnahme (damit Aggregate absetzen). </li><li> Recover den obersten 90% des Volumens und filtern sie durch ein Nylonnetz (BD Falcon Polypropylen Rohr mit Sieb Kappe (Ref 352235)). In einem typischen Experiment, 10 7 Zellenerholte sich von einer Platte waren zu diesem Zeitpunkt in 4 ml CSM-Glucose verdünnt. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie <ol><li> Sortieren Zellen unter Verwendung des Sony ICYT Reflection Modell Durchflusszytometer, (Highly Automated Parallel Sort) HAPS1 mit einer 100 Mikrometer Spitze. Für GFP Anregung, den blauen Argon-Ionen, 250 Milliwatt-Laser bei 488 nm. Für mCherry Erregung, mit der 100 Milliwatt-Laser bei 561 nm. Obwohl wir noch keine Erfahrung mit anderen Maschinen, erwarten wir, dass Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx oder Beckman Coulter MoFlo XDP wäre schön, wenn sie mit den richtigen Laser ausgestattet. </li><li> Basis Sortierparameter an einem vorderen vs zurück Streudiagramm um Tor auf lebensfähigen Zellen. Stellen Sie eine Emission Grundstück von 615 + / - 30 nm Bandpassfilter (mCherry) versus 525 + / - 25 nm Bandpassfilter (GFP), um die Ereignisse in vier Quadranten unterteilt, &quot;Rot + Grün-&quot;, &quot;Rot + Grün +&quot;, &quot;Red- Green-&quot;und&quot; Rot-Grün + &quot;(Abbildung S2). Verwenden nichtfluoreszierenden Zellen als Standard foder Bestimmung der &quot;Red-Green-Quadranten&quot;. </li><li> Sortieren von Zellen mit einer Hülle Druck von 21,5 psi, ein Tröpfchen Frequenz von 43.400 Tropfen / sec und einer Probe Druck von 20,5 psi. </li><li> Initial Sort (&quot;Recovery Mode&quot;): Die Proben in ein gekühltes Eppendorf-Röhrchen mit 250 ml kaltem CSM-Glucose. Sediment 10 sec bei Höchstgeschwindigkeit in einem gekühlten Mikrofuge (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) und saugen Sie den Flow-Lösung (Durchflusszytometrie Mantel-Lösung (PBS mit 1 mM EDTA) BioSure Katalog Nr. 1027). Resuspendieren in 500 ml kaltem CSM-Glucose. </li><li> Zweitens Sort (&quot;Purity Mode&quot;): Führen Sie die Art wie für die ursprüngliche Art, mit der &quot;Reinheit Modus&quot;. Sediment das gereinigte Zellen und Resuspendieren der Pellets in 500 ml 1,0 ml-CSM-Glucose. Schütteln für 15 min in 24-Well-Platten bei 23 ° C, um metabolische Erholung zu ermöglichen. </li></ol> 5. DeltaVision Microscopy <ol><li> Bereiten Agarose Pads wie folgt: Bringen Sie eine Suspension von 1,5% Agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) in CSM-Glukose aufkochen, kurz vortexen und wenden dann 0,3 ml Proben des Agarose-Lösung auf die Oberfläche des horizontalen Standard-Glas-Dias und decken Sie sie auf einmal mit einem zweiten Schlitten (ohne Ausüben von Druck). </li><li> Nach dem Abkühlen für 10 min, entfernen Sie vorsichtig die obere Schieber, indem es horizontal, kümmert um eine glatte Oberfläche zu verlassen und nicht auf die Agarose-Schicht zu stören. (Wenn die obere Folie entfernt worden ist, so sollte die Probe von Zellen innerhalb von 1-2 min angewendet werden. Wenn in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur ohne Entfernen der oberen Folie gehalten, Pads für gespeichert werden bis zu einem Tag vor der Verwendung.) </li><li> Sedimentproben und Kaution 1 ml Aliquots des Pellets auf Agarose-Pads (ohne Berührung der Oberfläche). Sofort die Probe mit einem quadratischen Nr. 1 Deckglas. Schneiden Sie überschüssige Agarose mit einer einseitig geschliffenen Rasierklinge. Verschließen Sie die Präparate mit Vaseline aus einer Spritze verzichtet. </li><li> Bild mit Deltavision (Applied Precision) mit einem 100x Ölimmersionsobjektiv ohne Binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolve z-Stacks mit dem Softworx 5.0.0 Programm ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) und verarbeiten minimal. Sukzessive z-Ebenen wurden im Allgemeinen bei 0,2-0,4 Mikron Abständen entnommen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Fluoreszenzintensität Ebenen in transformierten haploiden Zellen: Die Höhe der Fluoreszenz in den Haploiden ist in Abbildung S1 dargestellt. Bevor das Kreuz, Epifluoreszenz Untersuchung zeigte, dass im Wesentlichen alle GFP Transformanten grün waren und dass alle mCherry Transformanten, obwohl oft schwächer, waren rot. Um sicherzustellen, dass alle Zellen für das Kreuz verwendet tatsächlich um fluoreszierende, nutzten wir die Subpopulation mit dem hellsten Fluoreszenzsignal. Rendite: Aach der ersten Art, die Rot + Grün + Probe (Abbildung S2) umfasst in der Regel 8-20% des Eingangs Anzahl der Zellen und eine übermäßige Anzahl von haploiden Zellen, vielleicht wegen der anhaltenden Zell-Zell-Adhäsion. Da hohe Anreicherung nicht mit einer einzigen Art erreicht, sollte die teilweise gereinigte Probe sein Sonde resuspendiert und zweimal mit 60% Amplitude durch Umsortieren gefolgt. (Recovery Arten dauern in der Regel zwischen 1-2 Stunden, während die zweite Art benötigt nur 15 min.) Von den Zellen der zweiten Art ausgesetzt, enthalten die Rot + Grün + Proben 23-52% der eingesetzten Zellen. Phase mikroskopische Untersuchung: Prüfung durch Phasenkontrast-Mikroskopie zeigte, dass die Reinheit des Endproduktes Zygote Vorbereitung ca. 90%, gemittelt über 21 Präparate (von 86% auf 91%). Die Verunreinigungen waren entweder grün oder rot Haploiden, oder Paare von Haploiden, die in Kontakt miteinander sind. Abbildung 3 tabellarisch den Prozentsatz von Zygoten, die habenkeine Knospe, medialen Knospen (Med), seitlichen Knospen (Lat) oder Endknospen (Term), die Anzahl von gepaarten Haploiden der gleichen Farbe (&quot;2Same&quot;) oder andere Farbe (&quot;2Hap&quot;), sowie einzelnen Haploiden ( Hap). Wenn die Zellen nach 1,75 h geerntet wurden, wurden mehr als 50% unbudded und die weitere Unterkategorien (mit medialen, lateralen oder Endknospen) waren gleichermaßen vertreten. Nach 2,5 Stunden waren ca. gleiche Anzahlen von Zygoten in jeder der vier Kategorien (unbudded mit medialen, lateralen oder terminalen Knospen). Mikroskopische Beobachtungen (Abbildung 4): Die Struktur der Zygoten scheint zu bleiben während der Reinigung unverändert. Nach der Dauer des Kreuzes hatte der Population unterschiedliche Anteile unbudded und geknospten Zygoten, wie oben erläutert. Da sowohl die grünen und roten Haploiden zeigten erhebliche Unterschiede im Fluoreszenzsignal Intensität, waren einige Zygoten überwiegend rot während andere überwiegend grün, wie Comparin beobachtet wirdg die einfarbigen Bilder auf die kombinierten Bilder in 4. Man beachte auch, dass der GFP (MW 26kDa) den Kern eintritt und kann im Kern selbst wenn die Kerne haben nicht fusioniert gefunden werden. Vakuolen stehen als schwarze nicht-fluoreszierenden Kugeln. Das Endprodukt der Reinigung ergibt eine diverse Population in verschiedenen Stadien der Entwicklung. Zygoten mit A nicht durchlaufen Fusion. Typ B Zygoten werden unbudded. Typ C haben eine kleine Knospe. Typ D haben eine größere Knospe, und Typ E Zygoten sind dabei Zytokinese unterziehen. Man beachte auch, dass viele der zuvor Zygoten immer noch eine nicht fluoreszierende medialen Teilungslinie (*), und dass die vakuoläre &quot;Vererbung Struktur&quot; (I) 12 kann oft gesehen aus der Zygote in der Knospe zu verlängern. In manchen Fällen hat der grüne Signal in den Partner zu einem viel größeren Ausmaß, dass das Rotsignal umverteilt. Dies spiegelt die Verzögerung der Übertragung charakteristischen Polysomen (Tartakoff, in Vorbereitung) ist. 6 Zygoten, was ausreichend ist für viele Immunoblots unter Verwendung Chemilumineszenznachweis Verfahren. Verwendung von Phenol-Chloroform isoliert Protokollen wir extrahieren etwa 1,5 mg RNA aus dieser Anzahl von Zellen. Da die gereinigten Zygoten haben gekühlt worden, vor der weiteren Analyse empfiehlt Inkubation bei 23 ° C in Wachstumsmedium. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Abbildung 1. Chronologie der Zygote Bildung. Zygotes als Vermittler zwischen Haploiden und Diploiden. Dieses Diagramm zeigt die klassische Aktivierung (shmooing) der Haploiden, ihre Fusion und die Bildung der ersten Knospe. Knospen kann entweder mediale (M), laterale (L) oder Terminal (T). <imgalt = &quot;Abbildung 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. Schematischen der Zygote Aufreinigungsprotokolls. Nach Inkubation auf die Oberfläche von Agarplatten in Vollmedium mit Glucose, das Zellgemisch wurde durch Waschen gewonnen und dann auf einen Anfangswert Sortierung in &quot;Wiederherstellungsmodus&quot; durch eine zweite Art in &quot;Reinheit Modus unterzogen. &quot; Die gelbe Farbe bedeutet, dass sowohl mCherry und GFP-Signale sichtbar in den Zygoten waren. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Abbildung 3. Sorten von Zygoten in den gereinigten Fraktionen. Mating Mischungen wurden nach 1,75 oder 2,5 h bis Fraktionen in einem relativ frühen vs relativ reifer Zygoten angereichert erholen geerntet. Acht unabhängigen Experimenten, die von den unterschiedlichen Farben bezeichnet, wurden für jeden Zeitpunkt ausgeführt. Die Diagramme zeigen die relative Anzahl von Zygoten, dass have räumlich unterschiedlichen Mustern der Knospenbildung. Angesichts der kurzen Dauer der Inkubationszeit (weniger als 2,5 Stunden bei Raumtemperatur) alle Knospen beobachtet wurden, sind erste zygotischen angehenden Ereignisse. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Abbildung 4. DeltaVision Prüfung angereicherten Fraktionen. Ein typisches wurde von Deltavision Mikroskopie untersucht. Die Abbildungen zeigen entweder beide rot und grün oder einzelne Farben. Die rote entspricht der Polysomen Etikett (Rpl25p-mCherry) und der grün cytosolische GFP. Beachten Sie die hohe Anreicherung von Zygoten, und die benannten subzelluläre Merkmale: die Vakuolen (v), Knospen (b), Kern (n), Vakuole &quot;Vererbung Struktur&quot; (i), und die Partition (*), die die elterliche Trennung scheint Domänen in relativ frühen Zygoten. Ihre variablen Gesamtfarbe spiegelt die relative Intensität der Haploiden, die fusioniert. In Fällen, in denen die beiden elterlichen Domains behalteneine deutliche Farbe war Äquilibrierung der Marker (cytoplasmatische GFP-markierten Polysomen mCherry) unvollständig. Zeitraffer-Studien im Gange zeigen, dass lösliche GFP verteilt vor Polysomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . Ergänzende Legends <img alt="Abbildung S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Abbildung S1. Fluoreszenz von haploiden Zellen Ganz links:. Zellen, mCherry-markierten Polysomen wurden untersucht, um ein grünes Signal zu erkennen. Das rechteckige Fenster wurde eingestellt, um die negativen Zellen zu vermeiden. Mittlere Kurve: Zellen, die cytosolische GFP analysiert wurden, zeigt die deutlich heller Ballungszentren Positives. Ganz rechts: Zellen, die mCherry-markierten Polysomen wurden analysiert. Das Rechteck (identisch mit der auf dem ganz links) enthält die hellsten Zellen und ermöglicht allenNegative zu vermeiden. Die Bezeichnung &quot;R2&quot; bedeutet den Prozentsatz an Zellen innerhalb des vorgegebenen Rechtecks ​​zurückgewonnen. <img alt="Abbildung S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Abbildung S2. Zellverteilung in ersten und zweiten Sortierung. Diese zweifarbigen Flächen geben den Anteil der Grün + rot + Zellen in dem oberen rechten Quadranten (R5). Dieser Anteil erhöht sich auf 52% in der zweiten Sorte. Horizontale Achse: grünes Signal. Vertikale Achse: rotes Signal.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Verfügbarkeit von gereinigtem Zygoten sollten biochemische Untersuchungen einschließlich Transkriptom, Proteom und Lipidomics sowie Untersuchung der Mechanismen, durch die Zygoten unterziehen Zellzyklus re-entry, Zellwand Umbau, angehende und Vererbung Eigenschaften, etc. Alternativ zu erleichtern, könnte Zygoten die ausgehend werden mit Stämmen, die charakteristische Mutationen in einem oder beiden Elternteilen. Darüber hinaus können die gereinigten Zygoten, wie für haploide oder diploide Zellen, können in Medium, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz / Equipment </td><td> Quelle </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, kodierend cytoplasmatischen GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, Kodierung RPL25 fusioniert mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 Sonicator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polypropylenröhrchen mit Sieb cap </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Gekühlte Mikrozentrifuge </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Durchflusszytometrie Abtrennlösung </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> ICYT Reflection Modell Durchflusszytometer </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Dekonvolution Mikroskop </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Upright Epifluoreszenzmikroskop </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM Glukose Formulierung Hinweise: Für Agarplatten, einfach zählen 2% Agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

durchflusszytometrie-basierte reinigung von<em&gt; s. cerevisiae</em&gt; zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygoten sind wesentliche Zwischenprodukte zwischen haploiden und diploiden Zustände im Lebenszyklus vieler Organismen, einschließlich Hefe (Abbildung 1) 1. S. cerevisiae Zygoten resultieren aus der Fusion von haploiden Zellen unterschiedlicher Paarungstyp (MATa, MATalpha) und führen zu entsprechenden stabilen Diploide erzeugen, die nacheinander so viele wie 20 diploiden Nachkommen als ein Ergebnis ihrer asymmetrischen auffallend mitotische Teilungen 2. Zygote Bildung wird durch eine komplexe Abfolge von Ereignissen orchestriert: In diesem Prozess binden lösliche Paarungsfaktoren an Rezeptoren verwandt, Auslösung Rezeptor-vermittelten Signalkaskaden, die Unterbrechung des Zellzyklus und gipfeln erleichtern Zell-Zell-Fusion. Zygoten kann als ein Modell für die Vorläufer-oder Stammzellen-Funktion sein. Obwohl viel über die Bildung von Zygoten gelernt und obwohl Zygoten wurden verwendet, um Zellen molekulare Fragen von allgemeinem signif untersuchenicance fast alle Studien haben den Einsatz der Paarung Mischungen, in denen Zygoten mit einer Mehrheit der Bevölkerung von haploiden Zellen 3-8 vermischt sind. Viele Aspekte der Biochemie der Zygote Bildung und der anhaltenden Lebens der Zygote bleiben daher unerforscht. Berichte der Reinigung von Hefe Zygoten beschreiben Protokolle auf ihren Sedimentationseigenschaften 9 basiert, aber diese Sedimentation-basierten Verfahren nicht erzielen fast 90% Reinheit in unseren Händen. Darüber hinaus hat es den Nachteil, dass Zellen auf Sorbit hypertonischen freiliegen. Wir haben daher eine vielseitige Reinigungsverfahren entwickelt. Zu diesem Zweck waren Paare von haploiden Zellen, rot oder grün fluoreszierende Proteine ​​coinkubiert um Zygote Formation, zu verschiedenen Zeiten geerntet und die resultierenden Zygoten wurden unter Verwendung eines auf Basis der Durchflusszytometrie Sortier-Protokoll zu ermöglichen. Diese Technik bietet eine bequeme visuelle Beurteilung der Reinheit und Reifung. Die durchschnittliche Reinheitder Fraktion beträgt ca. 90%. Gemäß der Zeitsteuerung der Ernte können Zygoten unterschiedlicher Reifegrade rückgewonnen werden. Die gereinigten Proben bieten eine bequeme Ausgangspunkt für &quot;-schaftlichen&quot; Studien, für die Wiederherstellung der ursprünglichen Nachkommen und für eine systematische Untersuchung dieser Progenitorzellen.

Um Zygoten zu reinigen<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Wurden haploiden Zellen der entgegengesetzten Paarungstyp ausgeführt, um rot oder grün fluoreszierende Proteine, Co-inkubierten um Zygote Formation ermöglichen, und fraktioniert über eine Durchflusszytometrie-basiertes Protokoll auszudrücken. Das hoch angereicherte Fraktion ermöglicht anschließenden &quot;-schaftlichen&quot; Studien, die Verwertung von ersten Nachkommen, und systematische Untersuchung der Zygote Morphogenese.

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygoten sind essenzielle Zwischenstadien zwischen haploiden und diploiden Zuständen im Lebenszyklus vieler Organismen, einschließlich Hefe (Abbildung 1) 1. S. cerevisiae ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine gereinigte Population von Hefe-Zygoten zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst zytoplasmatisches GFP oder mit M-Cherry markierte Polyzonen in haploiden Zellen entgegengesetzten Kopplungstyps exprimiert werden. Die Zellen werden bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert, anschließend vereinigt und gemeinsam inkubiert, um die Bildung von Zygoten zu ermöglichen.Die Kopplungsmischung wird anschließend geerntet und im Wiederherstellungsmodus per Durchflusszytometrie sortiert, um doppelt positive rote und grüne Zellen zu isolieren. Diese Teilpopulation umfasst sowohl präzygotische als auch zygotische Einheiten. Zur weiteren Reinigung der Probe wird die doppelt positive Population für eine zweite Runde der Durchflusssortierung eingesetzt.Verwendung des Reinheitsmodus. Dieses Verfahren liefert eine durchschnittliche Reinheit von 90 % Zygote basierend auf der visuellen Untersuchung und Quantifizierung der Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die Vorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der sedimentationsbasierten Reinigung sind die folgenden.Zunächst bietet diese Technik eine praktische visuelle Beurteilung der Reinheit und Reifung von Zygote. Zweitens liegt die durchschnittliche Reinheit des zygotischen Anteils bei uns bei etwa 90 % – deutlich höher als bei bestehenden Methoden. Unsere Aufreinigungsmethode kann dazu beitragen, zentrale biologische Fragen zur haploiden zu diploiden Transition in eukaryotischen Zellen auf molekularer Ebene zu beantworten, da eine erhebliche Konservierung zwischen niederen und höheren Eukaryoten besteht.Daher sollte die Untersuchung von Hefezygoten ein allgemeines Verständnis der Zygotenbiologie fördern. Zygoten können nach Ansicht einiger Autoren auch als Modell für die Funktion von Vorläuferzellen oder Stammzellen betrachtet werden. Züchten Sie S. cerevisiae, VCA, Matt A und Matt alpha BY4741. Haid-Zellen durch Ausstrichen gefrorener Hefestämme auf festem Agar-Nährmedium und Inkubation der Platten entweder bei Raumtemperatur oder 30 Grad Celsius, bis am Tag vor der Zygotenreinigung Kolonien sichtbar sind. Kennzeichnen Sie zwei 50-Milliliter-Konischkolben zur Kultivierung transformierter Tabuloide als lösliches GFP und RPL25-MCherry. Inokulieren Sie eine Kultur mit transformierten Tabuloiden, die lösliches GFP im Zytoplasma exprimieren, und eine weitere mit transformierten Tabuloiden, die ein einzelnes ribosomales Protein exprimieren.RPL 25, fusioniert mit mCherry. Kultivieren Sie die Kulturen über Nacht bei 23 Grad Celsius unter Schütteln, um eine A 600 zu erreichen, die 1,0 nicht überschreitet. Um eine Kreuzung durchzuführen, stellen Sie zunächst die optische Dichte jeder Probe auf 1,0 in frischem Medium ein, was ungefähr drei mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter entspricht.Mischen Sie anschließend gleiche Volumina der beiden Kulturen in frischem Medium in einem 50-Milliliter-Konischgefäß. Wirbeln Sie kurz dreimal, dann 10 Sekunden lang gründlich. Setzen Sie eine Pipettenspitze einmal einen Zentimeter über die Oberfläche eines Raumes.Temperatur-CSM-Glucose-Platte. Starten Sie einen Timer, der 30 Minuten rückwärts zählt, und verteilen Sie sofort 40-Mikroliter-Tropfen der gemischten Kulturen entlang des Randes der Platte, wobei der Umfang abgedeckt wird. Lassen Sie die Platten etwa 30 Minuten lang bei geöffnetem Deckel auf der Laborbank trocknen.Nachdem die Flüssigkeit absorbiert wurde, die Platten abdecken und sie 1,75 bis 2,5 Stunden lang ungestört bei Raumtemperatur stehen lassen. Der Prozess des polarisierten Wachstums erzeugt die charakteristische schmo-ähnliche Morphologie. Während der schmo-Phase wachsen die beiden Haid-Zellen weiter aufeinander zu, bis Zell-Zell-Kontakt erreicht ist.Die anschließende Zellfusion führt zur Bildung des Zygots. Der neu entstandene Zygote tritt daraufhin erneut in den mitotischen Zellzyklus ein und bildet seine erste diploide Knospe aus. Nach der Inkubation stellen Sie die Platten auf Eis und gewinnen die Proben, indem Sie die einzelnen getrockneten Tröpfchenbereiche 10 bis 20 Mal mit jeweils 150 Mikrolitern kaltem CSM-Glukose waschen.Sammeln Sie die Waschlösung in 15-Milliliter-Konischen Röhrchen auf Eis. Danach, unter Beibehaltung der Proben auf Eis, beschallen Sie jedes der Röhrchen 10-mal mit einer Amplitude von 60 %. Überprüfen Sie anschließend unter dem Phasenkontrastmikroskop, dass nur wenige oder keine Aggregate mehr vorhanden sind; es wird erwartet, dass 15 bis 50 % der Zellen Zygoten gebildet haben. An diesem Punkt lassen Sie das Röhrchen mit den Zellen zur Vorsicht 10 Minuten lang ungestört in vertikaler Position auf Eis stehen, damit eventuell verbliebene Aggregate absinken können.Das oberste Volumen von 90 % gewinnen und durch ein Nylon-Mesh-Polypropylenrohr mit Siebkappe filtrieren. In einem typischen Experiment werden 10 hoch 7 Zellen von einer Platte und vier Milliliter CSM gewonnen. Die Glucose-Zellsortierung erfolgt mithilfe eines Sony-Eyesight-Reflection-Modell-Durchflusszytometers mit einem HAPS-Gerät mit einer 100-Mikron-Spitze.Beginnen Sie mit der Auswahl der Anregungslaser in der Win List 3D-Software für die GFP-Anregung. Verwenden Sie den blauen Argonne-Ionen-Laser mit 500 Milliwatt bei 488 Nanometern für die M-Cherry-Anregung. Nutzen Sie den 100-Milliwatt-Laser bei 561 Nanometern in der HAPS-Steuerungssoftware.Stellen Sie sicher, dass der Recovery-Modus ausgewählt ist und der Manteldruck für die Sortierung auf 21,5 Pfund pro Quadratzoll bei einer Tröpfchenfrequenz von 43.400 Tröpfchen pro Sekunde sowie ein Probendruck von 20,5 Pfund pro Quadratzoll eingestellt ist. Legen Sie die Sortierparameter anhand eines Vorwärtsstreuung-gegen-Rückwärtsstreuung-Diagramms fest, um lebensfähige Zellen zu erfassen. Beachten Sie, dass die hier verwendete Sony-Ideye-Maschine das Seitenstreuungsdiagramm eindeutig als Rückwärtsstreuung anzeigt, diese Rückwärtsstreuung jedoch funktionell äquivalent zur Seitenstreuung ist. Erstellen Sie ein Emissionsdiagramm von M-Cherry gegen GFP, um die Ereignisse in vier Quadranten aufzuteilen.Rot, positiv grün, negativ rot, positiv grün, positiv rot, negativ grün, negativ und rot, negativ grün, positiv. Verwenden Sie nicht fluoreszierende Zellen als Standard zur Bestimmung des rot-negativ-grün-negativ-Quadranten. Für die erste Sortierung.Wählen Sie den Erholungsmodus aus und sammeln Sie die Proben in gekühlten Mikrozentrifugenröhrchen, die 250 Milliliter kalte CSM-Glucose enthalten. Nach der Sammlung sedimentieren Sie die Zellen 10 Sekunden lang mit maximaler Drehzahl in einer gekühlten Mikrozentrifuge. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie die Flüssigkeit mittels Absaugen und resuspendieren die Zellen in 500 Mikrolitern kalter CSM-Glucose.Da eine hohe Anreicherung mit einer einzigen Sortierung nicht erreicht wird, sonizieren Sie die teilweise gereinigte Probe kurz zweimal bei 60 % Amplitude. Sortieren Sie die Zellen erneut, diesmal unter Verwendung der Reinheitsmodus-Option, und legen Sie ein Emissionsdiagramm von M-Cherry versus GFP ab. Sedimentieren Sie die gereinigten Zellen, und resuspendieren Sie die Pellets in 0,5 bis 1,0 Milliliter CSM-Glukose. Nach der Zentrifugation übertragen Sie 0,5 Milliliter in jedes der Gefäße einer 24-Loch-Platte und schütteln die Zellen anschließend 15 Minuten lang.In 24-Loch-Platten bei 23 Grad Celsius, um eine metabolische Erholung zu ermöglichen. Um Agar-Pads herzustellen, eine Suspension von 1,5 % Agar in CSM-Glukose in einem 15-Milliliter-Konischgefäß zum Kochen bringen. Die Lösung kurz vortexen und dann 0,3-Milliliter-Proben der Agar-Lösung auf die Oberfläche von mindestens zwei bis drei Standard-Glasobjektträgern auftragen; die Objektträger anschließend unmittelbar mit einem zweiten Objektträger abdecken.Üben Sie keinen Druck aus. Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten abkühlen. Falls die Aros-Pads nicht sofort verwendet werden, stellen Sie sie bei Raumtemperatur in eine befeuchtete Kammer, ohne den oberen Objektträger zu entfernen.Diese können bis zu einem Tag lang aufbewahrt werden. Entfernen Sie dann vorsichtig die obere Folie, indem Sie sie horizontal verschieben. Achten Sie darauf, eine glatte Oberfläche zu erhalten, und stören Sie die Aros-Schicht nicht. Tragen Sie innerhalb von ein bis zwei Minuten schnell Ein-Mikroliter-Aliquote der sedimentierten Zellen auf die Aros-Pads auf, ohne die Oberfläche zu berühren.Decken Sie die Probe sofort mit einem quadratischen Deckglas ab und schneiden Sie überschüssiges Agarose mit einer Rasierklinge ab. Entfernen Sie überschüssige Agarose mit einer Spritze, indem Sie Vaseline entlang der Ränder des Deckglases auftragen. Nehmen Sie Bilder mit einem Delta-Vision-System unter Verwendung eines 100x-Ölimmersionsobjektivs ohne Binning auf. Ein ideales Bildfeld zeigt eine einzelne Zellschicht mit ausreichend Platz zwischen den Zellen, um einzelne Zellen unterscheiden zu können. Erstellen Sie Aufnahmen in Abständen von 0,2 bis 0,4 Mikrometern, sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist.Analysieren Sie Zacks mit dem Programm Soft Works 5.0 0.0 und verarbeiten Sie die Daten minimal mit einer standardmäßigen Dekonvolution von 20 Zyklen. Stellen Sie die Intensität der roten gegenüber der grünen Fluoreszenz so ein, dass das Hintergrundsignal in den DeVol-Bildern minimiert wird, um die Expression der fluoreszierenden Proteine in den transformierten Zellen zu beurteilen. Die Zellen wurden vor und nach Durchführung eines Kreuzversuchs mittels Durchflusszytometrie analysiert. Im Wesentlichen waren alle M-Cherry-Transformanten rot und alle GFP-Transformanten grün.Beachten Sie, dass, obwohl das M-Cherry-Signal weniger intensiv war als das GFP-Signal, es sowohl durch Zytometrie als auch durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen wurde. Die Zellen wurden sortiert und die hellsten Zellen, die im R2-Quadranten erscheinen, wurden ausgewählt und 2,5 Stunden lang mit der GFP-Transformation kultiviert, wie hier zu sehen ist. Die rot- und grün-positive Probe stellte 8,89 % der Gesamtpopulation nach der Kreuzung dar.Dies wurde nach der ersten Wiederherstellungssortierung auf 52,4 % angereichert und anschließend durch die zweite Reinheitssortierung weiter angereichert, wobei 21 ähnliche Präparationen von rot-positiven, grün-positiven Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie untersucht wurden. Zur Beurteilung der Anzahl der Zygoten betrug die durchschnittliche Reinheit 90 %. Die Verunreinigungen bestanden entweder aus grünen oder roten Haploiden oder aus Paaren von Haploiden, die in Kontakt standen, um die Kinetik des initialen zygotischen Knospungsaustritts sowie das Vorkommen und die Verteilung medialer, lateraler und terminaler zygotischer Knospenpositionen zu bestimmen. Haploide wurden entweder 1,75 Stunden oder 2,5 Stunden miteinander gekreuzt, per Durchflusszytometrie sortiert und anschließend mittels Epi-Fluoreszenzmikroskopie untersucht.Wenn die Zellen nach 1,75 Stunden geerntet wurden, waren mehr als 50 % unbefruchtet und medial. Nach 2,5 Stunden waren laterale oder terminale Knospen gleichermaßen vertreten. Es gab jedoch ungefähr gleiche Zahlen von Zykoten in jeder der vier Kategorien, unbefruchtet mit medialen, lateralen oder terminalen Knospen.Die Struktur von Zygoten scheint während der Reinigung unverändert zu bleiben. Beachten Sie, dass das GFP in den Zellkern eindringt und auch im Kern zu finden ist, wenn die Kerne noch nicht verschmolzen sind. ES heben sich als schwarze, nicht fluoreszierende Kugeln ab.Das Endprodukt der Reinigung ergibt eine heterogene Population in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die mit A gekennzeichneten Zygoten haben keine Fusion durchlaufen. Zygoten vom Typ B sind ungefertigt.Typ C weist einen kleinen Keim auf, Typ D einen größeren Keim, und Typ E-Zygoten stehen kurz vor der Zytokinese; beachten Sie außerdem, dass viele der früheren Zygoten noch eine nicht fluoreszierende mittlere Teilungslinie aufweisen und dass die Valar-Vererbungsstruktur häufig sichtbar ist, die sich von der Zygoten in den Keim hinein erstreckt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sowohl die Erholungssortierung als auch die anschließende Reinheitssortierung einzuschließen. Wir fanden heraus, dass die zweite Sortierung entscheidend ist, um die zygotische Reinheit des Endprodukts zu erhöhen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man eine Kreuzung durchführt, um gereinigte Zygoten mittels Durchflusszytometrie zu gewinnen, die Reinheit mit mikroskopischen Methoden zu beurteilen und wie man Zygoten für die Aufnahme mittels fluoreszenzoptischer Dekonvolutionsmikroskopie präpariert und fotografiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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