Name: Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung von Pflanzenzellwand-Glykanen mit der CoMPP-Methode. Diese Technik kombiniert monoklonale Antikörper mit Mikroarray-Plattformen für die hochdurchsatzfähige Analyse verschiedener Pflanzenarten und Gewebetypen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

IEM möchte den dänischen Research Council (FTP und FNU) für die Finanzierung zu bestätigen. ERL erkennt die Unterstützung eines ARC DP gewähren. AB erkennt die Unterstützung des ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls Zuschuss.

Ein. Tissue Collection &amp; Vorbereitung <ol><li> Sammeln Sie 100 mg Frischgewicht Pflanzengewebe (ein Minimum von 10 mg Trockengewicht) in mindestens dreifacher Ausfertigung für jedes Gewebe von Interesse. Die folgenden Schritte beschreiben die Herstellung der Zellwand Material aus vegetativen Geweben. Im Falle der Lagerung Gewebe wird un-wanted Stärke enzymatisch, bevor mit der Extraktion von Zellwandpolymere wie zuvor beschrieben 13 entfernt. </li><li> Homogenisierung der Proben zu einem feinen Pulver mit flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Qiagen TissueLyser II, mit 24 Rohradapter Sets und 3 mm Wolframcarbid Kügelchen (30 Hz, 2 x 30 Sekunden). Alternativ, wenn nur wenige Proben verarbeitet werden, ist ein Mörser und Stößel genutzt. </li><li> Übertragen Sie die Homogenate in 10 ml Kunststoff-konische Röhrchen. </li><li> Planen Zellwandmaterial durch Waschen der Homogenate in 10 ml 80% v / v Ethanol bei RT und Vortexen kräftig für 2 min. </li><li> Zentrifuge Proben bei 3.500 xg und Überstand verwerfen. Wiederholen der 70% Ethanol wäscht mindestens dreimal oder bis der Überstand klar ist, insbesondere für Gewebe enthalten Chlorophyll. </li><li> Führen Sie eine letzte Wäsche mit 100% Aceton und lassen Sie die Pellets mit Alkohol unlöslichen Rückständen (AIR) an der Luft trocknen über Nacht. </li><li> Die Luftproben Sieb mit einer Maschenweite 0,4 mm 2, um ein feines, homogenes Pulver zu erreichen und zu entfernen größeren, schlecht gemahlenen Partikel, die irgendwann verbleiben im Homogenat. </li><li> 10 mg wiegen AIR Probe in Mikroröhrchen auf, jeweils mit einem 3 mm Glasperlen, um das Mischen der Proben zu erleichtern. </li></ol> 2. Extraktion von Zellwand Glykane <ol><li> Pektinen, und Polymere mit Pektine zugeordnet sind, aus den Proben durch Zugabe von 500 ul 50 uM CDTA (pH 7,5) zu jeder Probe extrahiert. </li><li> Vortexen die Rohre zu gewährleisten, ist das Lösungsmittel in Kontakt mit dem Probenmaterial und dann Mischen mit der TissueLyser 3 h bei 8 Hz. </li><li> Zentrifuge Proben bei 12.000 xg, sorgfältig reMove der Überstände und bei 4 ° C. </li><li> Waschen Pellets in 1 ml deionisiertem Wasser zu verdünnen und entfernen Sie alle verbleibenden Lösungsmittel, Wirbel und Zentrifuge bei 13.000 x g. Wiederholen Sie diesen Schritt, ohne das Pellet und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit aus den Rohren, bevor Sie den nächsten Schritt. </li><li> Vernetzen Glycane werden sequentiell von der verbleibenden Zellwand Pellet mit 500 ul 4 M NaOH extrahiert mit 0,1% w / v NaBH4, nach dem gleichen Verfahren in den Schritten 2.1 beschrieben - 2,4 für die Extraktion CDTA. NaBH 4 zugegeben, um den Aldehyd (oder Keto)-Gruppe am reduzierenden Ende der Polysaccharide zu einer Alkohol wodurch Basis Schälen von Polysacchariden zu reduzieren. </li><li> Nach Zentrifugation werden Überstände wieder entfernt, gelagert bei 4 ° C, und die Pellets zweimal in deionisiertem Wasser, bevor zum nächsten Extraktion. </li><li> Als optionaler Schritt werden restliche Polymere wie Cellulose mit 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diamin extrahiertennoethane mit 0,78 M CdO) nach dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 2.1 beschrieben - 2.4. Alternativ können absolute Zellulose Inhalt verbleibenden Pellets ermittelt Acetic / Nitric Assays (siehe Diskussion) werden. </li></ol> 3. Printing Microarrays <ol><li> Centrifuge Überstände, die Zellwandpolymere bei 13.000 xg gewonnen, um Partikel zu entfernen. </li><li> Legen Sie 50 ul jeder Probe in ein Polypropylen-384-Well Mikrotiterplatten mit einem pre-designed benutzerdefinierte Layout, wo Proben nach Gewebetyp und Extraktionstyp angeordnet sind. </li><li> Verdünnen Sie die Zellwandpolymer Probe in einer 0, 5 und 25 × seriellen Verdünnungsreihe mit destilliertem Wasser. </li><li> Parameter wie Pin Höhe, Erhebung und Verweilzeit und Waschschritte sind auf der Software-Steuerung des Microarrayer gesetzt. </li><li> Die Feuchtigkeit der Druckkammer wird mit 60% gesteuert wird, um Verdunstung zu verhindern Probe. </li><li> Der Druckauftrag wird gestartet mit LabNEXT software und ein Programm, das auf dem Mikroarray Layout entspricht. </li><li> Der Roboter verwendet Kapillarkanal Stifte, um Lösungen aus der Probe Platte auf 20 x 20 cm Nitrozellulosemembran, die zu einer flachen Platte in der Maschine befestigt ist gedruckt. Jeder Punkt auf dem Array enthält 15 nl einer Lösung und ist in dreifacher Ausfertigung gedruckt. </li><li> Identische Microarrays werden nebeneinander auf der Membran und Schnitt in einzelnen Arrays gedruckt, nachdem der Druckauftrag abgeschlossen ist. </li><li> In jedem Versuch die Arrays können modifiziert werden, um mehr oder weniger Proben, Verdünnungen oder repliziert unterzubringen. </li></ol> 4. Sondierung Glycan Microarrays <ol><li> Nach dem Drucken, blockieren die einzelnen Mikroarrays in 5% w / v Magermilchpulver in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (MPBS) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. </li><li> Sonde Mikroarrays mit monoklonalen Antikörpern, die für Zellwand-Glykan Epitope für 2 Stunden in MPBS. Die Mehrzahl der monoklonalen antibOdies gegen Zellwand Glycane sind kommerziell von drei Unternehmen; Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ), Carbosource Services ( <a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a> ) und PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ). </li><li> Einschließen Negativkontrolle, ein Mikroarray mit nur MPBS und keine primären Antikörper inkubiert. </li><li> Waschen der Mikroarrays 3mal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 min auf unspezifische Bindung zu entfernen. </li><li> Sonde der Mikroarrays mit sekundärem Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase (HRP) in MPBS für 2 Stunden. Die meisten monoklonalen Antikörper gegen Zellwand Glykane erfordern anti-Maus oder anti-Ratte Sekundärantikörper. </li><li> Wiederholen Waschschritte 3 mal mit PBS-Puffer für 5 min auf unspezifische Bindung zu entfernen. </li><li> Entwickeln Sie die Microarrays mit chromogenen (3,3-Diaminobenzidin) oder chemiluminecent (Luminol) Substraten. </li></ol> 5. Quantifizierung <ol><li> Nach der Entwicklung, scannen die einzelnen Mikroarrays mit einem hochauflösenden (1.200 dpi) Desktop-Scanner und speichern Sie die Bilder als negativ, 16-Bit-TIFF-Dateien (Abbildung 3). </li><li> Berechnen Sie die integrale Intensität jedes Spots mit Xplore Image Processing Software (LabNEXT) mit einem automatisierten Raster-Werkzeug ausgestattet. Das Integral Spotintensität wird aus der Summe der Pixel in der Umgebung jeder Rasterfläche Spot stammt. </li><li> Die Grid-Daten für jeden Mikroarray als txt-Datei exportiert und kann manuell in eine Excel-Tabelle zur Analyse importiert werden. Eine Online-Werkzeug ( <a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/</a> ) wurde entwickelt, um automatisch zu übersetzen und verarbeiten Daten einzelner txt Dateien. </li><li> Der integrierte Spotintensität wird über Druck repliziert gemittelt und Verdünnungen, eine &quot;Kassamittelkurs erhaltenIntensität &quot;Wert für jede Probe (Abbildung 2). Alternativ werden spot Signale entsprechend nur einem Verdünnungswert auf dem Array verwendet werden, um die relative Abundanz Glycan Epitop für jede Probe zu quantifizieren. </li><li> Die relative mittlere Spotintensitäten zwischen verschiedenen Proben werden als Heatmap (Abbildung 4) mithilfe der bedingten Formatierung in Excel oder online HeatMapper Werkzeuge (präsentiert <a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm</a> ). Die Daten für jeden Antikörperart wird auf 100 korrigiert und eine 5% Cutoff-Wert enthalten sind die Hintergrundsignals und Fehlalarme zu entfernen. </li></ol>

<ol><li>Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+models+of+primary+cell+walls+in+flowering+plants%3A+consistency+of+molecular+structure+with+the+physical+properties+of+the+walls+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth.</a> Plant J. 3, 1-30 (1993).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofuels.</a> Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).</li>
<li>Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+degree+and+pattern+of+methyl-esterification+of+pectic+homogalacturonan+in+plant+cell+walls.+implications+for+pectin+methyl+esterase+action%2C+matrix+properties%2C+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion.</a> J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).</li>
<li>Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+walls%3A+the+skeleton+of+the+plant+world%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cell walls: the skeleton of the plant world.</a> Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).</li>
<li>Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+plant+cell+wall%3A+searching+for+the+genes+that+define+structure%2C+architecture+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics.</a> Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).</li>
<li>Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+family+of+Arabidopsis+genes+related+to+xyloglucan+fucosyltransferase1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1.</a> Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).</li>
<li>Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant cell walls.</a> Science. 306, 2206-2211 (2004).</li>
<li>Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillats%2C+WGT+%22The+Plant+Cell+Wall%22">The Plant Cell Wall</a>. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).</li>
<li>Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies.</a> Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).</li>
<li>Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+cell-wall+polymers+within+and+between+plants+using+novel+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays.</a> The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+characterization+of+plant+cell+walls+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).</li>
<li>Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+plant+cell-wall+polysaccharide+decomposition+in+leaf-cutting+ant+fungus+gardens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens.</a> PLoS One. 6 (3), e17506(2011).</li>
<li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+procedures+for+the+determination+of+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. , In Press (2012).</li>
<li>Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+methyl+hexagalacturonate+hapten+inhibitors+of+anti-homogalacturonan+monoclonal+antibodies+LM7%2C+JIM5+and+JIM7%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7.</a> Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).</li>
<li>Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+complexity+of+arabinan+polysaccharides+and+their+processing+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls.</a> Plant J. 59, 413-425 (2009).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNIT+12.10+Preparation+and+Analysis+of+Glycan+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2011).</li>
<li>McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+plant+cell+walls+by+microbial+xylan-specific+carbohydrate-binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules.</a> PNAS. 103, 4765-4770 (2006).</li>
<li>Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eli1+mutation+reveals+a+link+between+cell+expansion+and+secondary+cell+wall+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 127, 3395-3405 (2000).</li>
<li>Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-Function+Mutation+of+REDUCED+WALL+ACETYLATION2+in+Arabidopsis+Leads+to+Reduced+Cell+Wall+Acetylation+and+Increased+Resistance+to+Botrytis+cinerea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea.</a> Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).</li>
<li>Updegraff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).</li>
<li>21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+monoclonal+antibodies+against+plant+cell+wall+glycans+by+hierarchial+clustering+of+their+carbohydrate+microarray+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles.</a> Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+linkage+%281%E2%86%923%29%2C%281%E2%86%924%29-%CE%B2-D-glucan+is+not+unique+to+the+Poales+and+is+an+abundant+component+of+Equisetum+arvense+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls.</a> Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).</li>
<li>Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cell+wall+polymers+during+antheridium+development+and+spermatogenesis+in+the+Charophycean+green+alga%2C+Chara%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara.</a> 2104, 1045-1056 (2009).</li>
<li>Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+outer+layer+of+the+primary+cell+wall+joins+elongating+cotton+fibers+into+tissue-like+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles.</a> Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).</li>
<li>Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+Erwinia+chrysanthemi+pectin+methylesterase+variants+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays.</a> Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Kompp ist eine schnelle und sensitive Methode zur Profilierung der Glycan Zusammensetzung von Hunderten pflanzlichen Proben in einer Angelegenheit von Tagen. Diese Methode ergänzt die bereits vorhandenen bakteriellen oder Säugetier-Glykan Array-Plattformen für das Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-Wechselwirkungen mit Glycan-bindende Proteine ​​wie Lektine, Rezeptoren, Antikörper und 16. Mit einer großen Vielfalt von Sonden zur Erkennung von Zellwand Glykane, ist es möglich, detaillierte Informationen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 3 mm Hartmetall Perlen </td><td> Qiagen </td><td> 69997 </td><td></td></tr><tr><td> Sammlung Mikroröhrchen (1,2 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 19560 </td><td> 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen können ebenfalls verwendet werden </td></tr><tr><td> Qiagen TissueLyser II </td><td> Qiagen </td><td> 85300 </td><td></td></tr><tr><td> 3 mm Glaskugeln </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z143928 </td><td></td></tr><tr><td> CDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 34588 </td><td></td></tr><tr><td> Cadmiumoxid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 202894 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Diaminoethan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 03550 </td><td></td></<html> tr&gt; <tr><td> Nitrozellulosemembran (0,22 um Porengröße) </td><td> GE-Water &amp; Process Technologies </td><td> EP2HY00010 </td><td> unterschiedlichen Porengröße Membranen sind für verschiedene Pin-Typen geeignet </td></tr><tr><td> Xact II Microarrayer Roboter </td><td> Labnext </td><td> 001A </td><td> die Xact II Roboter wurde mit einem benutzerdefinierten 20 x 20 cm Keramikplatte auf die die Nitrozellulosemembran gebunden ist eingepasst </td></tr><tr><td> Xtend RM Microarray Stifte </td><td> Labnext </td><td> 0037-350 </td><td> Pins müssen für das Auffinden von Membranen geeignet </td></tr><tr><td> 384-Well-Mikrotiterplatten (Polypropylen) </td><td> Greiner </td><td> 781207 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Glycan monoklonalen Antikörpern </td><td> Pflanzen Probes / CarboSource / Biosupplies </td><td></td><td> Websites; PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ), Carbosource (ww.carbosource.net &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.carbosource.net) und Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ). </td></tr><tr><td> Anti-Ratten-IgG (ganze Molekül) - Peroxidase-Antikörper in Ziegen hergestellt. </td><td> Sigma </td><td> A9037 </td><td> die Art der Sekundärantikörper hängt von der primären Antikörper verwendet (z. B. in Ratten-, Mäuse, Ziegen usw. erhöht). </td></tr><tr><td> SIGMA FAST 3,3 &#39;-Diaminobenzidin Tabletten </td><td> Sigma </td><td> D4293 </td><td> die Art des Entwicklungsreagens hängt von den sekundären Antikörper verwendet und das Nachweisverfahren (farbmetrischen oder chemiluminecent). </td></tr><tr><td> SuperSignal West Pico Chemilumineszenz Substrat </td><td> Thermoscientific </td><td> 34080 </td><td> siehe oben </td></tr><tr><td> Xplore Image Processing Software </td><td> LabNext </td><td> 008 </td><td> viele Software mit automatischer Gridding Werkzeuge stehen zur Verfügungum Pixelwert von Microarray-Spots zu messen. </td></tr><tr><td> Pflanzliche Polysaccharide </td><td> Sigma / Megazyme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

glycan profiling of plant cell wall polymers mit microarrays

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Pflanzliche Zellwände sind komplexe Matrizen von heterogenen Glykane, die eine wichtige Rolle in der Physiologie und Entwicklung von Pflanzen spielen und die Rohstoffe für menschliche Gesellschaften (zB Holz, Papier, Textil-und Biokraftstoff-Industrie) 1,2. Das Verständnis der Biosynthese und Funktion dieser Komponenten bleibt eine Herausforderung. Zellwand Glycane sind chemisch und konformativ vielfältigen aufgrund der Komplexität ihrer Bausteine, die Glycosylreste. Diese Form Bindungen an mehreren Positionen unterscheiden sich in Ringstruktur, isomerer oder anomeren Konfiguration, und darüber hinaus werden mit einer Anordnung von nicht-substituierten Zuckerreste. Glycan Zusammensetzung variiert in verschiedenen Zell-und / oder Gewebetypen oder sogar Sub-Domänen eines einzelnen Zellwand 3. Außerdem ist deren Zusammensetzung auch während der Entwicklung ein, oder in Reaktion auf Umweltreize 4 modifiziert. In exProzess von 2.000 Gene Pflanzliche Zellwände sind komplexe Matrizen von heterogenen Glykane wird vorausgesagt, dass in der Zellwand Glykan Biosynthese und Modifikation in Arabidopsis 5 einbezogen werden. Jedoch haben relativ wenige der biosynthetischen Gene funktionell charakterisiert 4,5. Reversen Genetik Ansätze sind schwierig, da die Gene oft differentiell exprimiert werden, oft in geringen Konzentrationen, zwischen Zelltypen 6. Außerdem sind mutierte Studien oft durch Gen-Redundanz oder kompensatorische Mechanismen behindert zur Gewährleistung einer angemessenen Zellwand Funktion 7 wird beibehalten. So neuartige Ansätze sind nötig, um schnell prägen die vielfältige Palette von Glykanstrukturen und funktionelle Genomik Ansätze zum Verständnis der Zellwandbiosynthese und Modifikation zu erleichtern. Monoklonale Antikörper (mAbs) 8,9 haben als ein wichtiges Instrument zur Bestimmung Glykan Struktur und Verteilung in Pflanzen entstanden. Diese erkennen distINCT Epitope in die Hauptklassen der pflanzlichen Zellwand Glykane, darunter Pektine, Xyloglucanen, Xylane, Mannane, Glucane und Arabinogalactane. Kürzlich ist ihre Verwendung im großen Maßstab Screening-Experimenten wurde erweitert, um die relative Häufigkeit von Glykanen in einer breiten Palette von Pflanzen-und Gewebetypen gleichzeitig 9,10,11 bestimmen. Hier präsentieren wir eine Microarray-basierte Glykan Screening-Methode aufgerufen Umfassende Microarray Polymer Profiling (Kompp) (Abbildungen 1 und 2) 10,11, die mehrere Proben ermöglicht (100 Sek.) gescreent unter Verwendung einer miniaturisierten Microarray-Plattform mit reduzierter Reagenz-und Probenmengen werden. Die Spot-Signale auf dem Mikroarray kann formal quantifiziert werden, um semi-quantitative Daten über Glykan Epitop Auftreten zu geben. Dieser Ansatz wird auch zur Verfolgung Glykan Veränderungen in komplexen biologischen Systemen 12 und bietet einen umfassenden Überblick der Zellwand Zusammensetzung geeignet vor allem, wenn Vorkenntnisse of ist nicht verfügbar.

Die relative Häufigkeit von Glykanen in sechs Gewebetypen (Anthere Filamente, Pollen, Ovarien, Petalen, Sepalen und Stigmatisierung) von Nicotiana alata Blüten wurde mit Kompp. 3A zeigt eine repräsentative Mikroarrays mit mAb JIM5 spezifisch für teilweise (niedrig) methylesterified Homogalacturonan (HG), ein Epitop, das auf pektischen Polysacchariden 14 auftritt wurde sondiert. Die JIM5 Epitop in CDTA Extrakten aller Blütengeweben detektiert jedoch ist am höchsten in Pollen und niedrigsten in stigmat...

Eine Technik namens<strong&gt; C</strong&gt; Mfassende<strong&gt; M</strong&gt; Icroarray<strong&gt; P</strong&gt; Olymer Profiling (Kompp) zur Charakterisierung von Pflanzenzellwand Glycane beschrieben. Dieses Verfahren kombiniert die Spezifität von monoklonalen Antikörpern, die auf definierte Glycan-Epitope mit einer Miniatur-Mikroarray analytische Plattform ermöglicht Screening Glycan Auftretens in einem breiten Bereich von biologischen Zusammenhänge.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Pflanzenzellwände sind komplexe Matrizen aus heterogenen Glykanen, die eine wichtige Rolle in der Physiologie und Entwicklung von Pflanzen spielen und die ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zusammensetzung von Zellwandpolymeren über eine breite Palette von Pflanzen oder Gewebetypen hinweg mithilfe von Glykan-Mikroarrays zu vergleichen. Zunächst werden die gewünschten Pflanzengewebe gewonnen. Nach der Homogenisierung werden alkoholunlösliche Rückstände hergestellt.Anschließend extrahieren Sie die Zellwandglykane nacheinander mithilfe von CDTA und Natriumhydroxid. Danach bringen Sie die Extrakte der Zellwandglykane mit einem Roboter auf einem Mikroarray auf. Beaufschlagen Sie die Mikroarrays mit monoklonalen Antikörpern, die gegen Zellwandglykane gerichtet sind, und quantifizieren Sie die Signale der Flecken auf den Mikroarrays.Letztendlich können die Ergebnisse verwendet werden, um die relative Häufigkeit von Glykan-Epitopen über einen Probensatz von Interesse hinweg zu bestimmen. Wir entwickelten diese Mikroarray-Methode, als wir erkannten, dass ein globales Abbild des Vorkommens von Zellwandglykanen über mehrere Pflanzengewebetypen hinweg gleichzeitig erforderlich ist, um auch zusammensetzungsmäßige Unterschiede nachweisen zu können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber traditionellen Methoden wie der M

glycan-profiling-of-plant-cell-wall-polymers-using-microarrays

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Wand abgeleitet Kohlenhydrate.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

Eine schnelle Art und Weise beschrieben, Einblicke in die Struktur der Polysaccharide in einer extrazellulären Matrix zu gewinnen. Die Methode nutzt die Spezifität von Glykosylhydrolasen und die Empfindlichkeit der Massenspektrometrie ermöglicht winzige Mengen von Materialien analysiert werden. Diese Technik ist anpassungsfähig, um direkt auf das Gewebe selbst verwendet werden.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

Kristalline Cellulose ist ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Zellwand. Die Quantifizierung mit zellulärer Auflösung ist jedoch eine technische Herausforderung.  Hier berichten wir über den Einsatz von Polarisationslichttechnologie und Wurzelquerschnitten, um Informationen über die Zusammensetzung der Zellwände mit raumzeitlicher Auflösung zu erhalten.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken, die für die strukturelle Charakterisierung von Glykosylsequenz(en) im reduzierenden Endbereich (RE) und Glykosylsequenz(en) im internen Bereich von Heteroxylanen verwendet werden, indem das RE vor der enzymatischen Hydrolyse (Endoxylanase) mit 2 Aminobenzamid markiert und dann die resultierenden Oligosaccharide mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanz (NMR)  analysiert werden.

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Ein Protokoll für die Strukturanalyse von Polysacchariden durch Gelelektrophorese (PACE), mit Mannan als Beispiel, wird beschrieben.

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode für die Aufbereitung und Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus).

Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H+

Ein Protokoll für die Probenvorbereitung 13C,15N-Label Pilz und Pflanze für multidimensionale Festkörper-NMR-Spektroskopie und dynamische atomare Polarisation (DNP) Untersuchungen wird vorgestellt.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie das Pflanzenmaterial für die Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen fixiert, in ein hydrophiles Acrylharz eingebettet, geschnitten und auf Glasrutschen montiert ist. Wir zeigen, dass zellwandbezogene Epitope mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden.

Fluoreszierende Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in der Zellwand von Pflanzengeweben

Das Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) ist eine Hochdurchsatztechnik für die Analyse der Zusammensetzung von Glykanen in biologischen Proben.

Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) für die Hochdurchsatz-Glykananalyse

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Erfahren Sie die Charakterisierung von Pflanzenzellwand-Glykanen mit der CoMPP-Methode. Diese Technik kombiniert monoklonale Antikörper mit Mikroarray-Plattformen für die hochdurchsatzfähige Analyse verschiedener Pflanzenarten und Gewebetypen.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Weitere Videos entdecken