Neural Explantatkulturen aus Xenopus laevis

Ziel dieses Verfahrens ist es, Xenopus Lavis-Wachstumskegel für die anschließende hochauflösende Bildanalyse zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem weiblichen Fröschen zunächst Hormone injiziert werden, um die Eiproduktion zu stimulieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Eizellen zu sammeln und zu befruchten und ihnen dann mRNA oder andere interessante Konstrukte zu injizieren.

Am nächsten Tag werden die Embryonen präpariert und die Neuralrohre isoliert, zerschnitten und auf Deckgläser plattiert. Der letzte Schritt besteht darin, die herauswachsenden Axone und Wachstumskegel abzubilden. Letztendlich kann die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Veränderungen in der Proteinlokalisation in Wachstumskegeln im Laufe der Zeit zu zeigen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, die Neuralrohrdissektionen zu lernen, wenn man einen Methodenabschnitt liest, ohne die Technik aus erster Hand zu beobachten. Entnehmen Sie Eier von weiblichen Fröschen, denen zuvor 12 bis 14 Stunden zuvor 400 Einheiten Choriongonadotropin injiziert wurden. Sammeln Sie die Eier in einer modifizierten Ringerlösung mit X Markierungen.

Düngen Sie dann das gesammelte X in vitro mit Hackfleisch der Hoden wie zuvor beschrieben und fügen Sie nach mindestens 20 Minuten 0,1 XMMR hinzu. Entfernen Sie das Medium und inkubieren Sie die Embryonen in 2%igem Cystein in einem XMMR bei pH 7,8 für drei bis fünf Minuten, um die Geleehülle des Embryos zu entfernen. Gießen Sie dann die Embryonen in ein Becherglas.

Waschen Sie die Embryonen anschließend nach der letzten Wäsche drei- bis fünfmal mit 0,1 XMMR oder 0,1 x modifizierter Badesalzlösung. Bewahren Sie die Embryonen bis zur Injektion oder falls gewünscht bei Raumtemperatur bei 0,1 XMMR auf. Platzieren Sie die Embryonen bei 14 bis 18 Grad Celsius, um die Entwicklung vor der Injektion zu verlangsamen.

Verdünnen Sie die zuvor vorbereitete gedeckelte RNA auf eine Endkonzentration von 50 bis 200 Pikogramm Bananenliter mit doppelt destilliertem Wasser und lagern Sie sie dann bis zur Mikroinjektion auf Eis. Bereiten Sie anschließend die Injektionsnadel vor, indem Sie mit einem Suter-Abzieher oder einem ähnlichen Instrument an einer Bo-Silikat-Kapillare ziehen. Brechen Sie dann unter einem Mikroskop mit einer Pinzette die Nadelspitze in einem Winkel, um eine federähnliche Form zu erzeugen, und füllen Sie die Nadel mit 0,5 bis einem Mikroliter der verdünnten RNA-Lösung auf.

Montieren Sie die Nadel auf dem Mikromanipulator Hier kommt der Injektor PLI 100 PICO eines Medizinsystems zum Einsatz. Legen Sie nun die befruchteten Embryonen im Zellstadium von einem bis vier Zellen in eine Plastikschale mit 5%fol in 0,1 XMMR. Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen für jede neue Mikropipette mit einem Radikal- oder Tischmikrometer.

Stellen Sie dann den Pico-Injektor so ein, dass er bei jeder Injektion die gewünschte Menge an RNA abgibt. Hier wird ein Injektionsvolumen von einem Nanoliter verwendet. Halten Sie die Embryonen mit einer Pinzette oder legen Sie sie auf eine Halteplattform und injizieren Sie das gewünschte Volumen in die Tierblaster.

Verteilen Sie die Injektionen an mehreren Stellen im Embryo, um eine gleichmäßige Verteilung der RNA zu erhalten. Ein bis zwei Injektionen werden in jedem Blaster für einen Embryo im vierzelligen Stadium durchgeführt, während zwei bis vier Injektionen für einen Embryo im zweizelligen Stadium verwendet werden. Nach den Injektionen werden die injizierten Embryonen in eine Plastikschale mit 0,1 XMMR gegeben und bis zum Stadium 20 bis 23 entwickelt.

Je nach gewünschter Entwicklungsgeschwindigkeit werden die Embryonen bei einer Temperatur von 14 bis 22 Grad Celsius inkubiert, PLL-behandelte Kulturschalen mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in PBS überzogen und die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius platziert. Waschen Sie die Platten nach Ablauf der Inkubationszeit dreimal, wobei PBS darauf achtet, dass die lamininbeschichtete Oberfläche nach dem letzten Waschen nicht der Luft ausgesetzt wird. Ersetzen Sie das PBS durch Nährmedien.

Bereiten Sie zum Schluss drei mit Agros überzogene Gerichte zu, indem Sie den Boden einer Kulturschale mit 1 %aros in 0,1 XMMR beschichten und aushärten lassen. Nach dem Aushärten füllen Sie eine Schale mit Steinbergs Medienvariabilität in der Expression der injizierten mRNA kann dazu führen, dass Embryonen vor der Durchführung von Dissektionen ein Mosaik von Fluoreszenz aufweisen. Screenen Sie Embryonen auf das Vorhandensein von Fluoreszenz und identifizieren Sie diejenigen Embryonen, die das fluoreszierende Fusionsprotein im Neuralrohr exprimieren.

Übertragen Sie dann die fluoreszierenden Embryonen im Stadium 20 bis 23 in die mit Agros beschichtete Kunststoffschale, in der sich Steinberg's Media befindet. Stellen Sie die Schale unter ein Präpariermikroskop und entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die Vitellinmembran. Während dann eine Pinzette den Embryo an Ort und Stelle hält, verwenden Sie die zweite, um einen Schnitt an der Seite des Embryos zu machen und das hohle Innere freizulegen.

Als nächstes kneifen Sie mit beiden Pinzetten entlang des Gewebes zwischen der dorsalen und ventralen Hälfte des Embryos, um den Embryo in zwei Hälften zu schneiden und den dorsalen Teil mit dem Neuralrohr zu isolieren. Legen Sie den dorsalen X-Explan in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Milligramm pro Milliliter, Kollagenase in Steinberg-Medium und legen Sie ihn für 15 bis 20 Minuten auf einen Rotator. Übertragen Sie dann den dorsalen Explan in eine mit Agro beschichtete Schale, die mit frischem Steinbergmedium gefüllt ist.

Während Sie unter dem Mikroskop arbeiten, präparieren Sie das Neuralrohr von der dorsalen Epidermis und dem ventralen Noor, indem Sie die Spitze der Pinzette zwischen die Epidermis und das darunterliegende Gewebe schieben und die Epidermis langsam zurückziehen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Gewebe zu halten, und eine andere, um das Gewebe zu entfernen, das das Neuralrohr umgibt. Übertragen Sie anschließend das präparierte Neuralrohr in eine mit Agros beschichtete Schale, die mit frischem Nährmedium gefüllt ist.

Sobald mehrere Neuralrohre gesammelt wurden, schärfst du Wolframnadeln oder Pinzetten, um jedes Rohr in etwa 20 Stücke zu schneiden. Dann die Stücke auf die mit Laminin überzogenen Kulturschalen anrichten und die Auberginen gleichmäßig in Reihen verteilen. Nach dem Plattieren der Neuralrohre sollten die Schalen nicht bewegt werden, da dies die Anheftung der Zellen stört

Inkubieren Sie das plattierte Neuralrohr explan bei 20 bis 22 Grad Celsius. Für die Kultivierung von XUS lavis-Neuronen 12 bis 24 Stunden nach dem Plattieren von Bildneuronen und Wachstumskegeln bei Raumtemperatur ist kein Zellkultur-Inkubator erforderlich. Beachten Sie, dass eine variable Expression der RNA zu einer Reihe von Fluoreszenzniveaus zwischen den Wachstumskegeln führen kann.

Dieses DIC-Bild zeigt Axone und Neuriten, die aus dem X-Explan in der oberen linken Ecke des Gesichtsfeldes herauswachsen. Die Maßstabsleiste in dieser Abbildung und den folgenden Bildern stellt 10 Mikrometer dar. Dieser Film mit höherer Vergrößerung zeigt den Wachstumskegel an der Spitze eines wachsenden Axons.

Schließlich zeigt dieser Fluoreszenzmikroskopie-Film die Expression von EB 1 GFP in einem Wachstumskegel. Während wir hier das Beispiel der Bildgebung anführen, das Plus-Tip-Fusionsprotein EB one GFP. Diese neuronale Explantatmethode kann auf eine beliebige Anzahl von Proteinen angewendet werden, um ihr Verhalten innerhalb des Wachstumskegels während des Neuritenwachstums aufzuklären.