High Throughput Sequential ELISA zur Validierung von Biomarkern des akuten Graft-Versus-Host Disease

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, sequentielles Eliza mit hohem Durchsatz zu verwenden, um eine große Anzahl neuartiger Biomarker, die durch Proteomik entdeckt wurden, effizient zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Proben auf eine Quellplatte gegeben werden, die verwendet wird, um eine Verdünnung für jeden Biomarker zu erzeugen und das zurückgewonnene Plasma zwischen den Tests zu lagern. Als nächstes werden Eliza-Proben für jedes Protein durchgeführt, um ihre Konzentrationen in Patientenproben zu bestimmen.

Letztendlich kann die Erhöhung der Proteinspiegel dieser Biomarker zu Beginn der klinischen Manifestationen der akuten Graft-versus-Host-Krankheit beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sequentielle Analysatoren mehrere neuartige Proteine analysieren können, die mit Over-Multiplexing-Plattformen nicht immer verfügbar sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose der akuten Graft-versus-Host-Krankheit.

Denn Biomarker, die mit dieser Methode validiert wurden, werden nun für die klinische Versorgung untersucht. Diese Methode kann jedoch Aufschluss über Komplikationen bei der posttraumatischen poetischen Stammzelltransplantation geben. Es kann auch zur Entdeckung und Validierung von Biomarkern für andere Krankheiten wie Lungentransplantationen, Komplikationen, Lungenkrebs oder potenziell jede Krankheit eingesetzt werden, bei der ein diagnostischer Bluttest nützlich ist.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es wichtig ist, dass die verschiedenen Schritte konsistent durchgeführt werden, um Reproduzierbarkeit und geringe Chargenvariabilität zu gewährleisten. Am Tag vor dem Experiment sollten die aliquoten Proben des Gedankenplasmas 10 Minuten lang bei 15.300 RCF und vier Grad Celsius heruntergeschleudert werden, um die Gerinnsel am Boden und die Lipide an der Oberseite vom Plasma zu trennen. Anschließend werden 150 Mikroliter unverdünntes Plasma aus jeder Probe durch manuelles Pipettieren nach vordefinierten Karten auf eine 96-Well-V-Bodenplatte aufgefüllt. Wickeln Sie die Platte in Paraform ein und legen Sie sie für bis zu 72 Stunden bei vier Grad Celsius in eine menschliche Kammer.

Als nächstes, nach der Rekonstitution und Verdünnung von IL-, Zwei-Rezeptor-Alpha- und humanem Wachstumsfaktor- oder HGF-Capture-Antikörpern gemäß den Herstellerspezifikationen werden 50 Mikroliter-Aliquots jedes Antikörpers in jede Vertiefung der jeweiligen 96-Well-Halbwell-Halbwell-Platten mit hoher Bindung aufgefüllt. Verschließen Sie diese Platten dann mit einem Plattenversiegeler und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nun wird reg three alpha mit dem Beschichtungspuffer des Herstellers gemäß dem Protokoll des Herstellers verdünnt und 25 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 3 84 Vertiefung ohne Maxor-Platte gegeben.

Lagern Sie diese Platte dann ebenfalls am ersten Tag des Experiments bei vier Grad Celsius verschlossen. Beginnen Sie damit, die IL-Zwei-Rezeptor-Alpha-Testplatte zu waschen und mit Blotto bei TBS zu blockieren. Nachdem Sie den Standard rekonstituiert haben, richten Sie eine achtstufige Standardkurve gemäß dem Protokoll des Herstellers ein.

Nächste Platte, 50 Mikroliter unverdünntes Plasma und 50 Mikroliter jedes Standards in zweifacher Ausfertigung von der Quellplatte auf die ELIZA-Testplatte. Inkubieren Sie dann die versiegelte Platte bei Raumtemperatur auf einem Plattenrotator, der auf 300 U/min eingestellt ist. Nach zwei Stunden wird das Plasma von der IL-Zwei-Rezeptor-alpha-ELIZA-Testplatte zurückgewonnen und wieder in die unverdünnte Plasma-Quellplatte gegeben.

Nach Abschluss der EIA gemäß dem Protokoll des Herstellers wird die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenleser abgelesen, der auf 450 bis 570 Nanometer für die reichhaltigen drei alpha Eliza eingestellt ist, zuerst 10 Mikroliter unverdünntes Plasma auf eine separate obere Quellplatte übertragen und dann 90 Mikroliter des vom Hersteller bereitgestellten Verdünnungspuffers zu jedem Well hinzugefügt, um eine Verdünnungsquellenplatte von 1 bis 10 zu erstellen. Nach Abschluss der Reg drei alpha Eliza gemäß dem Protokoll des Herstellers fügen Sie die Stopplösung zur 384-Well-Platte hinzu und lesen Sie die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenleser ab, der auf 450 bis 620 Nanometer eingestellt ist. Nach der Rekonstitution und Verdünnung des Elefanten und des tn FFR kodieren ein Capture-Antikörper gemäß den Herstellerspezifikationen jeden Well der jeweiligen 96-Well-Half-Well-Platten mit hoher Bindung mit 50 Mikrolitern der Capture-Antikörper.

Anschließend werden die versiegelten Testplatten über Nacht bei Raumtemperatur für die Elephant Plate und bei vier Grad Celsius für die TN FFR one Plate inkubiert. Nach Abschluss der IL übertragen zwei Rezeptoren alpha Eliza 60 Mikroliter unverdünntes Plasma auf eine neue Quellplatte. Dann bei 60 Mikrolitern 1%BSA in PBS in jede Vertiefung geben, um eine ein bis zwei verdünnte Plasma-Quellplatte herzustellen.

Anschließend wird die HGF-Testplatte mit BLOTTO in TBS gewaschen und blockiert und anschließend die Achtpunkt-Standardkurvenverdünnung eingestellt. Nach dem Waschen der Platte werden nach der Blockierungsstufenplatte 50 Mikroliter die Aliquote von ein bis zwei verdünntem Plasma und von jedem Standard auf der EISA-Prüfplatte dupliziert. Dann inkubieren Sie die versiegelte Platte über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Plattenrotator, der auf 300 U/min eingestellt ist.

Nehmen Sie am nächsten Morgen das ein- bis zwei verdünnte Plasma aus der HGF Eliza-Testplatte zurück und legen Sie es wieder in die ein- bis zwei verdünnte Plasma-Quellplatte. Nach Abschluss der EIA wird gemäß dem Protokoll des Herstellers am zweiten Tag des Experiments die optische Dichte jeder Vertiefung mit einem auf 450 bis 570 Nanometer eingestellten Plattenleser abgelesen. Übertragen Sie zuerst 10 Mikroliter unverdünntes Plasma auf eine neue Quellplatte und dann 190 Mikroliter 1 % BSA in PBS, um 200 Mikroliter von einem bis 20 verdünntem Plasma herzustellen.

Nachdem sie den Elefanten fertiggestellt hatte, las Eliza gemäß dem Protokoll des Herstellers die optische Dichte mit einem Plattenlesegerät ab, das auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt war. Für die TN FFR-Platte fügt Eliza zunächst 25 Mikroliter 1 % BSA und PBS auf die Quellenplatte von eins bis 20 hinzu, was zu 125 Mikrolitern von einem bis 25 verdünntem Plasma pro Vertiefung führt. Dann, nach Abschluss der TN FFR eine EIA gemäß dem Protokoll des Herstellers, lesen Sie die optische Dichte jeder Vertiefung mit einem Plattenlesegerät, das auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt ist, für den ersten I-L-H-E-I-A-Transfer, 60 Mikroliter von ein bis zwei verdünntem Plasma auf eine neue Quellplatte und fügen Sie dann 180 Mikroliter IL-Acht-Verdünnungsmittel zu jeder Vertiefung hinzu, um eine ein bis sechs verdünnte Plasma-Quellplatte herzustellen.

Nachdem Sie die ILH Eliza gemäß dem Protokoll des Herstellers abgeschlossen haben, lesen Sie die optische Dichte jeder Vertiefung mit einem Plattenlesegerät ab, das auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt ist. Schließlich, wenn alle Eliza fertiggestellt sind, setze das unbenutzte Gesprächsplasma in das Gedanken-Eloqua ein und friere es für die zukünftige Verwendung ein. In diesem Diagramm sind die optischen Dichten für die Standardkurve von sieben verschiedenen ELIZA-Platten, die die drei Alpha-Konzentrationen messen, entsprechend den 1084 Patienten, die für den ersten Biomarker-Bericht über die Magen-Darm-Transplantation gegen die Wirtskrankheit getestet wurden, mit konsistenten optischen Dichten zwischen den Platten dargestellt.

Die Konzentrationen der Proteine in den Plasmaproben wurden berechnet, indem die optischen Dichten der Probe mit den optischen Dichten der Standardkurve verglichen wurden. Eine robotersaubere Handhabungsplattform kann verwendet werden, um die Reproduzierbarkeit weiter zu erhöhen und gleichzeitig das Plasmavolumen zu verringern, das beim Ausführen von Eliza- und Creative-Form-Well-Platten verwendet wird. Bei der Planung dieses Verfahrens ist es wichtig, zuerst EISs durchzuführen, bei denen es sich um unverdünntes Plasma handelt, damit es nach seiner Entwicklung zurückgewonnen und in späteren Experimenten verwendet werden kann.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteomik, um mögliche Biomarker für jede Krankheit von Interesse durch die universelle Verwendung von sequentiellen Eliza-s zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mehrere Biomarker mit sequentiellem E validieren können, während Sie kleine Plasmamengen verwenden und freie Zyklen minimieren.