High Throughput Sequential ELISA zur Validierung von Biomarkern des akuten Graft-Versus-Host Disease

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe eines Hochdurchsatz-Verfahrens mit sequenzieller ELISA eine effiziente Analyse einer großen Anzahl neu entdeckter Biomarker zu ermöglichen, die mittels Proteomik identifiziert wurden. Dies wird erreicht, indem Proben zunächst in eine Quellplatte gegeben werden, die zur Verdünnung jedes einzelnen Biomarkers sowie zur Aufbewahrung des zurückgewonnenen Plasmas zwischen den Tests dient. Anschließend werden ELISA-Analysen für jedes Protein durchgeführt, um deren Konzentrationen in den Patientenproben zu bestimmen.

Schließlich kann der Anstieg der Proteinspiegel dieser Biomarker zu Beginn der klinischen Manifestationen einer akuten Graft-versus-Host-Erkrankung bewertet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sequenzielle Analysatoren mehrere neuartige Proteine analysieren können, die nicht immer mit Multiplex-Plattformen verfügbar sind. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Diagnose der akuten Graft-versus-Host-Erkrankung.

Da Biomarker, die mit dieser Methode validiert wurden, derzeit für die klinische Versorgung untersucht werden. Obwohl diese Methode Einblicke in Komplikationen nach traumatischer poetischer Stammzelltransplantation liefern kann, ist sie ebenfalls anwendbar auf die Entdeckung und Validierung von Biomarkern für andere Erkrankungen wie Lungentransplantation, Komplikationen, Lungenkrebs oder potenziell jede Erkrankung, für die ein diagnostischer Bluttest nützlich sein wird.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die mehreren Schritte konsistent durchgeführt werden müssen, um Reproduzierbarkeit und eine geringe Variabilität zwischen Chargen sicherzustellen. Am Tag vor dem Experiment Zentrifugation der Plasmaproben aliquots 10 Minuten bei 15.300 RCF und vier Grad Celsius, um die Gerinnsel am Boden und die Lipide an der Oberfläche vom Plasma zu trennen. Anschließend 150 Mikroliter unverdünntes Plasma jeder Probe manuell gemäß vordefinierter Karten in eine 96-Loch-V-Boden-Platte pipettieren. Die Platte mit Parafilm abdecken und bis zu 72 Stunden lang bei vier Grad Celsius in eine Feuchtekammer stellen.

Als Nächstes, nach der Rekonstitution und Verdünnung von IL-2-Rezeptor-alpha und humanem Wachstumsfaktor oder HGF-Fängerkörpern gemäß den Herstellerspezifikationen, pipettieren Sie 50 µL Aliquots jedes Antikörpers in jedes Loch entsprechender 96-Loch-High-Bindung-Halbloch-Platten. Versiegeln Sie dann diese Platten mit einem Plattenverschluss und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie nun Reg-3-alpha mit dem vom Hersteller vorgesehenen Beschichtungspuffer gemäß dessen Protokoll und pipettieren Sie 25 µL der Lösung in jedes Loch einer 384-Loch-No-Maxor-Platte.

Dann lagern Sie diese Platte am ersten Tag des Experiments ebenfalls versiegelt bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie damit, die IL-2-Rezeptor-alpha-Testplatte zu waschen und mit Blotto in TBS zu blockieren. Stellen Sie nach der Rekonstitution des Standards gemäß dem Herstellerprotokoll eine achtstufige Standardkurve auf.

Als Nächstes 50 µL unverdünntes Plasma und 50 µL jedes Standards im Duplikat von der Quellplatte in die ELISA-Testplatte übertragen. Anschließend die versiegelte Platte bei Raumtemperatur auf einem Plattenrotator mit 300 U/min inkubieren. Nach zwei Stunden das Plasma von der IL-2-Rezeptor-alpha-ELISA-Testplatte zurückgewinnen und in die Quellplatte mit unverdünntem Plasma zurückgeben.

Danach nach Abschluss des EIA gemäß Herstellervorschrift die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenlesegerät messen, das auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt ist. Für den Rich-Three-Alpha-ELISA zunächst 10 Mikroliter unverdünntes Plasma auf eine separate Quellplatte mit Durchsichtboden übertragen und anschließend 90 Mikroliter des vom Hersteller bereitgestellten Verdünnungspuffers zu jedem Well hinzufügen, um eine 1:10-Verdünnungsquellplatte herzustellen. Nach Abschluss des Reg-Three-Alpha-ELISA gemäß Herstellervorschrift die Stopplösung in die 384-Well-Platte geben und die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenlesegerät messen, das auf 450 bis 620 Nanometer eingestellt ist. Nach Rekonstitution und Verdünnung der Elefant- und TNF-R1-Fängerkörper gemäß Herstellervorschriften jedes Well der jeweiligen 96-Well-High-Binding-Halbhochplatten mit 50 Mikrolitern der Fängerkörper beschichten.

Anschließend die verschlossenen Testplatten über Nacht bei Raumtemperatur für die Elephant-Platte und bei vier Grad Celsius für die TN FFR-one-Platte inkubieren. Nach Abschluss des IL-2-Rezeptor-alpha-ELISA 60 Mikroliter unverdünntes Plasma auf eine neue Quellplatte übertragen. Dann 60 Mikroliter 1 % BSA in PBS in jedes Loch geben, um eine 1:2-verdünnte Plasmaquellplatte herzustellen.

Als Nächstes waschen und blockieren Sie die HGF-Testplatte mit BLOTTO in TBS und bereiten Sie dann die Verdünnungsreihe für die acht Standardpunkte vor. Nach dem Waschen der Platte, im Anschluss an den Blockierungsschritt, geben Sie 50 Mikroliter der verdünnten Plasma- und Standardproben in Verdünnung 1:2 in Duplikaten auf die EISA-Testplatte. Inkubieren Sie die versiegelte Platte anschließend über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Plattenrotator, der auf 300 U/min eingestellt ist.

Am nächsten Morgen gewinnen Sie das ein- bis zweifach verdünnte Plasma von der HGF-ELISA-Testplatte zurück und geben es wieder in die Quellplatte für das ein- bis zweifach verdünnte Plasma. Nach Abschluss des EIA lesen Sie gemäß dem Herstellerprotokoll am zweiten Tag des Experiments die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenreader ab, der auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt ist. Übertragen Sie zunächst 10 Mikroliter unverdünntes Plasma in eine neue Quellplatte und anschließend 190 Mikroliter 1 % BSA in PBS, um 200 Mikroliter ein- bis zwanzigfach verdünntes Plasma herzustellen.

Danach, nach Abschluss des Elefanten, las Eliza gemäß der Herstellerprotokoll die optische Dichte mit einem Plattenreader, der auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt war. Für den TN FFR one gab Eliza zunächst 25 Mikroliter 1 % BSA in PBS zur 1:20-Quellplatte, was pro Vertiefung 125 Mikroliter 1:25 verdünntes Plasma ergab. Danach, nach Abschluss des TN FFR one EIA gemäß Herstellerprotokoll, wurde die optische Dichte jedes Wells mit einem auf 450 bis 570 Nanometer eingestellten Plattenreader gemessen; für die I-L-H-E-I-A-erste Übertragung wurden 60 Mikroliter 1:2 verdünntes Plasma auf eine neue Quellplatte übertragen und anschließend 180 Mikroliter IL-acht-Verdünnungsmittel zu jedem Well hinzugefügt, um eine 1:6 verdünnte Plasma-Quellplatte herzustellen.

Danach nach Abschluss des ILH-ELISA gemäß Herstellervorschrift die optische Dichte jedes Wells mit einem Plattenlesegerät, das auf 450 bis 570 Nanometer eingestellt ist, messen. Schließlich, sobald alle ELISA abgeschlossen sind, das nicht verwendete Plasma wieder in das gedachte Eloqua zurückführen und für die spätere Verwendung einfrieren. In diesem Diagramm sind die optischen Dichten für die Standardkurve von sieben verschiedenen ELISA-Platten dargestellt, die die Reg-3-alpha-Konzentrationen entsprechend den 1084 Patienten messen, die für den anfänglichen Reg-3-alpha-Gastrointestinal-Biomarkerbericht für Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit getestet wurden. Konsistente optische Dichten zwischen den Platten gewährleisten konsistente Protein-Konzentrationsmessungen zwischen Experimenten.

Die Konzentrationen der Proteine in den Plasma­proben wurden durch Vergleich der optischen Dichten der Proben mit den optischen Dichten der Standard­kurve berechnet. Eine robotergestützte, saubere Handhabungs­plattform kann verwendet werden, um die Reproduzierbarkeit weiter zu erhöhen und gleichzeitig das benötigte Plasma­volumen zu verringern, indem ELISA und kreative Form Mehr­well­platten eingesetzt werden. Bei der Planung dieses Verfahrens ist es wichtig, zunächst unverdünntes Plasma in EISs durchzuführen, damit es anschließend zurückgewonnen und in späteren Experimenten nach der Entwicklung verwendet werden kann.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Proteomik, mithilfe des universellen Einsatzes sequenzieller ELISA-Kandidaten-Biomarker bei jeder gewünschten Erkrankung zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mehrere Biomarker mittels sequenzieller ELISA unter Verwendung geringer Plasmamengen und mit minimierten Freeze-Thaw-Zyklen validiert werden können.