Name: High Throughput Sequential ELISA zur Validierung von Biomarkern des akuten Graft-Versus-Host Disease (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Sequenz-ELISA-Methode zur Validierung von Plasmabiomarkern bei akuter Graft-versus-Host-Disease. Diese Technik ermöglicht effiziente Analysen mit minimalem Probenverbrauch.

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Unterstützt durch NIH Zuschüsse RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​der Hartwell-Stiftung, und der Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny ist ein Ermittler der Eric Hartwell Fonds und Amy Strelzer Manasevit Research Program.

Ein. Experiment Tag 0: Probenvorbereitung und ELISA-Test Platte Coating mit Capture Antikörper für IL-2Rα, REG3α und HGF <ol><li> Plasma Aliquot zu analysierenden Proben werden gezogen, werden aufgetaut und zentrifugiert bei 12.000 UpM für 10 min auf die Gerinnsel an der Unterseite und auf der Oberseite Lipide aus dem Plasma abzutrennen. 150 ul unverdünnten Plasma wird von jeder Probe auf eine 96-Well-V-Bodenplatte plattiert werden (Quelle Platte) durch manuelle Pipettiervorrichtung nach vordefinierten Karten. Die Aliquots werden in Parafilm eingewickelt werden und in einer feuchten Kammer bei 4 ° C während des gesamten Prozesses; nicht mehr als 72 Stunden. </li><li> IL-2Rα und HGF Fängerantikörpern wird rekonstituiert und verdünnt werden pro Hersteller Spezifikation und 50 ul wird in jede Vertiefung der 96-Well jeweiligen High-bindende half-well Platten, die dann verschlossen und über Nacht bei 4 ° C inkubiert ausplattiert Alternativ können viele Platten bei 37 ° C getrocknet werden und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung, hängenING auf die Stabilität des Proteins. </li><li> REG3α Fängerantikörper wird nach Herstellerangaben Protokoll mit Hersteller-Beschichtungs-Puffer und 25 ul verdünnt werden in jede Vertiefung einer 384-well Nunc Maxi-Sorp Platte, die dann verschlossen und über Nacht bei 4 ° C inkubiert beschichtet werden </li></ol> 2. Experiment 1. Tag: IL-2Rα ELISA (Abbildung 1) <ol><li> Die IL-2Rα Testplatte gewaschen, mit BLOTTO in TBS, und die Standard-rekonstituiert wird und ein 8-Punkt-Standardkurve wird pro Hersteller-Protokoll vorbereitet. </li><li> Nach Waschen der Platte nach der Sperrung Schritt wird 50 ul unverdünntem Plasma im Duplikat aus der Quellenplatte zu der ELISA-Test Platte ausplattiert und 50 ul jeder Standard ist in zweifacher Ausfertigung ausplattiert. Die Platte wird verschlossen und inkubiert 2 h bei Raumtemperatur auf einem Rotator Platte bei 300 Upm eingestellt. </li><li> Das Plasma wird aus dem IL-2Rα ELISA Testplatte zurückgewonnen und wieder in die un platziertverdünnt Plasmaquelle Platte. Der ELISA ist je Hersteller-Protokoll (mit Volumina für half-well Platten eingestellt) und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts Satzes um 450 bis 570 nm nicht beendet werden, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> 3. Experiment Tag 1: REG3α ELISA (Abbildung 1) <ol><li> 10 ul unverdünnten Plasma wird mit einem separaten v-bottom Source-Platte übertragen werden. 90 ul Hersteller bereitgestellte Verdünnungspuffer in jede Vertiefung eine 1:10 Verdünnung Source-Platte erstellen hinzugefügt. </li><li> Die REG3α ELISA wird pro Hersteller-Protokoll durchgeführt (mit einem Volumen eingestellt für 384-Well-Platten) und die optische Dichte jeder Vertiefung liest mit einer Platte-Reader bei 450-620 nm, und die Daten werden gespeichert und analysiert werden. </li></ol> 4. Experiment Tag 1: Elafin und TNFR1 Prüfplatte Coating mit Capture Antikörper <ol><li> Elafin und TNFR1 Fänger-Antikörper werden rekonstituierte und dilausgeschüttet pro Hersteller Spezifikation und 50 ul wird in jede Vertiefung der 96-Well jeweiligen High-bindende half-well Platten, die dann verschlossen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert Elafin plattiert und bei 4 ° C für TNFR1. </li></ol> 5. Experiment Tag 1-2: HGF ELISA (Abbildung 1) <ol><li> Nach Abschluss der IL-2Rα ELISA und Sicherung der Test nicht wiederholt zu werden brauchen, werden mit 60 ul der unverdünnten Plasma zu einer neuen Quelle Platte übertragen und dann 60 ul 1% BSA in 1 x PBS zu jeder Vertiefung gegeben, um ein make 1:2 verdünnt Plasmaquelle Platte. </li><li> Die HGF Testplatte gewaschen, mit BLOTTO in TBS, und die Standard-rekonstituiert wird und ein 8-Punkt-Standardkurve wird pro Hersteller-Protokoll vorbereitet. </li><li> Nach Waschen der Platte nach der Sperrung Schritt wird 50 ul von 1:2 verdünntem Plasma in zweifacher Ausfertigung auf dem ELISA-Test Platte ausplattiert, und 50 ul jeden Standard wird in zweifacher Ausfertigung ausplattiert. Die Platte ist abgedichtet undüber Nacht bei Raumtemperatur auf einem Teller Rotator bei 300 RPM gesetzt inkubiert. </li><li> Die 1:2 verdünntes Plasma aus dem HGF ELISA Testplatte zurückgewonnen und wieder in den platziert 1:2 verdünntes Plasmaquelle Platte. Der ELISA ist je Hersteller-Protokoll (mit Volumina für half-well Platten eingestellt) und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts Satzes um 450 bis 570 nm nicht beendet werden, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> 6. Experiment Tag 2: Elafin ELISA <ol><li> 10 ul unverdünnten Plasma wird zu einer neuen Quelle Platte übertragen werden und dann 190 ul 1% BSA in 1 x PBS wird zu jedem Well hinzugefügt werden, um 200 ul von Plasma dluted 01.20 machen. </li><li> Die ELISA-Tests durchgeführt Elafin entsprechend Hersteller-Protokoll (mit Volumina eingestellt für Halb-Well-Platten), und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts auf 450-570 nm ist, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> 7. Experiment Day 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 ul 1% BSA in PBS wird dem 01.20 Geberplattenteil (jetzt mit 100 ul Plasma 1.20) zu 125 ul verdünnte 1.25 Plasma zu erhalten zugesetzt werden. </li><li> Der ELISA ist TNFR1 pro Hersteller-Protokoll abgeschlossen (mit Volumina für Halb-Well-Platten eingestellt) und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts auf 450-570 nm ist, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> 8. Experiment Tag 2: IL-8 ELISA <ol><li> 60 ul von 1:2 verdünnte Plasma wird zu einer neuen Quelle Platte überführt und anschließend 180 ul IL-8 Verdünnungsmittel zu jeder Vertiefung zugegeben, um eine verdünnte 1.06 Plasmaquelle Platte zu machen. </li><li> Die IL-8 ELISA ist je Hersteller-Protokoll abgeschlossen (mit Volumina für Halb-Well-Platten eingestellt) und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts auf 450-570 nm ist, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> Sobald alle ELISAs abgeschlossen sind, Nichtbenutzungd Lager Plasma werden in die Aliquots aufgetaut ersetzt werden und zur späteren Verwendung eingefroren.

<ol><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li>
<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12(2010).</li>
<li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li>
<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li>
<li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li>
<li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li>
<li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li>
<li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines%3A+the+sequential+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li>
<li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Die sequentielle ELISA hier vorgestellte Verfahren erlaubt eine Messung mehrerer Plasmaproteinen auf kleine Volumina von Plasma was schwierig sein kann zu erhalten, und / oder unersetzlichen wie Proben von Probanden mit der seltenen Erkrankungen oder Plasmaproben von Mäusen 9,10 erhalten. Die sequentiellen ELISAs werden typischerweise in der Reihenfolge der zunehmenden Plasmaverdünnung Faktor durchgeführt, mit ELISAs erfordern verdünnte Plasma ≥ 1:10 typischerweise nicht zu müssen aufgearbeitet werden, obwohl dies kann, falls gewünscht. Die Fähigkeit zur sequentiellen ELISA durchzuführen durch ELISA Kits / Protokolle in dem das Plasma mit anderen Reagenzien gemischt wird oder bei denen unterschiedliche Verdünnung Puffer für das Plasma benötigt begrenzt, dies schließt die ablility zur Wiederverwendung einer Probe aufgrund von Bedenken, dass eine inkompatible Puffer / Reagenz wird mit der Leistung eines bestimmten Tests stören. Bei sorgfältiger Planung kann 10 oder mehr ELISAs auf der gleichen Plasmaprobe durchgeführt werden. ent &quot;&gt; Individuelle Labors müssen möglicherweise Plasmaverdünnungen anzupassen, um interpretierbare Ergebnisse auf erwartete Plasma-Konzentrationen des Proteins von Interesse in den Proben aus der Probanden basiert. Unterschiede in der Laborausrüstung kann in der Notwendigkeit führen, um die Inkubation und kolorimetrischen Entwicklung zu optimieren Zeiten, Anzahl der Wäschen und / oder waschen Haltezeiten um jede gegebene ELISA optimieren. Um hohe Durchsatzleistung und die Genauigkeit zu erhöhen und eine Untersuchung in kostengünstiger Weise durchzuführen, ist die Verwendung eines robotischen Liquid Handling Plattform fähig Analyse auf 384 Well Platten und einem automatisierten Tellerscheibe mit Stapeleinheit empfohlen. Dieses Gerät kann die Genauigkeit und Präzision der Analyse von mehreren Benutzern durchgeführt und helfen Konsistenz der Analyse inter-und intra-Assay-Variation zu reduzieren. Wir verwendeten sequenziellen ELISA über verfügbare Multiplex-Plattformen für zwei Gründe: 1) Die meisten derAntikörper-Paare für neue Proteine ​​können nicht leicht konjugiert werden auf Kügelchen oder einem anderen Material als auch zeitaufwendig und teuer, 2) einzelne ELISAs sind genauer als Multiplex-Mikroarray oder Kügelchen, sekundär zu einer Abwesenheit von Kreuzreaktivität 11. Wenn eine zuverlässige Methode hergestellt in gemultiplexte, wulst-basierten Microarrays durchzuführen, kann es in der Lage sein, um die sequentielle ELISA-Verfahren zu ersetzen, sondern kann durch die Möglichkeit, die Antikörper an Kügelchen und / oder konjugiert mit der Anzahl der gewünschten Proteine ​​zu begrenzen analysiert.

Akute Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD), eine führende Ursache von Nicht-Rückfall Mortalität (NRM) nach allogener Stammzelltransplantation (HSCT), wird durch eine Dysfunktion in drei Organsysteme gemessen: die Haut, Leber und Magen-Darm-(GI) Trakt 4. Akute GvHD tritt typischerweise zwischen zwei und acht Wochen nach der Transplantation kann aber später auftreten und ist oft klinisch nicht von anderen post-HSCT Komplikationen wie Konditionierung Toxizität, Infektionen oder Medikamente Nebenwirkungen. Durch den Einsatz von Proteom Strategien und Hochdurchsatz-Validierung mit sequentiellen ELISA haben wir 6 Proteine, deren Konzentrationen an dem Einsetzen der klinischen Manifestationen von GVHD erhöht identifiziert. IL-2Rα, TNFR1, HGF und IL-8, wenn sie in einem 4-Biomarker-Panel kombiniert werden zu Beginn der klinischen Symptome GVHD zu diagnostizieren und kann post-HSCT Überleben unabhängig von GVHD Schweregrad 1 vorherzusagen. Elafin, ein Biomarker für GVHD der skin, zwischen GVHD Ausschlag und Ausschlag von anderen Ursachen wie Arzneimittelexantheme diskriminieren und Transplantation das Überleben 2 vorherzusagen. Wir haben vor kurzem identifizierten REG3α als Biomarker von GVHD des unteren Gastrointestinaltrakt, das Zielorgan meisten mit NRM verbunden. Plasma REG3α Konzentration zuverlässig zu identifizieren GVHD als Ursache für post-HSCT Durchfall und korrelieren mit histologischen Schwere der GvHD auf diagnostische Darmbiopsien. REG3α Konzentrationen an GI GVHD Ausbruch kann auch vorhersagen, Reaktionsfähigkeit auf GVHD Therapie und NRM 3. Der Einbau dieser validierten GVHD Biomarker in der klinischen Versorgung wird derzeit in klinischen Studien untersucht. Diese Experimente wurden auf kleinen Plasma-Aliquots von Patienten HSCT zwischen 2000 und 2010 bei der GVHD Auftreten, die unersetzlich und von begrenzter Menge sind gesammelt wurden. Aufgrund der wertvollen Natur dieser Proben haben wir eine met entwickelthod der Messung mehrere Plasma-Protein-Konzentrationen in einer effizienten, reproduzierbar, um überschüssige Gefrier-Auftau-Zyklen, Auftauzeit und Plasma Nutzung zu beseitigen. Diese Technik kann angewendet ELISAs für mehrere Proteine ​​/ Zytokine von Interesse an der gleichen Probe durchzuführen (e) sofern die Proben müssen nicht mit anderen Reagenzien gemischt werden. Wenn ELISA Kits nicht mit Pre-beschichtete Platten, 96-well half-well Platten oder 384-Well-Platten kommst können zur weiteren Reduzierung der Verwendung von Proben / Reagenzien werden. Dieses Manuskript konzentriert sich auf die technologischen Aspekte der Messung von GVHD Biomarkern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Menschliches IL-2 R alpha Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche HGF Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> Human IL-8 OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match ASSEMBLY Menschliche PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> R &amp; D Systammt </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well Polystyrol konischen Boden Platten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Wird für Plasmaquelle Platten </td></tr><tr><td> Costar half-well high-bindenden 96-Well-Platten </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> Für IL-2Rα, HGF, TNFR1 und Elafin ELISAs </td></tr><tr><td> Nunc 384-well Platten MaxiSorp </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> Für REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin, Fraktion V, Heat Shock Behandelte </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker BLOTTO in TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> Blockierungsmittel für IL-2Rα HGF und TNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> DulbeccosPhosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> Waschpuffer für IL-2Rα, HGF, Elafin und TNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> TMB Peroxide Susbtrate </td><td> Kirkegaard und Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> Waschpuffer für IL-2Rα, HGF, Elafin und TNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (Verdünnt auf 2N) für Stop-Lösung </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa zur validierung von biomarkern des akuten graft-versus-host disease

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unvoreingenommene Entdeckung Proteomics-Strategien haben das Potenzial, eine große Zahl von neuen Biomarkern, die diagnostische und prognostische Tests in einem klinischen Umfeld zu verbessern und kann möglicherweise Guide therapeutische Interventionen zu identifizieren. Wenn eine große Zahl von Kandidaten Proteine ​​identifiziert werden, kann es schwierig sein, Biomarker-Kandidaten in einer zeitgerechten und effizienten Weise aus Patientenplasmaproben, die event-driven, der Finite-Volumen-und unersetzlich sind, wie zu Beginn der akuten validieren Graft-versus- host disease (GVHD), eine potenziell lebensbedrohliche Komplikation der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT). Hier beschreiben wir die Verfahren zur Durchführung der im Handel erhältlichen ELISA-Tests für sechs validiert GVHD Proteine: IL-2Rα 5, 6 TNFR1, HGF 7, IL-8 8, Elafin 2 und REG3α 3 (auch als PAP1 bekannt) in einer sequentiellen Weise zu minimieren Frost-Tau-Zyklen, Aufgetaut Plasma-Zeit und Plasma-Nutzung. Bei diesem Verfahren führen wir die ELISAs in Reihenfolge wie Probenverdünnungsfaktor bestimmt, wie in unserem Labor mit der Hersteller ELISA Kits und Protokolle mit geringfügigen Anpassungen, um eine optimale sequentielle ELISA Leistung erleichtert wird. Die resultierende Plasma-Biomarker-Konzentrationen können dann zusammengestellt und analysiert werden signifikante Ergebnisse innerhalb einer Patientengruppe. Während diese Biomarker derzeit nur für Forschungszwecke, wird ihre Einbeziehung in klinische Versorgung derzeit in klinischen Studien untersucht. Diese Technik kann angewendet ELISAs für mehrere Proteine ​​/ Zytokine von Interesse an der gleichen Probe durchzuführen (e) sofern die Proben müssen nicht mit anderen Reagenzien gemischt werden. Wenn ELISA Kits nicht mit Pre-beschichtete Platten, 96-well half-well Platten oder 384-Well-Platten kommst können zur weiteren Reduzierung der Verwendung von Proben / Reagenzien werden.

<html> Der Biomarker Workflow und Timeline sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführt sind. Einmal vollendet, Konzentrationen von 6 verschiedenen Proteinen sind jetzt auf dem gleichen Plasmaprobe quantifiziert worden mit insgesamt 150 ul des Plasmas. Ausplattieren der Proben im Doppelansatz pro Test ermöglicht für die interne Qualitätssicherung, mit CV weniger als 10% als optimal. Wenn die Durchführung der sequenziellen ELISA auf mehreren Platten, konsistente optische Dichten von dem hohen Standard bevorzugt und ermöglichen eine bessere inter-Platte Zuverlässigkeit der Messungen; Standardkurve ODs können zwischen den Platten verglichen werden, um zu sehen zu beurteilen für Inkonsistenz in ELISA Leistung (Abbildung 2). Entwicklungszeiten mit Tetramethylbenzidin kolorimetrischen Substrat und hohe Konzentration ODs beobachtet für jede Biomarker in unserem Labor sind in Tabelle 3 aufgeführt. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Abbildung 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. Workflow für IL-2Rα, REG3α und HGF ELISAs. Nachdem die Plasmaproben auf die IL-2Rα ELISA Testplatten überzogen worden sind sie zurückgefordert zu einer Verwässerung Quelle Platten für andere ELISAs machen. Für die HGF ELISA wird das Plasma zurückgefordert, um die 1:6 Verdünnung Platte für IL-8 vorzubereiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Optische Dichten für die Standardkurve von 7 verschiedenen ELISA-Platten messen REG3α Konzentrationen entsprechend den 1084 Patienten für die erste REG3α GI GVHD Biomarker Bericht 3 getestet. Konsequente ODs zwischen den Platten zu gewährleisten konsistente Proteinkonzentration Messungen zwischen den Platten. Konzentrationen von Proteinenin Plasmaproben Probe durch Vergleichen der optischen Dichten Standardkurve optischen Dichten berechnet. <table border="1"><tbody><tr><td> Experiment Tag 0 </td><td> Ein. Bereiten Sie die Proben </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF und REG3α capture Ab </td></tr><tr><td> Experiment Tag 1 </td><td> Ein. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (durch die Probe plating) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin und TNFR capture Ab </td></tr><tr><td> Experiment Tag 2 </td><td> Ein. HGF ELISA Abschluss </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Auffrieren ungenutztenPlasma </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. GVHD Biomarker Workflow-Übersicht <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tag 0 </td><td colspan="3"> Probenvorbereitung und Übernachtung capture Körper Inkubationszeit </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Zeit (hr) </td><td> 0,0 </td><td> Blockierung </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Proben Plated </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Reclaim Plasmaproben; Erkennung Ab </td><td> Blocking; Prepare Samples (1:10 Verdünnung) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td> Proben plated (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> Erkennung Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td> Platte Lesen </td><td> TMB </td><td> Blocking; Prepare Proben (1:2 Verdünnung) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Platte Lesen </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td> Proben plated (1:2) </td><td> Erfassen Ab (Inkubation über Nacht) </td><td> Erfassen Ab (Inkubation über Nacht) </td><td></td></tr><tr><td> Tag 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeit (hr) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim Plasma-Erkennung Ab </td><td> Blocking; Prepare Proben (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Beispiel plating (1:2) </td><td> Blocking; weitere Verdünnung von 1:20 Proben bis 1:25 Verdünnung </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Beispiel plating (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Platte Lesen </td><td> Erkennung Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Bereiten Sie die Proben (1:6 Verdünnung) </td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Erkennung Ab </td><td> Beispiel plating (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Platte Lesen </td&gt; <td> HRP </td><td> Erkennung Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Platte Lesen </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Platte Lesen </td></tr><tr><td colspan="2"> Nach Beendigung </td><td colspan="6"> Ersetzen Source Plasma in Aliquots und einfrieren für eine spätere Verwendung </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Zeitplan für die Durchführung ELISAs. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plasma Verdünnungsfaktor </td><td> High Standard Concentration </td><td> Substrat Entwicklungszeit (min) </td><td> Hohe OD </td><td> Kurve </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01.01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Linear </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01.02 </td><td> 4.000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4-Parameter </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01.06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4-Parameter </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01.10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4-Parameter </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 01.20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4-Parameter </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01.25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Linear </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. ELISA Details für 6 GVHD Biomarker.

Hoher Durchsatz Validierung mehrerer Biomarker-Kandidaten können durch sequentielle ELISA durchgeführt werden, um Einfrieren / Auftauen zu minimieren und die Nutzung von wertvollen Plasmaproben. Hier zeigen wir, wie man nacheinander durchführen ELISAs für sechs verschiedene validierte Plasma-Biomarker<sup&gt; 1-3</sup&gt; Of graft-versus-host disease (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; Auf dem gleichen Plasmaprobe.

High Throughput Sequential ELISA zur Validierung von Biomarkern des akuten Graft-Versus-Host Disease

Strategien der unvoreingenommenen Discovery-Proteomik haben das Potenzial, eine große Anzahl neuartiger Biomarker zu identifizieren, welche die diagnostische und prognostische ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe eines Hochdurchsatz-Verfahrens mit sequenzieller ELISA eine effiziente Analyse einer großen Anzahl neu entdeckter Biomarker zu ermöglichen, die mittels Proteomik identifiziert wurden. Dies wird erreicht, indem Proben zunächst in eine Quellplatte gegeben werden, die zur Verdünnung jedes einzelnen Biomarkers sowie zur Aufbewahrung des zurückgewonnenen Plasmas zwischen den Tests dient. Anschließend werden ELISA-Analysen für jedes Protein durchgeführt, um deren Konzentrationen in den Patientenproben zu bestimmen.Schließlich kann der Anstieg der Proteinspiegel dieser Biomarker zu Beginn der klinischen Manifestationen einer akuten Graft-versus-Host-Erkrankung bewertet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sequenzielle Analysatoren mehrere neuartige Proteine analysieren können, die nicht immer mit Multiplex-Plattformen verfügbar sind. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Diagnose der akuten Graft-versus-Host-Erkrankung.Da Biomarker, die mit dieser Methode validiert wurden, derzeit für die klinische Versorgung untersucht werden. Obwohl diese Methode Einblicke in Komplikationen nach traumatischer poetischer Stammzelltransplantation liefern kann, ist sie ebenfalls anwendbar auf die Entdeckung und Validierung von Biomarkern für andere Erkrankungen wie Lungentransplantation, Komplikationen, Lungenkrebs oder potenziell jede Erkrankung, für die ein diagnostischer Bluttest nützlich sein wird.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die mehreren Schritte konsistent durchgeführt werden müssen, um Reproduzierbarkeit und eine geringe Variabilität zwischen Chargen sicherzustellen. Am Tag vor dem Experiment Zentrifugation der Plasmaproben aliquots 10 Minuten bei 15.300 RCF und vier Grad Celsius, um die Gerinnsel am Boden und die Lipide an der Oberfläche vom Plasma zu trennen. Anschließend 150 Mikroliter unverdünntes Plasma jeder Probe manuell gemäß vordefinierter Karten in eine 96-Loch-V-Boden-Platte pipettieren. Die Platte mit Parafilm abdecken und bis zu 72 Stunden lang bei vier Grad Celsius in eine Feuchtekammer stellen.Als Nächstes, nach der Rekonstitution und Verdünnung von IL-2-Rezeptor-alpha und humanem Wachstumsfaktor oder HGF-Fängerkörpern gemäß den Herstellerspezifikationen, pipettieren Sie 50 µL Aliquots jedes Antikörpers in jedes Loch entsprechender 96-Loch-High-Bindung-Halbloch-Platten. Versiegeln Sie dann diese Platten mit einem Plattenverschluss und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie nun Reg-3-alpha mit dem vom Hersteller vorgesehenen Beschichtungspuffer gemäß dessen Protokoll und pipettieren Sie 25 µL der Lösung in jedes Loch einer 384-Loch-No-Maxor-Platte.Dann lagern Sie diese Platte am ersten Tag des Experiments ebenfalls versiegelt bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie damit, die IL-2-Rezeptor-alpha-Testplatte zu waschen und mit Blotto in TBS zu blockieren. Stellen Sie nach der Rekonstitution des Standards gemäß dem Herstellerprotokoll eine achtstufige Standardkurve auf.Als Nächstes 50 µL unverdünntes Plasma und 50 µL jedes Standards im Duplikat von der Quellplatte in die ELISA-Testplatte übertragen. Anschließend die versiegelte Platte bei Raumtemperatur auf einem Plattenrotator mit 300 U/min inkubieren. Nach zwei Stunden das Plasma von der IL-2-Rezeptor-alpha-ELISA-Testplatte zurückgewinnen und in die Quellplatte mit unverdünntem Plasma zurückgeben.Danach nach Abschluss des EIA gemäß Herstellervorschrift die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenlesegerät messen, das auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt ist. Für den Rich-Three-Alpha-ELISA zunächst 10 Mikroliter unverdünntes Plasma auf eine separate Quellplatte mit Durchsichtboden übertragen und anschließend 90 Mikroliter des vom Hersteller bereitgestellten Verdünnungspuffers zu jedem Well hinzufügen, um eine 1:10-Verdünnungsquellplatte herzustellen. Nach Abschluss des Reg-Three-Alpha-ELISA gemäß Herstellervorschrift die Stopplösung in die 384-Well-Platte geben und die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenlesegerät messen, das auf 450 bis 620 Nanometer eingestellt ist. Nach Rekonstitution und Verdünnung der Elefant- und TNF-R1-Fängerkörper gemäß Herstellervorschriften jedes Well der jeweiligen 96-Well-High-Binding-Halbhochplatten mit 50 Mikrolitern der Fängerkörper beschichten.Anschließend die verschlossenen Testplatten über Nacht bei Raumtemperatur für die Elephant-Platte und bei vier Grad Celsius für die TN FFR-one-Platte inkubieren. Nach Abschluss des IL-2-Rezeptor-alpha-ELISA 60 Mikroliter unverdünntes Plasma auf eine neue Quellplatte übertragen. Dann 60 Mikroliter 1 % BSA in PBS in jedes Loch geben, um eine 1:2-verdünnte Plasmaquellplatte herzustellen.Als Nächstes waschen und blockieren Sie die HGF-Testplatte mit BLOTTO in TBS und bereiten Sie dann die Verdünnungsreihe für die acht Standardpunkte vor. Nach dem Waschen der Platte, im Anschluss an den Blockierungsschritt, geben Sie 50&nbsp;Mikroliter der verdünnten Plasma- und Standardproben in Verdünnung 1:2 in Duplikaten auf die EISA-Testplatte. Inkubieren Sie die versiegelte Platte anschließend über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Plattenrotator, der auf 300&nbsp;U/min eingestellt ist.Am nächsten Morgen gewinnen Sie das ein- bis zweifach verdünnte Plasma von der HGF-ELISA-Testplatte zurück und geben es wieder in die Quellplatte für das ein- bis zweifach verdünnte Plasma. Nach Abschluss des EIA lesen Sie gemäß dem Herstellerprotokoll am zweiten Tag des Experiments die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenreader ab, der auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt ist. Übertragen Sie zunächst 10 Mikroliter unverdünntes Plasma in eine neue Quellplatte und anschließend 190 Mikroliter 1 % BSA in PBS, um 200 Mikroliter ein- bis zwanzigfach verdünntes Plasma herzustellen.Danach, nach Abschluss des Elefanten, las Eliza gemäß der Herstellerprotokoll die optische Dichte mit einem Plattenreader, der auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt war. Für den TN FFR one gab Eliza zunächst 25 Mikroliter 1 % BSA in PBS zur 1:20-Quellplatte, was pro Vertiefung 125 Mikroliter 1:25 verdünntes Plasma ergab. Danach, nach Abschluss des TN FFR one EIA gemäß Herstellerprotokoll, wurde die optische Dichte jedes Wells mit einem auf 450 bis 570 Nanometer eingestellten Plattenreader gemessen; für die I-L-H-E-I-A-erste Übertragung wurden 60 Mikroliter 1:2 verdünntes Plasma auf eine neue Quellplatte übertragen und anschließend 180 Mikroliter IL-acht-Verdünnungsmittel zu jedem Well hinzugefügt, um eine 1:6 verdünnte Plasma-Quellplatte herzustellen.Danach nach Abschluss des ILH-ELISA gemäß Herstellervorschrift die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenlesegerät, das auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt ist, messen. Schließlich, sobald alle ELISA abgeschlossen sind, das nicht verwendete Plasma wieder in das gedachte Eloqua zurückführen und für die spätere Verwendung einfrieren. In diesem Diagramm sind die optischen Dichten für die Standardkurve von sieben verschiedenen ELISA-Platten dargestellt, die die Reg-3-alpha-Konzentrationen entsprechend den 1084 Patienten messen, die für den anfänglichen Reg-3-alpha-Gastrointestinal-Biomarkerbericht für Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit getestet wurden. Konsistente optische Dichten zwischen den Platten gewährleisten konsistente Protein-Konzentrationsmessungen zwischen Experimenten.Die Konzentrationen der Proteine in den Plasma­proben wurden durch Vergleich der optischen Dichten der Proben mit den optischen Dichten der Standard­kurve berechnet. Eine robotergestützte, saubere Handhabungs­plattform kann verwendet werden, um die Reproduzierbarkeit weiter zu erhöhen und gleichzeitig das benötigte Plasma­volumen zu verringern, indem ELISA und kreative Form Mehr­well­platten eingesetzt werden. Bei der Planung dieses Verfahrens ist es wichtig, zunächst unverdünntes Plasma in EISs durchzuführen, damit es anschließend zurückgewonnen und in späteren Experimenten nach der Entwicklung verwendet werden kann.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Proteomik, mithilfe des universellen Einsatzes sequenzieller ELISA-Kandidaten-Biomarker bei jeder gewünschten Erkrankung zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mehrere Biomarker mittels sequenzieller ELISA unter Verwendung geringer Plasmamengen und mit minimierten Freeze-Thaw-Zyklen validiert werden können.

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Forschung

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