Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine flexible Methode zur Neugestaltung viraler Oberflächen mittels Click-Chemie zu demonstrieren. Im ersten Schritt dieses Verfahrens werden humane embryonale Nierenzellen mit Adenovirus vom Typ 5 infiziert und in Gegenwart entweder der unnatürlichen Aminosäure Azidohomoalanin oder des Acetosugar-Parasiten N-Acetoacetylglucosamin inkubiert. Nach zwei Tagen werden die mit Azid markierten Adenoviruspartikel gewonnen und gereinigt.

Anschließend wird die chemoselektive Azid-Alkin-Cycloaddition verwendet, um fluoreszierende Sonden an die Oberfläche dieser Partikel zu binden. Wie im schriftlichen Protokoll erläutert, erfolgt dies mithilfe einer von zwei möglichen Ligationsmethoden, der spannungsunterstützten oder der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition.

In therapeutischen Anwendungen können diese Anhängsel Polypeptidpolymere oder kleine Moleküle umfassen. In diesem Experiment wird eine fluoreszierende Sonde verwendet, um die Ligierung der Sonde an Kapsidproteine mittels SDS-Gelelektrophorese nachzuweisen. Es besteht großes Interesse an der Entwicklung von Viren als Genübertragungssysteme, insbesondere im Hinblick auf Therapeutika, die Genübertragung, onkotische Therapie und Impfstofftechnologien.

In diesem Zusammenhang ist die gezielte Anpassung der Virus-Wirt-Schnittstelle besonders wichtig, um die geeigneten Eigenschaften für die therapeutische, gewebespezifische Immunstimulation zu erzielen. Eine Reihe weiterer Faktoren spielt ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Optimierung der Wirt-Virus-Schnittstelle. Vor diesem Hintergrund haben wir ein zweistufiges Markierungsprotokoll entwickelt.

Der erste Schritt ist die metabolische Einführung einer unnatürlichen Aminosäure oder eines unnatürlichen Zuckers. Dadurch wird ein Angriffspunkt installiert, der anschließend mit sehr, sehr hochselektiven Chemikalien weiter ausgebaut werden kann, um die Viren im Wesentlichen mit jeder gewünschten Funktionalität auszustatten, ohne das Virus, seine Infektiösität oder die allgemeine Fitness signifikant zu beeinträchtigen – dies stellt eine große Hürde dar, die überwunden werden muss. Nach der Sterilisation des Sicherheitswerks und der Laborgeräte bereiten Sie 11 Kulturschalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern mit HEK 2 93-Zellen vor, die in HEK-Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius gehalten werden.

Nachdem die Zellkultur 80 bis 90 % konfluent ist, entfernen Sie das Wachstumsmedium von einer der Schalen und waschen Sie einmal mit TD-Puffer. Lösen Sie die Zellen mit einem Milliliter Trypsin-EDTA und inkubieren Sie eine Minute lang. Geben Sie neun Milliliter Wachstumsmedium hinzu und zählen Sie die Anzahl der gewonnenen Zellen in dieser Schale.

Unter Verwendung eines Hämocytometers berechnen Sie die Anzahl der für die Infektion erforderlichen Adenovirus-Partikel für jede der verbleibenden zehn Kulturschalen. Entfernen Sie langsam das Wachstumsmedium und waschen Sie mit fünf Milliliter TD-Puffer. Geben Sie ein Milliliter Infektionspuffer hinzu und inkubieren Sie während dieses Zeitraums eine Stunde lang.

Schütteln Sie die Schalen vorsichtig alle 15 Minuten nach der Infektion von Seite zu Seite. Geben Sie vorsichtig neun Milliliter HEK-Wachstumsmedium zu jeder Schale hinzu und inkubieren Sie weitere 18 Stunden. Aus konzentrierten Stammlösungen von HA in Sistine.

Bereiten Sie ein HA-Markierungsmedium gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Achten Sie darauf, diese Stammlösungen zunächst mit einem 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter zu filtrieren. Sterilisieren Sie die Methionin-Stammlösung für die Kontrolle auf die gleiche Weise und entfernen Sie vorsichtig das Wachstumsmedium und waschen Sie jede Kulturschale mit fünf Millilitern TD-Puffer.

Ersetzen Sie dies durch 10 Milliliter eines HA-Markierungsmediums und inkubieren Sie die infizierten Zellen weitere sechs Stunden. Die viralen Kapsidproteine werden nun in Gegenwart von Azo-Homo-Alanin und Abwesenheit von Methionin translatiert. Ersetzen Sie das Markierungsmedium vorsichtig durch 10 Milliliter frisches Wachstumsmedium und inkubieren Sie weitere 18 Stunden.

Nach Abschluss dieses Schritts fahren Sie mit dem Reinigungsverfahren im dritten Schritt des Videos fort. Alternativ können azi-Tags über azi-haltige Zuckermoleküle eingeführt werden, anstelle der unnatürlichen Aminosäure a HA. In diesem Protokoll wird ein parasitenbezogenes n-Acetoacetyl-Galacto, ein metabolischer Vorläufer von UDPN-Acetoacetyl-Glucosamin, verwendet, das in Gegenwart dieses Aceto-Zuckers kultiviert wird.

Adenovirus vom Typ fünf weist Azi-Gruppen nur auf dem Faserprotein auf, um die Zuckermarkierung durchzuführen. Befolgen Sie zunächst Schritt eins des Videos, bis zur Bildschirmaufforderung. Dies entspricht Schritt 1,5 im schriftlichen Protokoll.

Bereiten Sie die Zuckermarkierungslösung vor, indem Sie zunächst 100 Mikroliter ATO-Zucker-Stammlösung in Falcon-Röhrchen pipettieren und das Methanol verdunsten lassen. Geben Sie danach 100 Milliliter HEK-Wachstumsmedium hinzu. Überdecken Sie die Zellen in jeder Petrischale mit 10 Milliliter dieses Zuckermarkierungsmediums und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 44 Stunden.

Fortfahren mit Schritt drei zur Reinigung. Überführen Sie das Medium zusammen mit den infizierten Zellen aus der Kulturschale in zwei konische Röhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 2000 G. Bei vier Grad.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in vier Milliliter TD-Puffer unter Verwendung von flüssigem Stickstoff in einem 37-Grad-Bad. Führen Sie drei Gefrier-Tau-Zyklen durch, um die infizierten Zellen zu lysieren. Mischen Sie die Suspension nach jedem Zyklus mit einem Vortex.

Zentrifugieren Sie die Auftaususpension bei 2000 G für 10 Minuten, um den Zelltrümmern als Sediment abzutrennen, da das in Schritt eins verwendete Adenovirus ein GFP-Transgen enthielt; die fluoreszierende Aktivität zu diesem Zeitpunkt bestätigt die Transduktion und Expression der viralen DNA. Bereiten Sie sorgfältig ein Cäsiumchlorid-Dichtegradient von 1,25 Gramm pro Milliliter bis 1,4 Gramm pro Milliliter vor. Pipettieren Sie das lysierte Zellüberstand auf den Dichtegradienten und zentrifugieren Sie bei 126.000 G für eine Stunde bei 15 Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation sollte ein dicker, breiter Band im Zentrifugenröhrchen sichtbar sein. Dies ist das azi-modifizierte Virus. Mit einer Sterne-L-Nadel das Röhrchen am Boden anstechen, sodass der Inhalt tropfenweise austritt, und dieses Virus vorsichtig sammeln.

Die Bandbreite der beiden Ligationsmethoden zeigte die Dehnung an. Die dehnungsgeförderte Route beinhaltet einfachere Reaktionsbedingungen, weist jedoch den Nachteil einer begrenzteren Auswahl an kommerziell verfügbaren Sonden für die dehnungsgeförderte Ligierung auf. Mischen Sie 50 Mikroliter azi-modifiziertes Virus in Viruslagerpuffer mit 0,25 Mikrolitern Tamara-BCN-Markierungslösung, indem Sie das Gefäß vorsichtig am Boden antippen, bedecken Sie es mit Folie und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur rotieren.

Reinigen Sie das Click-Virus mittels Gelfiltration an einer Zentrifuge. Spin-Säulen werden mit Virenspeicherpuffer equilibriert. Die deoxygenierte Kupfer-katalysierte Cycloaddition bietet eine höhere Verfügbarkeit an Sonden, weist jedoch den Nachteil auf, dass spezielle Geräte zur Aufrechterhaltung einer deoxygenierten Atmosphäre erforderlich sind.

Um eine kupferkatalysierte Ligation durchzuführen, müssen zunächst alle Reaktionsmaterialien und Lösungen sechs Stunden lang in einer Stickstoff-Handschuhbox deoxygeniert werden. Danach wird im Handschuhkasten die Stammlösung des Kupfer(I)-Katalysators hergestellt, um die Reaktion zu starten. Geben Sie einen Mikroliter dieser Kupfer-Stammlösung zu einer 50-Mikroliter-Lösung aus Virussonde und Chelatiermittel hinzu.

Lassen Sie die Markierungsreaktion über Nacht in der Handschuhbox ablaufen. Reinigen Sie die Akzeptfiltration wie in Schritt vier beschrieben. Nach dem Kochen, gereinigter, „geklickter“ Virus und Lysatprobenpuffer für 10 Minuten.

Befüllen Sie die Vertiefungen mit dem angeklickten Virus und den Kontrollen und führen Sie die Elektrophorese durch. Halten Sie den Tank mit Folie bedeckt, um die fluoreszierende Sonde vor Licht zu schützen. Nach einer Stunde scannen Sie das Gel mit einem fluoreszenten Gelscanner.

Beachten Sie, dass intakte oder nicht mit I markierte Viren keine signifikante Fluoreszenzmarkierung für ein HA verursachen dürfen, das die Viren markiert, die in höherer Konzentration eines HA hergestellt wurden, da diese aufgrund eines höheren Grades an HA-Inkorporation stärker fluoreszierend markiert sind. Beachten Sie außerdem, dass das mit Zucker markierte Virus azi-Tags nur im Faser-Kapsidprotein exprimiert. Beginnend mit 80 % Konfluenz benötigen die Zellen zwei Tage für die Infektion zur azi-Markierung, fünf Stunden für die Gewinnung und Reinigung des markierten Virus, eine Nacht für die Click-Reaktion und zwei Stunden für die SDS-Page-Analyse, insgesamt also drei Einhalb Tage. Zusammenfassend wurden zwei Arten von azi-Markierungsmethoden und zwei azid-alkin-Click-Chemie-Reaktionen demonstriert.

Ihre Anwendung und Ressourcen sollten bestimmen, welche Methode oder Methoden am besten für Ihren Zweck geeignet sind. Obwohl alle Materialien in diesem Protokoll kommerziell erhältlich sind, haben wir festgestellt, dass die Synthese von HA-Aceto-Zuckern und INE-Sonden deutlich kosteneffizienter ist und eine größere Flexibilität bei der Modifizierung von Virusoberflächen ermöglicht.