Reparatur eines Critical-sized Calvaria Defect Modells mit aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen aus Lipoaspirate Geerntet

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, multipotente stromale Zellen aus Fettgewebe zur osteogenen Differenzierung zu gewinnen, wobei ein in-vivo-Kalottendefektmodell an einer Maus verwendet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Vorläuferzellen aus der stromavaskulären Schicht des Fettgewebes isoliert werden, die nach einem Liposuktionsverfahren gewonnen werden kann. Der nächste Schritt besteht darin, ein dreidimensionales Gerüst herzustellen und anschließend die Zellen auf diesem Trägermaterial zu säen.

Der letzte Schritt besteht in der Erzeugung eines kritisch großen kalvarialen Defekts in einem Rattenmodell, in den das Gerüst und die Zellen eingebracht werden. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass multipotente stromale Zellen, die aus Fettgewebe isoliert wurden, das Potenzial für die skelettale Regeneration in vivo besitzen. Die Anwendungen dieser Technik umfassen ein breites Spektrum möglicher klinischer Anwendungen aufgrund des Mangels an verfügbarem Gewebe für die skelettale Regeneration.

Obwohl autologe Knochentransplantate den Goldstandard darstellen, sind sie durch einen Mangel an Spenderstellen und Spenderstelle-Morbidität begrenzt. Allogene Transplantate und Fremdmaterialien können verwendet werden, sind jedoch durch Kosten, schlechte Integration und das Risiko von Infektionen eingeschränkt.

Die mögliche Verwendung von Fett- oder Fettgewebe zur Isolierung von Vorläuferzellen für das Engineering von Skelettgewebe ist vielversprechend. Die Demonstration des Verfahrens werde ich gemeinsam mit Michael Chung aus dem Labor von Long Anchor durchführen. Zunächst wird humanes subkutanes Fettgewebe aus elektiven Liposuctionsverfahren gewonnen.

Beachten Sie die beiden Schichten im Liposaugat. Der Überstand enthält den überwiegenden Teil des zellulären Materials aus dem Prozess. Die untere Schicht besteht hauptsächlich aus injizierter Kochsalzlösung.

Stromazellen aus Fettgewebe können aus beiden Schichten gewonnen werden, aber die Ausbeute ist aus dem Überstand deutlich höher. Um die stromavaskuläre Fraktion oder SVF-Waschung zu isolieren, wird das Liposukt gründlich mit gleichen Volumina eines 1x phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder PBS, das 2,5 % Betadine enthält, gewaschen und anschließend mit einem gleichen Volumen 1x PBS ohne Betadine. Man lässt die Waschung ausflocken.

Stellen Sie sicher, dass während des gesamten Vorgangs eine sterile Technik eingehalten wird, um eine Kontamination mit verarbeitetem menschlichen Gewebe zu vermeiden. Danach aspirations die untere Schicht ab und entsorgen Sie diese nach jedem Waschgang. Anschließend überführen Sie 15 Milliliter Fettgewebe in 50-Milliliter-Falcon-Konischgefäße. Danach verdauen Sie das Fettgewebe in 15 Milliliter filtrierter 0,075 % filtrierter Lösung.

Verdauen Sie Typ II-Kollagenase in Hank’s Balanced Salt Solution oder HBSS bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad für 60 Minuten unter ständiger Agitation; stellen Sie sicher, dass Sie die Röhrchen alle 15 Minuten belüften. Anschließend neutralisieren Sie die Enzymaktivität mit 15 Milliliter PBS, das 10 % fetalen Kälberserum oder FBS enthält, und zentrifugieren Sie. Um ein dichtes SVF-Pellet zu erhalten, wird das Pellet aus einer Mischung von aus Fettgewebe stammenden Stammzellen und Erythrozyten bestehen.

Entfernen Sie zuerst die überstehende Fettschicht und anschließend die überstehende Flüssigkeitsschicht, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter herkömmlichem Wachstumsmedium. Kombinieren Sie dann drei Röhrchen in einem sauberen 50-Milliliter-Konischgefäß mithilfe eines 100-Mikron-Filters und zentrifugieren Sie.

Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie anschließend das Pellet. Kombinieren Sie zwei 50-Milliliter-Konischgefäße pro 10-Zentimeter-Platte oder fünf 5-Milliliter-Konischgefäße pro 15-Zentimeter-Platte in fünf Millilitern herkömmlichem Wachstumsmedium. Stellen Sie Primärkulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid ein.

Nach der Übernachtung die Platten mit PBS waschen, um restliche nicht-angewachsene rote Blutkörperchen zu entfernen. Die resultierenden Zellpopulationen sind aus Fettgewebe stammende Stromazellen. Die Zellen auf subkonfluenten Niveaus halten, um eine spontane Differenzierung zu verhindern.

Bei 37 Grad Celsius, 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. In Wachstumsmedium müssen die Zellen in der Regel alle drei bis vier Tage im regulären Wachstumsmedium geteilt werden. Wenn sie bei 50 % Konfluenz angesät werden, bereiten Sie das Gerüst wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben vor.

Wenn die Zellen subkonzluente Stufen erreichen, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Trypsin. Zählen Sie die Zellen, um sie zu quantifizieren. Zum Aussäen bereiten Sie vor, die Zellen auf vorgeschnittenen Gerüsten mit einem Durchmesser von vier Millimetern mit 1,5 × 10⁵ Zellen auszusäen.

Legen Sie ein einzelnes Gerüst in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte und resuspendieren Sie die Zellen in regulärem Wachstumsmedium mit einer Konzentration von etwa 1,5 × 10⁵ Zellen pro 20 µL Medium. Besiedeln Sie das Gerüst, indem Sie 20 µL der Lösung direkt in das Gerüst pipettieren, und stellen Sie dies für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator.

Nach 30 Minuten 200 Mikroliter Medium hinzufügen und die Zellen über Nacht auf dem Gerüst inkubieren lassen. Vor der Operation ist es nicht notwendig, die Adhäsion der Zellen auf dem Gerüst nach der Aussaat zu überprüfen. Eine ausreichende Anzahl von Zellen stellt sicher, dass die Mehrheit an dem Gerüst anhaften wird.

Nach der Anästhesie eines erwachsenen, 60 Tage alten CD1-Nacktmäuses sterilisieren Sie die Operationsstelle dreimal mit Betadine und Alkohol und tragen Sie ein Augenschmiermittel auf die Augen der Maus auf. Anschließend führen Sie einen medianen sagittalen Hautschnitt in der Kopfhaut der Maus durch, um den rechten Parietalknochen freizulegen. Entfernen Sie die Periostschicht vom rechten Parietalknochen durch stumpfes Abkratzen.

Als Nächstes erzeugen Sie einen einseitigen, vier Millimeter großen Defekt in der vollen Dicke des rechten, nicht näharbeitenden Schläfenbeins. Verwenden Sie einen Diamant-beschichteten Bohrer und seien Sie äußerst vorsichtig, um die darunterliegende Dura mater nicht zu verletzen, da die Dicke des Maus-Kalottens weniger als 0,3 Millimeter vor der Implantation beträgt. Spülen Sie die Gerüste mit steriler PBS, um die Übertragung wachstumsfaktorhaltigen Mediums zu verhindern.

Platzieren Sie das Scaffold in den Defekt. Nähen Sie abschließend die Haut zu und überwachen Sie das Tier gemäß etablierter postoperativer Protokolle. Führen Sie eine Mikro-CT-Untersuchung am Maus durch und gewinnen Sie ein 3D-rekonstruiertes Bild mithilfe der MicroView-Software.

Verwenden Sie Adobe Photoshop, um die Bilder auf eine Standardhöhe zu skalieren. In der Regel messen wir alle zwei Wochen die Regeneration des Schädeldaches. Die Mäuse werden während der Untersuchung für die Langzeitnachverfolgung anästhesiert und letztendlich euthanasiert.

Verwenden Sie für die histologische Analyse die Zauberstab-Funktion, um die Pixel des kranialen Defekts zu messen. Bestimmen Sie die prozentuale Heilung des Defekts anhand nachfolgender CT-Scans. Messen Sie die Fläche des kranialen Defekts, ermitteln Sie die Pixelanzahl und teilen Sie diese durch die ursprüngliche Pixelanzahl des Defekts. Färben Sie mehrere Schnitte entlang der Ausdehnung des Defekts mit histologischen Färbemethoden wie Alizarinrot in Blau und Pen Aro, um die Osteogenese darzustellen.

Verwenden Sie Adobe Photoshop, um alle Bereiche, die nicht im kranialen Defekt liegen, zuzuschneiden, und nutzen Sie den Zauberstab, um die Anzahl der Pixel der de novo Knochenbildung im Defektbereich zu bestimmen, und vergleichen Sie dies mit Kontrollen oder anderen Variablen. Gezeigt ist hier eine Übersicht über die Gewinnung und Anwendung von Liposuktat, von der Isolierung adiposetischer stromaler Zellen bis hin zu deren Expansion, Differenzierung und Nutzung in vitro und in vivo. Hier sehen Sie eine Mikro-CT-Aufnahme, die die in vivo-Heilung eines kritisch großen kranialen Defekts nach Applikation von ASCs über ein Hydroxylapatit-Gerüst zeigt, wie in der unteren Zeile zu sehen ist.

Die Steuerungen, die in der oberen Zeile zu sehen sind, umfassen keine Gerüststruktur und keinen Defekt. Die mittlere Zeile zeigt den Defekt mit der Platzierung des Gerüsts ohne Zellen. LS, hier dargestellt, ist die Quantifizierung der knöchernen Heilung aus der Mikro-CT, die eine signifikant verbesserte Heilung in der A SC-Gruppe zeigt.

Dies ist ein histologisches Bild, das die erhöhte Osteobildung der A SC-Gruppe durch Andal zeigt. In Blau und Pen AROM-Färbung für Al. In Blau färbt das Osteoid dunkelblau für Pen Arom.

Die hier gelb angefärbte Osteoidsubstanz zeigt humane ASCs, die mit GFP markiert und auf einem Scaffold ausgesät wurden und nach zwei Wochen entnommen wurden. Die Färbung erfolgte mit einem GFP-markierten Antikörper, um die Beteiligung menschlicher Zellen an der Regeneration im Defektbereich darzustellen. Dargestellt ist hier die Immunchemie für humanes nukleäres Antigen, die nach zwei Wochen das Vorhandensein menschlicher Zellen im Defektbereich zeigt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Aufarbeitung des Fettgewebes innerhalb von vier Stunden erfolgen, und der chirurgische Eingriff dauert etwa 10 Minuten pro Maus. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Schädelknochen rund ist, während der Bohrer flach ist, weshalb sorgfältig vorgegangen werden muss, um die gesamte Umfangslinie des vier Millimeter großen Defekts zu durchtrennen. Gehen Sie langsam vor, um die Dura mater des Gehirns nicht zu verletzen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Vorläuferzellen aus dem Fettgewebe isoliert. Diese Zellen auf ein Trägergerüst aufbringen und in die Maus einsetzen.