Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zusammensetzung von Zellwandpolymeren über eine breite Palette von Pflanzen oder Gewebetypen hinweg mithilfe von Glykan-Mikroarrays zu vergleichen. Zunächst werden die gewünschten Pflanzengewebe gewonnen. Nach der Homogenisierung werden alkoholunlösliche Rückstände hergestellt.

Anschließend extrahieren Sie die Zellwandglykane nacheinander mithilfe von CDTA und Natriumhydroxid. Danach bringen Sie die Extrakte der Zellwandglykane mit einem Roboter auf einem Mikroarray auf. Beaufschlagen Sie die Mikroarrays mit monoklonalen Antikörpern, die gegen Zellwandglykane gerichtet sind, und quantifizieren Sie die Signale der Flecken auf den Mikroarrays.

Letztendlich können die Ergebnisse verwendet werden, um die relative Häufigkeit von Glykan-Epitopen über einen Probensatz von Interesse hinweg zu bestimmen. Wir entwickelten diese Mikroarray-Methode, als wir erkannten, dass ein globales Abbild des Vorkommens von Zellwandglykanen über mehrere Pflanzengewebetypen hinweg gleichzeitig erforderlich ist, um auch zusammensetzungsmäßige Unterschiede nachweisen zu können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber traditionellen Methoden wie der Monosaccharid-Analyse liegt daher darin, dass es sich um eine mikroarraybasierte Plattform handelt, bei der Hunderte von Proben gleichzeitig untersucht werden können. Dies ist eine schnelle und umfassende Methode zur Profilierung der Zellwandzusammensetzung. Beginnen Sie für jedes Gewebe von Interesse mit jeweils drei Proben à 100 Milligramm Frischgewicht von Pflanzengewebe unter Verwendung von flüssigem Stickstoff.

Homogenisieren Sie die Proben zu einem feinen Pulver und überführen Sie das Homogenat in 10-Milliliter-Kunststoffkonischgefäße, um das Zellwandmaterial vorzubereiten. Resuspendieren Sie das Homogenat in 10 Milliliter 80%igem Ethanol bei Raumtemperatur und wirbeln Sie kräftig zwei Minuten lang. Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.500 × g und entfernen Sie den Überstand.

Wiederholen Sie die Waschungen mit 70 % Ethanol mindestens dreimal oder bis das Überstand klar ist. Führen Sie anschließend eine endgültige Waschung mit 100 % Aceton durch. Sammeln Sie die alkoholunlöslichen Rückstände und lassen Sie sie über Nacht an der Luft trocknen, um ein feines und homogenes Pulver zu erhalten. Sieben Sie die Proben der alkoholunlöslichen Rückstände mit einem Maschensieb von 0,4 Quadratmillimetern.

Als Nächstes wiegen Sie 10 Milligramm der alkoholunlöslichen Rückstandproben in Mikroröhrchen, die jeweils eine drei Millimeter große Glaskugel zur Vermischung enthalten. Für die Extraktion von Pektinen und mit Pektinen assoziierten Polymeren geben Sie 500 Mikroliter 50 Millimolar CDTA zu jeder Probe hinzu, wirbeln die Röhrchen kurz an und vermischen anschließend drei Stunden lang mit dem Gewebemixer bei acht Hertz. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 ×g.

Entfernen Sie vorsichtig die Überstände und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Pellets zweimal mit einem Milliliter entionisiertem Wasser. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit aus den Röhrchen aus dem verbleibenden Zellwandpellet.

Führen Sie die Extraktion von vernetzenden Glykanen mit 500 Mikrolitern viermolarem Natriumhydroxid mit 0,1 % Natriumhydrid durch. Speichern Sie die Überstände, die vernetzende Glykane enthalten, mithilfe des zuvor beschriebenen Extraktionsverfahrens bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Pellets zweimal mit entionisiertem Wasser.

Verwenden Sie anschließend 500 Mikroliter Cain, um restliche Polymere wie Cellulose abzuzentrifugieren, und gewinnen Sie die Überstände, die extrahierte Zellwandpolymere enthalten, um jegliche Partikel zu entfernen. Geben Sie dann je 50 Mikroliter jeder Probe in eine Polypropylen-Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen, und verwenden Sie ein vordefiniertes, benutzerdefiniertes Layout, bei dem die Proben entsprechend dem Gewebetyp und dem Extraktionstyp angeordnet sind.

Als Nächstes verdünnen Sie die Proben der Zellwandpolymere mit entionisiertem Wasser, um eine 0,5- und eine 25-fache serielle Verdünnung herzustellen. Legen Sie Parameter wie Pin-Höhe, Sammelzeit und Verweilzeit sowie Spülschritte für das Microarray fest. Steuern Sie die Luftfeuchtigkeit der Druckkammer auf 60 %, um eine Verdunstung der Proben zu verhindern.

Beginnen Sie nun den Druckvorgang. Der Roboter verwendet Kapillarkanülen, um Lösungen von der Probenplatte auf eine Nitrocellulose-Membran aufzutragen, die an einer flachen Platte in der Maschine befestigt ist. Jeder Fleck auf dem Array enthält 15 Nanoliter Lösung und wird in dreifacher Ausführung gedruckt.

Drucken Sie identische Mikroarrays nebeneinander auf die Membran und schneiden Sie sie in einzelne Arrays. Um die unspezifische Bindung zu verringern, blockieren Sie jeden Mikroarray zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer 5 %igen Magermilchpulverlösung.

Fügen Sie die monoklonalen Antikörper hinzu, die spezifisch für Zellwandglykane und Epitope sind, und inkubieren Sie zwei Stunden lang. Spülen Sie die Mikroarrays anschließend dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS, um unspezifische Bindungen zu entfernen. Danach bebrüten Sie die Mikroarrays nach drei fünfundzwanzigminütigen PBS-Spülgängen zwei Stunden lang mit einem sekundären Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist.

Entwickeln Sie die Mikroarrays mithilfe chromogener oder chemilumineszenter Substrate. Scannen Sie die einzelnen Mikroarrays mit einem hochauflösenden Desktop-Scanner. Speichern Sie die Bilder als negative 16-Bit-TIFF-Dateien.

Berechnen Sie die integrale Intensität jedes Flecks mithilfe einer Bildverarbeitungssoftware mit automatischem Rasterwerkzeug. Anschließend exportieren Sie die Rasterdaten jedes Microarrays als Textdatei. Importieren Sie die Datendatei manuell in eine Excel-Tabelle zur Analyse.

Mitteln Sie die integrale Fleckintensität über Druckreplikate und Verdünnungen, um einen mittleren Fleckintensitätswert für jede Probe zu erhalten. Stellen Sie die relativen mittleren Fleckintensitäten zwischen verschiedenen Proben als Wärmekarte dar, indem Sie die bedingte Formatierung in Excel oder einen Online-Heatmapper verwenden. Werkzeuge, um Hintergrundsignal und falsch positive Ergebnisse für jeden Antikörpertyp zu entfernen, die Daten auf 100 zu korrigieren und einen 5%-Cutoff-Wert anzulegen.

Das umfassende Mikroarray-Polymer-Profiling wurde verwendet, um die relative Häufigkeit von Glykanen in sechs Gewebetypen zu messen: Antherenfilamente, Pollen, Ovarien, Blütenblätter, Griffel und Narbe von Nicotiana. Bei einer Vielzahl von Blüten wurde das Mikroarray mit dem monoklonalen Antikörper JIM5 probed, der spezifisch für ein Epitop auf pektischen Polysacchariden ist. Beachten Sie, dass das JIM5-Epitop in CDTA-Extrakten aller Blütengewebe nachgewiesen wird.

Dabei ist es jedoch im Pollen am höchsten und im Griffelgewebe am niedrigsten. Interessanterweise wird das JIM-fünf-Epitop ebenfalls in den Natriumhydroxid-Extrakten von Pollen, jedoch nicht in denen anderer Gewebe nachgewiesen. Quantitative Informationen werden durch Erstellung von Standardkurven der verschiedenen gereinigten Polysaccharide gewonnen, die als interne Standards auf dem Mikroarray in Eierstockgewebe verarbeitet wurden.

Proben enthielten etwa 157 Mikrogramm Hoog mit dem JIM-fünf-Epitop, was etwa 1,5 % der gesamten Zellwandrückstände entspricht, während in Pollengewebe 625 Mikrogramm Hoog Ronin mit dem JIM-fünf-Epitop vorhanden waren, was etwa 6,25 % der gesamten Zellwandrückstände entspricht. Die relative Häufigkeit von 15 Glykan-Epitopen in allen Gewebetypen ist als Wärmekarte zusammengefasst. Die Farbintensität der Balken entspricht der angepassten mittleren Spotintensität jeder Probe.

Eine grafische Darstellung dieser Daten ermöglicht eine schnelle Interpretation der Unterschiede im Vorkommen von Glycan-Epitopen zwischen den verschiedenen Blütenorganen. Diese Ergebnisse zeigen, dass einzelne Glycan-Epitope charakteristisch verteilt sind zwischen verschiedenen Blütentypen. Beispielsweise tritt das LM 13-Epitop in antheren Filamenten und SE L-Geweben im Vergleich zu anderen Geweben am häufigsten auf.

Dieses Muster steht im auffallenden Gegensatz zu dem kürzerer Ketten-Epitope, die bevorzugt durch den MAB LM6 nachgewiesen werden. Vernetzte Glykane weisen in vielen Blüten ebenfalls unterschiedliche Vorkommensmuster auf. Beispielsweise ist das LM10-Epitop im Stigmat-Gewebe im Vergleich zu anderen Geweben reichlich vorhanden, fehlt jedoch im Eierstockgewebe.

Die LM15-Xyloglucan-Epitope sind im Vergleich zu anderen Geweben am stärksten in Blütenblättern und Staubfadenantheren vertreten, während Heteromannane am stärksten in anthrophen Filamenten vorkommen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glykane der Zellwand aus einer breiten Palette von Pflanzen und Gewebetypen extrahiert und deren relative Häufigkeit bestimmt. Wenn man Mikroarrays einmal beherrscht, kann diese Technik innerhalb von drei Tagen abgeschlossen werden.

Es ist wichtig, daran zu denken, Proben und Replikate in jedem Schritt nach diesem Verfahren einheitlich zu behandeln. Andere Methoden wie Essigsäure-Salpetersäure-Assays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu untersuchen. Zum Beispiel: Wie hoch ist der absolute Cellulosegehalt, der nach der sequenziellen Extraktion von Pektinen und Hemicellulosen mittels CDTA und Natriumhydroxid verbleibt?

Diese Technik ist im Bereich der Pflanzenzellenbiologie weit anwendbar, um schnell das Vorkommen von Glykanen in Modellpflanzen wie Arabidopsis und Fisca, Nutella sowie anderen Pflanzen wie Baumwolle, Weizen, Eukalyptus und Tabak zu vergleichen.