Ein Assay zur Durchlässigkeit des Zebrafisch-Embryos Neuroepithel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Quantifizierung der Durchlässigkeit des Zebrafisches, des embryonalen Epithels und des Neuroepithels. Dies wird erreicht, indem zunächst ein 70 Kilodalton Fitzy Dextran in die Hirnventrikel injiziert wird. Als nächstes wird ein Zeitverlauf von Hellfeld- und Fluoreszenzbildern aufgenommen.

Dann wird der Abstand des Fluoreszenzstempels vom Scharnierpunkt des Vorderhirns zu jedem Zeitpunkt gemessen. Schließlich wird die im Laufe der Zeit zurückgelegte Strecke berechnet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen der neuroepithelialen Permeabilität durch den Vergleich verschiedener genetischer Hintergründe oder Umweltbedingungen zeigen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Permeabilität im embryonalen Neuroepithel des Zebrafisches zu quantifizieren. Um eine zuvor vorbereitete Injektionsnadel mit Fluoreszenzfarbstoff für die Injektion vorzubereiten, montieren Sie die Nadel auf den Manipulator und die Mikroinjektionsvorrichtung. Brechen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig mit einer Pinzette auf eine Breite von etwa zwei Mikrometern.

Messen Sie die Tropfengröße in Öl und passen Sie die Injektionszeit und den Druck so an, dass jede Injektion einen Nanoliter liefert. Zur Vorbereitung der Embryonen beschichten Sie zwei Schalen mit 1 % Agros in Wasser für jede Bedingung und stechen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze Löcher in die Agros und entfernen Sie die Stopfen. Füllen Sie die Schalen unter einem Stereomikroskop mit Embryomedium. Verwenden Sie eine Pinzette, um Embryonen zu chlorieren, die 18 Stunden nach der Befruchtung oder älter sind.

Dann werden die Embryonen in eine der mit Agros beschichteten Schalen übertragen, um die Embryonen zu betäuben. Gib Trica in die Schale und warte, bis sich die Embryonen nicht mehr bewegen. Richten Sie die Embryonen so aus, dass sie auf ihre dorsale Seite schauen, indem Sie den Schwanz des Embryos in das Loch stecken.

Wenn sich Ihr Mikromanipulator auf der rechten Seite befindet, bewegen Sie den Embryo so, dass sich das Vorderhirn links und das Hinterhirn rechts befindet. Positionieren Sie die Nadel an der breitesten Stelle der Hinterhirnkammer. Als nächstes stechen Sie vorsichtig in die Dachplatte des Hinterhirns im Ventrikel und achten Sie darauf, nicht durch die Tiefe des Gehirns in das Eigelb zu gelangen.

Injizieren Sie dann ein bis zwei Nanoliter Fluoreszenzfarbstoff in die Ventrikel und stellen Sie sicher, dass der Farbstoff die gesamte Länge des Gehirns ausfüllt. Kammern. Übertragen Sie die Embryonen in die zweite Agroschale, die mit Embryo und Medium gefüllt ist, und betäuben Sie sie erneut. Wechseln Sie sofort zur Bildgebung, um Zeit zu gewinnen.

Null Bilder, um die Embryonen abzubilden. Richten Sie sie wie zuvor mit dem Schwanz im Loch unter einem Präpariermikroskop aus, das sowohl Durchlicht als auch Fluoreszenzlicht hat. Nehmen Sie ein Dorsalbild mit hellem Feld auf.

Halten Sie eine konstante Vergrößerung zwischen den Embryonen aufrecht, um einen direkten Vergleich zu ermöglichen, ohne das Embryomikroskop oder die Schale zu bewegen. Nehmen Sie ein entsprechendes Fluoreszenzbild auf und wiederholen Sie dies für jeden Embryo und jeden gewünschten Zeitpunkt. Um die Farbstoffbewegung zu quantifizieren, verwenden Sie Photoshop, um die Hellfeld- und Fluoreszenzbilder zusammenzuführen.

Um dann die Entfernung zu messen, um die sich die Farbstofffront bewegt, verwenden Sie Bild J, um die Merge-Datei zu öffnen, und verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie vom Scharnierpunkt des Vorderhirns zur Stanzfront in einem Winkel von 10 bis 20 Grad vom Neuroepithel zu zeichnen, wählen Sie das Messwerkzeug aus, um die Länge der Linie zu berechnen. Berechnen Sie abschließend die Nettoentfernung. Die D-Front bewegte sich über die Zeit, indem sie die Entfernung zum Zeitpunkt Null von anderen Zeitpunkten subtrahierte.

Zeichnen Sie die Bewegungen in einem dargestellten Diagramm auf. Hier ist ein Beispiel für die Ergebnisse der neuroepithelialen Permeabilität mit Wildtyp-Embryonen. Die hier gezeigten zusammengefügten Hellfeldbilder wurden 22 bzw. 24 Stunden nach der Befruchtung aufgenommen.

Die weiße Linie zeigt den Abstand der D-Front vom Vorderhirnventrikel an. Das Diagramm zeigt hypothetische Permeabilitätsdaten von Proben, die zeigen, dass es möglich ist, eine Erhöhung der Permeabilität in Grün oder eine Abnahme der Permeabilität in Rot im Vergleich zu Kontrollembryonen in Blau zu bestimmen. Um die Permeabilität genau zu differenzieren, ist es sinnvoll, Farbstoffe mit unterschiedlichen Molekulargewichten zu testen, um eine Größe zu identifizieren, die in Wildtyp- oder Kontrollembryonen nur leicht undicht ist.

Dies ermöglicht die Identifizierung genetischer Mutanten oder Umweltbedingungen, die die Permeabilität für die 24 Stunden entweder erhöhen oder verringern. Nach der Befruchtung, Wildtyp-Zebrafisch-Neuroepithel. 70 Kilodalton Fitzy Dextran tritt langsam über zwei Stunden aus, während 2000 Kilodalton dies nicht tut und 10 Kilodalton fast sofort austritt.

Daher ist 70 Kilodalton das ideale Molekulargewicht, um Erkrankungen zu identifizieren, die die neuroepitheliale Permeabilität sowohl erhöhen als auch verringern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die neuroepitheliale Permeabilität im embryonalen Zebrafisch quantifiziert