Name: Reparatur eines Critical-sized Calvaria Defect Modells mit aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen aus Lipoaspirate Geerntet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T10:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Stromazellen aus Fettgewebe für die knöcherne Regeneration in einem kritischen Schädeldefektmodell. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung osteogener Differenzierung in vivo.

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Wir möchten Dr. George Commons und Dr. Dean Vistnes für ihre Unterstützung und Zusammenarbeit unserer Forschung danken. Diese Arbeit wird von National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung Zuschüsse 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 und RC2 DE020771-02, der Oak Foundation und Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medizin zum MTL Dr. Hyun unterstützt wird von der Saint Joseph Mercy Hospital GME unterstützt .

Ein. Zellisolation &amp; Expansion <ol><li> Alle Einwilligung des Patienten und experimentelle Protokolle wurden überprüft und von der Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 und # 9999) genehmigt. </li><li> Erhalten menschlichen subkutanen Fettgewebe von elektiven lipoaspiration Verfahren unter örtlicher / Vollnarkose. </li><li> Es wird zwei Schichten in der lipoaspirate (1A) sein. Der Überstand enthält den größten Teil des verarbeiteten Zellmaterial. Die untere Schicht wird meistens injiziert Kochsalzlösung. Adipose-abgeleiteten Stromazellen aus beiden Schichten können geerntet werden, aber die Ausbeute ist wesentlich größer aus dem Überstand. </li><li> Die Stromazellen vaskulären Fraktion (SVF) zu isolieren, wäscht den lipoaspirate ausgiebig mit gleichen Volumina von 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 2,5% betadine (x2), die von gleichen Volumen von PBS 1X (x1) ohne betadine gefolgt. Lassen Sie die Wäsche auszufallen. </li><li> Achten Sie darauf, sterile te zu haltenchnique während des gesamten Prozesses, da eine Verunreinigung mit verarbeitetem menschlichem Gewebe passieren kann. </li><li> Saugen Sie die untere Schicht und entsorgen nach jeder Wäsche. </li><li> Aliquot 15 ml Fettgewebe in 50 ml BD Falcon konische Röhrchen. </li><li> Verdauen die Fettgewebe mit einem gleichen Volumen (15 ml) filtriert 0,075% Typ II Kollagenase in Balanced Salt Solution Hank (HBSS) bei 37 ° C in einem Wasserbad für 60 Minuten unter ständigem Rühren (ca. 180 schüttelt / min) - Belüftung jedes Rohr alle 15 min. </li><li> Neutralisieren Enzymaktivität mit 15 ml PBS, das 10% (Fetal Bovine Serum) FBS und Zentrifuge bei 1000 UpM für 5 min bei 4 ° C, um eine mit hoher Dichte SVF Pellet zu erhalten. Das Pellet wird eine Mischung aus Fettgewebe gewonnen Stromazellen und Erythrozyten sein. </li><li> Überstand verwerfen, ohne dass der Pellet. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 10 ml herkömmlichen Nährmedien (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung). </li><li> Filter Aufhängung<html> sion durch ein 100 um Nylon Zellsieb um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Kombinieren Sie 3 Rohre in ein sauberes 50 ml konisch. Zentrifugieren bei 1000 UpM für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen, ohne dass der Pellet. </li><li> Das Pellet in 5 ml herkömmlichen Nährmedien </li><li> Kombinieren Sie zwei 50 ml Schrägen pro 10 cm Platte oder fünf 50 ml Schrägen für eine 15 cm Platte. </li><li> Stellen primären Kulturen über Nacht bei 37 ° C/21% O 2, 5% CO 2. </li><li> Nach Inkubation über Nacht, wäscht die Platten ausgiebig mit PBS, um restliche nichthaftenden roten Blutkörperchen zu entfernen. Die erhaltenen Zellpopulationen Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen. </li><li> Pflegen Sie die Zellen bei sub-konfluenten Ebenen spontane Differenzierung bei 37 ° C/21% O 2, 5% CO 2 in Nährmedien zu verhindern. Die Zellen müssen in der Regel aufgeteilt alle drei bis vier Tage in regelmäßigen Nährmedien werden, wenn bei 50% Konfluenz. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Gerüst Vorbereitung <ol><li> School of Dentistry - Gerüste wurden von Dr. Min Lee an der University of California, Los Angeles. </li><li> PLGA Gerüste wurden von 85/15 Poly (Milch-co-Glykolsäure) (inhärente Viskosität = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) im Gießverfahren und einem teilchenförmigen Laugung hergestellt. </li><li> PLGA / Chloroformlösungen wurden mit 200-300 Mikrometer Durchmesser Saccharose gemischt bis 92% Porosität (Volumenanteil) und komprimiert zu dünnen Blechen in einer Teflonform erhalten. </li><li> Nach Gefriertrocknung über Nacht wurden Gerüste in drei Änderungen zweifach destilliertem (dd) H 2 O eingetaucht, um die Saccharose lösen und vorsichtig aus dem Teflon Platte mit einem feinen Spitze Spatel entfernt. </li><li> Nach teilchenförmigen Auslaugen wurden alle Gerüste durch Eintauchen in 50%, 60% und 70% Ethanol für 30 min jeden desinfiziert, gefolgt von drei Spülungen mit ddH 2 O. </li><li> Alle Gerüste wurden unter einer Sterilbank getrocknet. </li><li> Nach Gerüst Fertigung, scaffolds wurden mit Apatit beschichtet ist. <ol class="ualpha"><li> SBF (simulierter Körperflüssigkeit) Lösung wurde mit Ionenkonzentrationen, die das 5-fache von menschlichem Blutplasma wurden hergestellt. Alle Lösungen wurden sterilfiltriert durch einen 0,22 um PES-Membran (Nalgene). Unmittelbar vor dem Beschichtungsvorgang, getrocknet PLGA Gerüsten Glimmentladung, Argon-Plasma-Ätzen (Harrick Scientific) unterzogen wurden, um die Benetzung und Beschichtungsgleichmäßigkeit verbessern. </li><li> Geätzten PLGA Gerüste wurden dann in SBF bei 37 ° C innerhalb einer Wassermantel-Inkubator für 12 Stunden, gefolgt durch Mg 2 + und HCO 3 - freien SBF 2 für weitere 12 Stunden bei 37 ° C unter leichtem Rühren. </li><li> Beschichtete PLGA Gerüste wurden vorsichtig mit steriler ddH 2 O gespült abzuwaschen Überschuß Natriumchloridlösung, in einer Sterilbank getrocknet und desinfiziert mit 70% Ethanol. </li><li> Integrität des Apatit-Beschichtung wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) analysiert. Apatitbeschichteten scaffolds wurden auf SEM Stubs (Ted Pella) montiert und beschichtet mit Kohlenstoff, um die Leitfähigkeit zu verbessern. Die Sekundär-Elektronen-Modus wurde während SEM (FEI / Phillips XL-30) Beobachtung angewendet. Energiedispersion Röntgenspektrum erhalten wurde, um elementaren Zusammensetzung der Apatitstrukturen bestätigen. </li></ol></li></ol> 3. Zellaussaat <ol><li> Bei Erreichen sub-Mündung Ebenen, waschen Sie die Zellen mit PBS (x2) und trypsinieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen für die Aussaat zu quantifizieren </li><li> Saatgut auf vorgeschnittenen 4,0 mm Durchmesser Gerüste mit 1,5 x 10 5 Zellen. <ol class="ualpha"><li> Ort einzelnen Gerüst in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte </li><li> Resuspendieren Zellen in regelmäßigen Wachstumsmedium mit einer Konzentration von etwa 1,5 x 10 5 Zellen pro 20 ul Medium </li><li> Pipette 20 ul direkt auf das Stützgerüst aufnehmen und in Zellkulturbrutschrank für 30 min. </li><li> Nach 30 min, 200 ul Medium und ermöglicht Zellen zu inkubierenauf dem Gerüst über Nacht vor der Operation </li><li> Es ist nicht notwendig, um sicherzustellen, Adhäsion der Zellen auf das Stützgerüst als Impfen eine ausreichende Anzahl von Zellen wird sicherstellen, dass eine Mehrheit wird auf das Stützgerüst zu befestigen. Dies wurde in unserem Labor in vivo mit Biolumineszenz und histologische Analyse validiert. </li></ol></li></ol> 4. Erstellung von Calvaria Mängel und in vivo-Implantation <ol><li> Anesthetize Erwachsenen (60 Tage alt) CD-1 Nacktmäusen mit Betäubung Cocktail. (Ketamin / Xylazin / Acepromazin) bei 50% Konzentration (1:1 Verdünnung mit 0,9% NaCl) oder per empfohlenen Anästhesie Therapie pro Institution Protokolle. Diese Mäuse sind athymischen so die hASCs nicht dazu führen, eine Immunreaktion. <ol class="lalpha"><li> Dosierung: Ketaminhydrochlorid (80 mg / kg), Xylazin (2,5 mg / kg) Acepromazin (2,5 mg / kg) </li><li> Wirkungsdauer: ca. 30 min </li></ol></li><li> Chirurgisch drapieren das Tier und sterilisieren die chirurgischeAufstellungsort mit betadine und Alkohol (x3) und decken die Mausaugen mit Salbe bevor eine Mittellinie sagittalen Schnitt in der Kopfhaut des Tieres, um den rechten parietalen Knochen freizulegen. Entfernen Sie die Perikranium von der rechten Scheitelbein mit stumpfen Schaben (Abbildung 1B). </li><li> Erstellen Sie eine einseitige 4-mm-Dicke Defekt in der rechten Nicht-Naht verbundenen Scheitelbein mit einer sterilen diamantbeschichteten trephine Bohrer. Extreme Vorsicht zu dürfen, um die zugrunde liegenden Dura mater (Abbildung 1B) wie die Maus Calvaria Dicke stören werden ist &lt;0,3 mm. </li><li> Vor der Implantation spülen Gerüsten mit steriler PBS auf Übertragung von Medium-Wachstumsfaktoren verhindern. </li><li> Legen Sie das Gerüst in den Defekt. </li><li> Schließlich nähen die Haut geschlossen und Überwachung der Tier pro etablierten postoperative Protokolle. </li><li> Verwenden gegründet Analgesie, wie von Ihrem animal care Protokolle nach Bedarf postoperativ-zB gerichtet. Buprenorphin 0,1 mg / kg. </li></ol> 5. Quantifizierung der Osteoidbildung <ol><li> Nach MicroCT an der Maus durchgeführt wurde, wurde das dreidimensionale Bild rekonstruiert MicroView Software, wie zuvor beschrieben ein. </li><li> Mit Adobe Photoshop, waren die Bilder so bemessen, dass ein Standard-Höhe. </li><li> Mit dem Zauberstab-Funktion wurden Pixel des Calvaria Defekt gemessen. </li><li> Prozentsatz Heilung des Mangels durch nachfolgende CT-Scans Messung der Calvaria Defektbereich und Bestimmung Pixelzahl und dividiert sie durch die ursprünglichen Mangel der Pixelanzahl bestimmt </li><li> Wenn folglich die MicroCT nicht verfügbar ist, wird eine alternative Verwendung von Adobe Photoshop und Ernten des Calvaria bei ermittelt Zeitpunkten für die Histologie. </li><li> Mithilfe histologischer Flecken wie Anilin Blau und Pentachrome die Osteoidbildung bezeichnen, sollten mehrere Abschnitte entlang der Spannweite des Mangels gebeizt </li><li> Mit Adobe Photoshop, Beschneiden, alle Bereiche, die nichtim Calvaria Defekt </li><li> Verwenden Sie den Zauberstab Funktion und bestimmen Pixelzahlen von de novo Knochenbildung im Bereich des Defekts und vergleichen, um Steuerelemente oder andere Variablen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Fettgewebe hat das Potenzial, eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Vorläuferzellen für die klinische Anwendung dienen. Fettgewebe hat einen einzigartigen Vorteil, dass es eine leicht verfügbar Versorgung, die in einem relativ einfachen Verfahren, das nur minimale Morbidität und Mortalität beinhaltet geerntet werden kann. Sobald das Gewebe wird geerntet und gesammelt, unser Protokoll in Abbildung 2 dargestellt. Fettgewebe-abgeleitete Stromazellen durch eine Reihe von Waschschritten Kollagenaseverdau und Zentrifugation isoliert. Sobald die Zellen in Kultur plattiert sind, können sie expandiert, in Verkehr in verschiedene Protokolle Differenzierung in vitro oder in vivo direkt platziert. Die creation der 4 mm-kritische Größe Calvaria Defekt stellt eine leicht zugängliche und reproduzierbare in vivo-Modell um die osteogene Differenzierung Fähigkeit unserer Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen testen. Durch den Einsatz von MicroCT, sind wir in der Lage, die Bildung von Knochengewebe in vivo zu verfolgen und den Fortschritt unserer Interventionen (Abbildung 3). Die kritische Größe Calvaria Defekt wird nicht innerhalb der Lebensdauer des Tieres zu heilen und wir sehen rund 90% des Defekts Patent bleiben rund 8 Wochen. Das Gerüst selbst (siehe Diskussion) hat osteogene induktiven Eigenschaften und hat gezeigt, die Fähigkeit, einige knöcherne Regeneration induzieren. Die typischen Ergebnisse Gerüst Platzierung ohne Zellen zeigt, dass rund ein Drittel der Defekt wird de novo Knochenbildung bei 8 Wochen. Mit der Zunahme von Fettgewebe gewonnen Stromazellen, volle zwei Drittel oder mehr der Defekt wird Knochenregeneration bei rund 8 Wochen zeigen, obwohl es Variability zwischen den einzelnen Tier-und Chirurgie. Die Bildung von Knochengewebe durch Histologie quantifiziert werden und typische Ergebnisse zeigen erhöhte Osteoidbildung in Proben mit ASCs durch Anilinblau und Pentachrome Färbung (3C). Darüber hinaus zeigen wir, dass die implantierten menschlichen Zellen auf die zugrunde liegende de novo knöchernen Bildung beitragen, durch die Verwendung von GFP-markierten hASCs die Färbung zeigen in vivo nach 2 Wochen nahe dem Bereich der de-novo-Knochenbildung im Calvaria Defekt (Figur 3D) . Zusätzlich verwenden wir Immunhistochemie mit menschlichen spezifischen Antikörpers gegen menschliches Zellüberleben und Beitrag im Bereich des Defektes (3E) zu zeigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> Abbildung 1 A -. Die lipoaspirate hat zwei Schichten. Die oberste Schicht enthält die Adipozyten und die Mehrheit der processes Zellmaterial während die untere Schicht die Salzlösung während der lipoaspiration Verfahren verwendet. B - die Schaffung des Calvaria Defekt durch eine Inzision über dem Perikranium die richtige Scheitelbein, anschließende Einrichtung einer 4 mm kritische Größe Calvaria Defekts ohne Unterbrechung des zugrunde liegenden Dura mater zu isolieren. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> Abbildung 2. Übersicht der Erntemaschine und Anwendung lipoaspirate aus der Isolierung von Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen, um ihre Expansion, Differenzierung und Verwendung in vitro und in vivo. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein-MicroCT zeigt in vivo Heilung der kritischen Größe Calvaria Defekt mit der Anwendung über eine ASCs hydroxyapatitie Gerüst (untere Reihe). Die Kontrollen umfassen keine Gerüst und Defekt (obere Reihe) und Defekt mit der Platzierung des Gerüsts ohne Zellen (mittlere Reihe) B - Quantifizierung der Knochenheilung vom MicroCT zeigt deutlich erhöht Heilung in der ASC-Gruppe. C - Histologie zeigt erhöhte Osteoidbildung der ASC-Gruppe (untere Reihe) durch Anilin Blau und Pentachrome Färbung. Für Anilin Blau, die Osteoid Flecken dunkelblau und für Pentachrome, die Osteoid Flecken gelb. D - hASCS mit GFP-markierten wurden auf einem Gerüst ausgesät und in eine Calvaria Defekt gelegt und opferte bei 2 Wochen. Die Färbung wurde mit einem GFP-markierten Antikörper, die menschlichen Zellen Beitrag zur Regeneration in der Stelle des Defekts anzuzeigen getan. E -. Menschliche nuclear antigen Immunhistochemie zeigt Prävalenz von menschlichen Zellen im Bereich des Defektes nach 2 Wochen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Da die Isolation von Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen 2 ab lipoaspirate wurden diese Zellen in einer Vielzahl von zellulären Abstammungslinien differenziert. Fettgewebe ist aus mesodermalen Ursprungs und daher multipotent Fettgewebe gewonnene Stromazellen wird wahrscheinlich am effektivsten mit der Anwendung zu einem mesodermalen Linie. Die Fähigkeit, Skelettgewebe erzeugen ist besonders kritisch, da der Mangel an Entnahmestellen für eine autologe und die damit verbundenen Einschränkungen aus Kunststoff e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz: </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lipoaspirate Ernte </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Cellgro </td><td> 21-023-CV </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C6885-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-top 500 ml 0,22 um-Filter </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Calvaria Defect </td></tr><tr><td> Z500 Brushless MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> Circular Knife 4,0 mm </td><td> Xemax Surgical </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

reparatur eines critical-sized calvaria defect modells mit aus fettgewebe gewonnenen stromazellen aus lipoaspirate geerntet

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Kraniofazialen skelettalen Reparatur und Regeneration bietet das Versprechen von de novo Gewebebildung durch einen Zell-basierten Ansatz Verwendung Stammzellen. Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASC) haben sich eine reiche Quelle von multipotenten Stammzellen fähig ist, osteogene, chondrogener, adipogene und myogenen Differenzierung. Viele Studien haben die osteogene Potential dieser Zellen in vivo untersucht unter Verwendung von verschiedenen Biomaterialien Gerüst für zellulare Lieferung. Es hat sich gezeigt, dass durch Verwendung eines osteokonduktiven, Hydroxylapatit-beschichteten Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA HA-) Gerüst seeded mit ASCs eine kritische Größe Calvaria Defekt, ein Defekt, der durch seine Unfähigkeit, eine spontane definiert ist Heilung über die gesamte Lebensdauer des Tieres, kann wirksam werden zeigen, robust Knochenregeneration. Diese in vivo Modell zeigt die Grundlage für translationale Ansätze gerichtet, um den Knochen zu regenerieren - die zelluläreKomponente und biologischen Matrix. Diese Methode dient als Modell für die letztendliche klinische Anwendung einer Vorläuferzelle in Richtung der Reparatur eines Gewebedefekts bestimmten.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Fettgewebe gewonnen Stromazellen aus lipoaspirate und die Schaffung einer 4 mm kritische Größe Calvaria Defekt Skelett Regeneration zu bewerten.

Reparatur eines Critical-sized Calvaria Defect Modells mit aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen aus Lipoaspirate Geerntet

Die Reparatur und Regeneration des kraniofazialen Skeletts verspricht eine De-novo-Gewebebildung durch einen zellbasierten Ansatz unter Verwendung von Stammzellen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, multipotente stromale Zellen aus Fettgewebe zur osteogenen Differenzierung zu gewinnen, wobei ein in-vivo-Kalottendefektmodell an einer Maus verwendet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Vorläuferzellen aus der stromavaskulären Schicht des Fettgewebes isoliert werden, die nach einem Liposuktionsverfahren gewonnen werden kann. Der nächste Schritt besteht darin, ein dreidimensionales Gerüst herzustellen und anschließend die Zellen auf diesem Trägermaterial auszusäen.Der letzte Schritt besteht in der Erzeugung eines kritisch großen kalvarialen Defekts in einem Rattenmodell, in den das Gerüst und die Zellen eingebracht werden. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass multipotente stromale Zellen, die aus Fettgewebe isoliert wurden, das Potenzial für die skelettale Regeneration in vivo besitzen. Die Anwendungen dieser Technik umfassen ein breites Spektrum möglicher klinischer Anwendungen aufgrund des Mangels an verfügbarem Gewebe für die skelettale Regeneration.Obwohl autologe Knochentransplantate den Goldstandard darstellen, sind sie durch einen Mangel an Spenderstellen und Spenderstelle-Morbidität begrenzt. Allogene Transplantate und Fremdmaterialien können verwendet werden, sind jedoch durch Kosten, schlechte Integration und potenzielle Infektionen eingeschränkt.Die mögliche Verwendung von Fett- oder Fettgewebe zur Isolierung von Vorläuferzellen für das Engineering von Skelettgewebe ist vielversprechend. Die Demonstration des Verfahrens werde ich gemeinsam mit Michael Chung aus dem Long-Anker-Labor durchführen. Zunächst wird humanes subkutanes Fettgewebe aus elektiven Liposuctionsverfahren gewonnen.Beachten Sie die beiden Schichten im Liposaugat. Das Überstand enthält den überwiegenden Teil des zellulären Materials aus dem Prozess. Die untere Schicht besteht hauptsächlich aus injizierter Kochsalzlösung.Stromazellen aus Fettgewebe können aus beiden Schichten gewonnen werden, aber die Ausbeute ist aus dem Überstand deutlich größer. Um die stromavaskuläre Fraktion oder SVF-Waschung zu isolieren, wird das Liposaspirat umfassend mit gleichen Volumina eines x Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung oder PBS, das 2,5 % Betadine enthält, gewaschen und anschließend mit einem gleichen Volumen XPBS ohne Betadine versetzt. Man lässt die Waschung ausfallen.Stellen Sie sicher, dass während des gesamten Vorgangs eine sterile Technik eingehalten wird, um eine Kontamination mit verarbeitetem menschlichem Gewebe zu vermeiden. Danach aspirieren Sie die untere Schicht und entsorgen Sie diese nach jeder Wäsche, dann überführen Sie 15 Milliliter Fettgewebe in 50-Milliliter-Falcon-Zentrifugenröhrchen. Anschließend verdauen Sie das Fettgewebe in 15 Milliliter filtrierter 0,075 % filtrierter Lösung.Verdauen Sie Typ zwei Collagenase in Hank's Balanced Salt Solution oder HBSS bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad für 60 Minuten unter ständiger Agitation; stellen Sie sicher, dass Sie die Röhrchen alle 15 Minuten belüften. Neutralisieren Sie anschließend die Enzymaktivität mit 15 Milliliter PBS, das 10 % fetalen Kälberserum oder FBS enthält, und zentrifugieren Sie. Um ein pelletreiches stromalvaskuläres Fraktion (SVF)-Pellet zu erhalten, das aus einer Mischung von adipogenen Stammzellen und Erythrozyten besteht, führen Sie die Zentrifugation durch.Entfernen Sie zuerst die überstehende Fettschicht und anschließend die überstehende Flüssigkeitsschicht, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter herkömmlichem Wachstumsmedium. Kombinieren Sie dann drei Röhrchen in einem sauberen 50-Milliliter-Konischglas über einen 100-Mikron-Filter und zentrifugieren Sie. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie anschließend das Pellet. Kombinieren Sie zwei 50-Milliliter-Konischkolben pro 10-Zentimeter-Platte oder fünf 5-Milliliter-Konischkolben pro 15-Zentimeter-Platte in fünf Milliliter traditionellem Wachstumsmedium. Stellen Sie Primärkulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid ein.Nach der Übernachtung die Platten mit PBS waschen, um restliche nicht-angewachsene rote Blutkörperchen zu entfernen. Die resultierenden Zellpopulationen sind aus Fettgewebe stammende Stromazellen. Die Zellen auf subkonfluenten Niveaus halten, um eine spontane Differenzierung zu verhindern.Bei 37 Grad Celsius, 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. In Wachstumsmedium müssen die Zellen im Allgemeinen alle drei bis vier Tage im regulären Wachstumsmedium geteilt werden. Wenn sie bei 50 % Konfluenz angesät werden, bereiten Sie das Gerüst gemäß der dazugehörigen Veröffentlichung vor.Wenn die Zellen subkoniuentes Wachstum erreicht haben, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und behandeln Sie sie mit Trypsin. Zählen Sie die Zellen, um sie zu quantifizieren. Bereiten Sie für die Aussaat die Zellen auf vorgeschnittenen Gerüsten mit vier Millimeter Durchmesser mit 1,5 × 10⁵ Zellen vor.Legen Sie ein einzelnes Scaffold in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte und resuspendieren Sie die Zellen in regulärem Wachstumsmedium mit einer Konzentration von etwa 1,5 × 10⁵ Zellen pro 20 µL Medium. Besiedeln Sie das Scaffold, indem Sie 20 µL der Lösung direkt in das Scaffold pipettieren, und stellen Sie dies für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator.Nach 30 Minuten 200 Mikroliter Medium hinzufügen und die Zellen über Nacht auf dem Gerüst inkubieren lassen. Vor der Operation ist es nicht notwendig, die Adhäsion der Zellen auf dem Gerüst als Aussaat sicherzustellen. Eine ausreichende Anzahl von Zellen gewährleistet, dass die Mehrheit auf dem Gerüst anhaften wird.Nach der Anästhesie eines erwachsenen, 60 Tage alten CD1-Nacktmäuses sterilisieren Sie die Operationsstelle dreimal mit Betadine und Alkohol und tragen Sie ein Augenschmiermittel auf die Augen der Maus auf. Anschließend führen Sie einen medianen sagittalen Hautschnitt in der Kopfhaut der Maus durch, um den rechten Parietalknochen freizulegen. Entfernen Sie die Pannikelhaut vom rechten Parietalknochen durch stumpfes Abkratzen.Als Nächstes wird ein einseitiger, vier Millimeter großer Defekt in der vollen Dicke des rechten, nicht an Nähten liegenden Parietalknochens angelegt. Unter Verwendung eines Diamant-beschichteten Bohrers ist äußerste Vorsicht geboten, um die darunterliegende Dura mater nicht zu verletzen, da die Dicke des Schädeldaches bei der Maus vor der Implantation weniger als 0,3 Millimeter beträgt. Spülen Sie die Scaffolds mit steriler PBS, um die Übertragung wachstumsfaktorhaltiger Medien zu verhindern.Platzieren Sie das Scaffold in den Defekt. Nähen Sie schließlich die Haut zu und überwachen Sie das Tier gemäß etablierter postoperativer Protokolle. Führen Sie eine Mikro-CT-Untersuchung am Mäuschen durch und gewinnen Sie ein 3D-rekonstruiertes Bild mithilfe der MicroView-Software.Verwenden Sie Adobe Photoshop, um die Bilder auf eine Standardhöhe zu skalieren. In der Regel messen wir alle zwei Wochen die Regeneration des Schädeldaches. Die Mäuse werden während der Langzeitverfolgungsscan narkotisiert und letztendlich euthanasiert.Verwenden Sie für die histologische Analyse die Zauberstab-Funktion, um die Pixel des kranialen Defekts zu messen. Bestimmen Sie den prozentualen Heilungsgrad des Defekts anhand nachfolgender CT-Scans. Messen Sie die Fläche des kranialen Defekts, ermitteln Sie die Pixelanzahl und teilen Sie diese durch die ursprüngliche Pixelanzahl des Defekts. Färben Sie mehrere Schnitte entlang der Ausdehnung des Defekts mit histologischen Färbemethoden wie Anilinblau und Pen-Aro, um die Osteogenese darzustellen.Verwenden Sie Adobe Photoshop, um alle Bereiche, die nicht im kranialen Defekt liegen, auszuschneiden, und nutzen Sie den Zauberstab, um die Anzahl der Pixel der de novo Knochenbildung im Defektbereich zu bestimmen; vergleichen Sie dies mit Kontrollen oder anderen Variablen. Dargestellt ist hier eine Übersicht über die Gewinnung und Anwendung von Liposuktionat, von der Isolierung adiposetabstammiger stromaler Zellen über deren Expansion, Differenzierung bis hin zur Anwendung in vitro und in vivo. Hier sehen Sie eine Mikro-CT-Aufnahme, die die in vivo-Heilung eines kritisch großen kranialen Defekts nach Applikation von ASCs mittels eines Hydroxylapatit-Scaffolds zeigt, wie in der unteren Zeile zu sehen ist.Die Steuerungen, die in der oberen Zeile zu sehen sind, umfassen keine Gerüststruktur und keinen Defekt. Die mittlere Zeile zeigt den Defekt mit der Platzierung des Gerüsts ohne Zellen. LS, das hier dargestellt ist, ist die Quantifizierung der knöchernen Heilung aus der Mikro-CT, die eine signifikant verbesserte Heilung in der A SC-Gruppe zeigt.Dies ist ein histologisches Bild, das eine erhöhte Osteobildung in der A SC-Gruppe durch Andal zeigt. In Blau und Pen AROM-Färbung für Al. In Blau färbt das Osteoid dunkelblau für Pen AROM.Die hier gelb angefärbte Osteoidsubstanz zeigt humane ASCs, die mit GFP markiert und auf ein Gerüst aufgebracht wurden und nach zwei Wochen entnommen wurden. Die Färbung erfolgte mit einem GFP-markierten Antikörper, um die Beteiligung der humanen Zellen an der Regeneration im Defektbereich darzustellen. Dargestellt ist hier die Immunchemie für humanes nukleäres Antigen, die nach zwei Wochen das Vorkommen humaner Zellen im Defektbereich zeigt.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Aufarbeitung des Fettgewebes innerhalb von vier Stunden erfolgen, und der chirurgische Eingriff dauert etwa 10 Minuten pro Maus. Es ist wichtig zu beachten, dass der Schädelknochen rund ist, während der Bohrer flach ist, weshalb sorgfältig darauf geachtet werden muss, den gesamten Umfang des vier Millimeter großen Defekts zu durchtrennen. Arbeiten Sie langsam, um die Dura mater des Gehirns nicht zu verletzen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Vorläuferzellen aus dem Fettgewebe isoliert. Säen Sie diese Zellen auf ein Gerüst auf und bringen Sie sie in die Maus ein.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu...

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.

Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden.  Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Fettgewebe Stammzellen (ASC) leicht zu isolieren und aus dem Fett von normalen Ratten geerntet. ASC Blätter können mit Handy-Blatt Engineering erstellt werden und können in Zucker Diabetiker fetthaltige Ratten ausstellenden voll-dicke Haut Mängel mit freiliegenden Knochen und dann bedeckt mit einem Bilayer künstlicher Haut transplantiert werden.

Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

Aus Fett gewonnene Stromazellen können nützlich sein, um neues Gewebe aus den eigenen Zellen eines Patienten zu züchten. Wir präsentieren ein Protokoll für die Isolierung einer Subpopulation von humanen Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen (ASCs) mit erhöhtem osteogenem Potenzial, gefolgt von der Anwendung der Zellen in einem in vivo Kalvarienberg-Heilungsassay.

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Blutgefäß Bildung in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit in 3D Gerüste multiphoton Mikroskopie. Angiogenese in gentechnisch veränderten Gerüste wurde in einem murinen calvarial kritische Knochen-defekt-Modell untersucht. Mehr neue Blutgefäße waren in der Behandlungsgruppe als Kontrollen erkannt.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

Die Anzahl der neue Biomaterialien für die Reparatur von großen Knochenläsionen entwickelt wird laufend erweitert, mit dem Ziel zu verbessern, Knochenheilung und Komplikationen im Zusammenhang mit Knochentransplantation überwinden. Hier präsentieren wir Ihnen eine multidisziplinäre Strategie zu Testzwecken vorklinischen Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochen-Reparatur.

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Stromazellen vaskulären Bruchteil aus Fettgewebe durch eine Reihe von mechanischen Verfahren erhalten die Emulgierung und mehrere Centrifugations enthalten.

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Lernen Sie die Isolierung von Stromazellen aus Fettgewebe für die knöcherne Regeneration in einem kritischen Schädeldefektmodell. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung osteogener Differenzierung in vivo.

Reparatur eines Critical-sized Calvaria Defect Modells mit aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen aus Lipoaspirate Geerntet

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