Name: Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung lebensfähiger zirkulierender Tumorzellen aus Patientenblutproben mit funktionalisierten Mikroröhrchen. Diese Methode ermöglicht schonende Zellgewinnung für personalisierte Krebstherapien.

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Die beschriebenen Arbeiten wurde von der Cornell Center auf der Mikroumgebung und Metastasierung durch Verleihungsnummer U54CA143876 vom National Cancer Institute unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde zusätzlich teilweise durch ein National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH) finanziert.

Das folgende Protokoll ist für die Herstellung eines einzelnen Mikroröhre Vorrichtung. 1. Vorbereitung von Halloysit Nanotube-Lösung <ol><li> Sonifikat (10-13 W (rms)) 250 ul Halloysit-Nanoröhrchen-Lösung (6,6 Gew.% in Wasser) 30 sek. Coole Lösung mit kaltem Wasser und wiederholen Sie die Beschallung einmal. Wieder cool. </li><li> Zeichnen Sie beschallten Lösung in eine Spritze, legen Sie eine Spritze 0,45 um-Filter und Filter-Lösung in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Lösung gelegentlich bis zur Homogenität aufrechtzuerhalten. </li></ol> 2. Beschichtung von Reaktionscup innere Oberfläche mit Halloysit-Nanoröhren <ol><li> Erhalten 50 cm langen Abschnitt der Micro-Renathane microtubing (300 mu m Innendurchmesser, 35,3 ul Innenvolumen). Schneiden Sie ein Ende des Mikroröhrchen bei einer Diagonale und stecken in einem kleinen IDEX Adapterstück. Führen Sie die Nadel von einem 3/10 cc 29G Spritze in das andere Ende des Mikroröhrchens. </li><li> Um die Mikroröhrchen reinigen, legen Sie das offene Ende des Mikroröhrchen (das Endemit dem Adapter) in 70% Ethanol und Auslosung ~ 50 ul Ethanol in die Spritze zu füllen Mikroröhrchen. </li><li> Spülen Sie das Ethanol aus dem Mikroröhrchen, indem ein großzügiges Volumen von destilliertem Wasser in die Spritze. </li><li> Lösen Sie die Spritze aus dem Mikroröhrchen, entleeren Sie die Spritze, und dann wieder an die Mikroröhrchen. </li><li> Eine Lösung aus 0,02% w / v Poly-L-Lysin in Wasser. Zeichnen Sie 50 ul in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zu sitzen. </li><li> Zeichnen Sie 100 ul gefiltert Nanotube-Lösung in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 3 min bei RT inkubieren. </li><li> Zeichnen Sie 100 ul Wasser durch die Mikroröhrchen zum Ausspülen des Nanotube-Lösung. Erlauben beschichteten Mikroröhrchen zu sitzen, mit Wasser gefüllt, über Nacht bei RT. </li></ol> 3. Vorbereitung der Mikroröhrchen zur Zellisolierung <ol><li> Eine Lösung aus 10 ug / ml Protein G in 1X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0 - 7,2). Zeichnen Sie 50 ul PBS durch Mikroröhrchen und zeichnen Sie dann 50 uldas Protein-G-Lösung und zu ermöglichen, für 1,5 h bei RT inkubiert. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung mit 5 ug / ml E-Selektin-IgG und 50 pg / ml Antikörper (anti-EpCAM für die meisten Krebs-Proben, anti-PSMA für Prostatakrebs-Proben) in PBS. Zeichnen Sie 50 ul der E-Selektin und Antikörper-Lösung in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 2 h bei RT inkubieren. </li><li> Unspezifische zelluläre Adhäsion wird mit 5% Milch-Protein blockiert. Eine Lösung aus 5% (w / v) Milchprotein in PBS. 50 ul Malen Milchprotein Lösung in die Mikroröhre und lassen für 1 Stunde bei RT inkubiert. </li><li> Zeichnen Sie 50 ul PBS in das Rohr und lassen bei RT, bis Blut oder Buffy-Coat-Proben für die Verarbeitung bereit sind. </li><li> 10 min vor der Verwendung des Mikroröhrchen für Isolation, ziehen 50 ul PBS, die mit Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) gesättigt wurde, um die Selektin-Moleküle aktivieren. </li></ol> 4. Vorbereitung der Proben für Zell-Isolierung <ol><li> Zeichnen oder erhalten 10 ml Blut von Patienten in heparinisierteRohr. </li><li> 10 ml Ficoll-Paque Lymphozytenisolation Lösung in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Vorsichtig Schicht 10 ml Vollblut auf Ficoll, um nicht zu mischen, das Blut und Ficoll. </li><li> Zentrifugieren bei 2000 x g für 15 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung. </li><li> Entfernen Sie die Buffy-Coat-Schicht und in neues Röhrchen. </li><li> Wash Buffy-Coat mit PBS (Zentrifuge bei 230x g für 10 min, den Überstand verwerfen). </li><li> Vorsichtig resuspendieren Zellen mit 1 ml RBC Lysispuffer und Inkubation für 10 min bei RT, um Erythrozyten zu lysieren. </li><li> Fügen Sie 10 ml PBS, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 230x g für 10 min. Überstand verwerfen und das Pellet vorsichtig in 3 bis 4 ml PBS +. </li></ol> 5. Zellisolierung <ol><li> Befestigen Sie ein Ende des funktionalisierten Mikroröhrchen auf eine 5 ml Spritze mit IDEX-Adapter. </li><li> Legen Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe. </li><li> Tauchen des offenen Endes des funktionalisierten Mikroröhre in die Zelle suspension. </li><li> Verarbeiten Sie die Zellsuspension durch die Mikroröhrchen bei 1 bis 4 ml / h. </li><li> Übertragen des offenen Endes der Mikroröhrchen in ein Röhrchen mit PBS + und stellt 300 ul PBS + in die Spritze mit 0,016 ml / min, um ungebundene und lose gebundenen Zellen aus dem Mikroröhrchen entfernen. </li><li> Platzieren Sie das offene Ende des Mikroröhrchens in ein sauberes Röhrchen. Trennen Sie die Spritze aus dem Mikroröhrchen und fügen Sie eine Spritze mit Accutase vorgefüllt. Vorsichtig genug perfundieren Accutase in die Mikroröhrchen zu füllen (~ 50 ul) und lassen Sie sie bei RT für 10 min inkubieren. </li><li> Befestigen Sie eine Spritze mit 1 ml Wachstumsmedium (79% RPMI, 20% FBS, 1% Penicillin Streptomycin) und perfuse in Mikroröhrchen vorgefüllt, Sammeln Abwässer in Gewebekultur behandelt Well-Platte. </li><li> Kultur Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 unter Bedingungen befeuchtet. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Das Ziel dieser Technik ist, um lebensfähige Krebszellen aus dem Blut von Krebspatienten zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden, um Krebszellen in Kultur zu identifizieren; eine notwendige Überprüfung des Gerätes Erfolg. Wir haben uns entschieden, Zellen in Kultur mit Antikörper gegen epitheliale Einheiten, wie EpCAM (epithelialen zelluläre Adhäsionsmolekül) oder PSMA (Prostata-spezifisches Membran-Antigen) zu färben, zusätzlich zu DAPI, um intakte Zelle Kerne (Abb. 2 und 3) zu identifizieren. Die Anzahl der Krebszellen aufgenommen unter Verwendung dieser Technik ist notwendigerweise eine Funktion der Anzahl von CTC in der Ausgangsprobe und Patienten-Schwankung kann hoch sein. Bei der Verarbeitung von Patienten mit Krebs diagnostiziert Stadium IV getroffen, wir routinemäßig zu erfassen zwischen 100 und 500 Zellen pro Röhrchen Krebs von Blut, mit einer Reinheit&gt; 50%. Unmittelbar nach der Isolierung, kann eine größere Anzahl von kontaminierenden Leukozyten vorhanden sein. Allerdings sind diese Zahlen werden nach Inkubation in Kulturmedium für bis zu 5 Tage abgereichert werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung des funktionalisierten Mikroröhrchen für CTC Isolation, zeigt Selektin-vermittelte Rollen durch Antikörper-vermittelte statische Haftung gefolgt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Daten von CTC Isolierung aus Blutproben aus einer Brustkrebs-Patienten und einem Patienten mit Lungenkrebs gezeichnet. Die Zahl der lebensfähigen Zellen als positiv identifiziert CTC auf EpCAM-Färbung bezogen wird durch die festen Stäbe und beziehen sich auf die linke Ordinate und der Prozentsatz der Zellen, die identifiziert wurden dargestellt, wie CTC der Gesamtzahl der gefangenen Zellen im Vergleich wird durch die offene Balken dargestellt und gemessen auf der rechten Ordinate. Die Ergebnisse werden nach fünf Tagen in Kultur. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter Aufnahmen von verschiedenen Spendern (A und B) von CTC in Kultur 5 Tage im Anschluss an isolatiauf von einem Krebspatienten Blutprobe. Die Zellen wurden bei EpCAM Fluoreszenz mit AlexaFluor 488 (grün) und 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt, um den Kern (blau) zu visualisieren.

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
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</ol>

MRK ist ein wissenschaftlicher Berater CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

Es ist oft der Fall, dass die frühen Schritte in der Entdeckung neuer Krebstherapien nutzen Krebszelllinien, die fragwürdig Ähnlichkeit mit primären Krebszellen tragen, bleiben doch in Handhabung durch ihre einfache Handhabung im Labor. Forschung in die Entwicklung neuer Krebstherapien, würde beschleunigt, wenn primären humanen Krebszellen früh im Roman Forschung genutzt würden. CTC sind die am leichtesten zugängliche Art der Krebszelle, die aufgrund ihrer Präsenz im Blut und der Leichtigkeit einer Standard-Blutprobe. Darüber hinaus repräsentieren zirkulierende Tumorzellen ein notwendiger Schritt im Prozess der Metastasierung 5,6, so dass ihre Relevanz für die Krankheit und Dienstprogramm für die Ausrichtung neuer Medikamente ist klar. Isolierung von CTC von Blut in vitro ist aufgrund ihrer geringen Konzentrationen kompliziert: in der Größenordnung von einem pro Million Leukozyten oder eines Erythrozyten pro Milliarde 7. Die Mehrheit der aktuellen Methoden zum Nachweis von CTC im Blut, darunter die einzige FDA-zugelassene Technik Zelle<html> Suchen (Veridex), beschädigen oder zerstören Zellen bei der Erkennung Prozess, unter Ausschluss der Verwertung außerhalb Enumeration. Das oben beschriebene Verfahren nicht beeinträchtigt die Lebensfähigkeit der Zellen und damit öffnet die Tür für zukünftige klinische Forschung über Krebs. Da die Wiederherstellung von intakten Zellen ist das Ziel dieser Technik ist es unerlässlich, dass Zellen mit Vorsicht behandelt werden, vor allem während Blut Trennschritte. Es gibt eine Reihe von einstellbaren Parametern in diesem System, verändert werden, um verbesserte Ausbeute in Abhängigkeit von kritischen Merkmalen wie Krebs-Typ erreicht werden könnte. In den oben beschriebenen Schritten, haben wir entschieden, EpCAM als CTC-spezifischen Antikörper für alle Krebsarten außer bei der Verarbeitung von Prostatakrebs-Proben verwendet werden, wobei anti-PSMA verwendet wurde. Weitere Substitutionen von Krebs-spezifische Antikörper kann sicher verwendet werden, um die Leistung für den einzelnen Patienten zu verbessern. Darüber hinaus können Selektin und Antikörper-Konzentrationen verändert werden, um Capture 8 zu verbessern. &quot;&gt; Ein wesentliches Merkmal der Vorrichtung ist der Einbau von E-Selektin-Moleküle auf der Oberfläche. E-Selektin wird in der Regel auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen und Funktion von sich schnell bewegenden Leukozyten zu einer Entzündung rekrutiert ausgedrückt. Fließenden Leukozyten zu binden, um transient Selektin-Moleküle, was zu einem langsameren, Abrollverhalten, die langsamer und stärkeren Bindung der Zellen an das Endothel durch Integrine erleichtert. eindeutig nachweisen existiert, die den Fall, dass CTC kann durch einen ähnlichen Mechanismus 9,10 extravasieren. Die Einbeziehung von Selektin auch kann das Gerät bei größeren Flussraten betrieben werden, Preise erzielen, die sonst verhindern Zellen, die aus der Bindung an Antikörper 11 wäre. So ist unser Gerät ahmt ein physiologisch Venole zu erfassen biomimetisch fließenden CTC ohne zugleich zellulären Verletzungen. Verbesserte Leistung der Vorrichtung kann die Zugabe des Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung auf der luminalen Oberfläche zurückzuführender Vorrichtung. Frühere Studien haben gezeigt, dass es drei Hauptkomponenten der Nanoröhrchen-Beschichtung, die für eine verbesserte Funktionalität ermöglicht. Erstens stellt die Nanoröhrchen-Beschichtung eine vergrößerte Oberfläche, was eine größere Proteinablagerung auf die Oberfläche 4. Zweitens wird bei der Durchführung Rasterkraftmikroskopie auf der Nanoröhrchen-Beschichtung haben wir festgestellt, dass die einzelnen Nanoröhren von der Oberfläche in die Strömung ragen. Dies ermöglicht Selektin-Moleküle bis zu einem Mikrometer über der Oberfläche präsentiert werden, so dass Zellen aufnehmen können und eingestellt, um die Oberfläche weiter oben in ihrer Flugbahn durch das Rohr 4. Schließlich ist der Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung in der Lage, die Adhäsion von Leukozyten zu verhindern und Verteilen auf der Oberfläche, so dass für eine reduzierte Anzahl von Leukozyten zusammen mit dem CTC erfasst und somit eine größere Reinheit nachfolgenden CTC 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td></tr><tr><td> 300 um ID Schlauch </td><td> Braintree Scientific </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Größere Rohre für die Verbindung mit Spritze </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> 5ml-Spritze für die Pumpe </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Anschluss-Schlauch klein bis groß </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Anschluss-Schlauch zu großen Spritze </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> F-120 und P-659 </td></tr><tr><td> Spritze für Mikroröhre (3/10cc Insulinspritze U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Zzgl. </td><td> GE Heilenthcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Puffer EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Protein G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Menschliche Antikörper EpCAM/TROP-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA-Antikörper (GCP-04) </td><td> Abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96-Well-Platten (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Grade Blocker fettfreie trockene Milch, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Halloysit-Nanoröhren </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Calcium Carbonate, 5g </td><td> Aldrich Chemie </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI-Medium 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin 0,1% w / v in Wasser </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modell 100 </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Atlanta Biochemikalien </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin </td><td> Sigma Leben Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

schnelle isolierung von lebensfähigen zirkulierende tumorzellen von patientenblutproben

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Zirkulierender Tumorzellen (CTC) sind Zellen, die aus einem Primärtumor durch das Kreislaufsystem zu verbreiten und das kann letztlich bilden sekundäre Tumoren an entfernten Stellen. CTC Zählung kann zur Progression der Erkrankung über die Korrelation zwischen CTC-Konzentration im Blut und der Schwere der Erkrankung ein Basis folgen werden. Als Bearbeitungswerkzeug, konnte CTC im Labor, um persönliche Therapien zu entwickeln studiert werden. Zu diesem Zweck ist die Isolierung zu CTC keine Zellschädigung und Kontamination durch andere Zelltypen, insbesondere Leukozyten zu bewirken, muss so weit wie möglich 2 vermieden werden. Viele der aktuellen Techniken, darunter die einzige FDA-zugelassene Gerät für CTC-Enumeration, zerstören CTC als Teil des Isolations-Prozess (für weitere Informationen vgl. Rz. 2). Mikrofluidische Vorrichtung, um lebensfähige CTC erfassen beschrieben, bestehend aus einer Oberfläche mit E-Selektin-Glykoprotein neben Antikörpern gegen epitheliale Marker 3 funktionalisiert. Um Geräte-Performance steigernfunktion sollten eine Nanopartikel-Beschichtung wurde von Halloysit-Nanoröhren, ein Aluminosilikat Nanopartikel aus Ton 4 geerntet angewandte bestehend. Die E-Selektin-Moleküle stellen ein Mittel, um sich schnell bewegende CTC, die durch das Gerät gepumpt werden und verleiht ein Vorteil gegenüber alternativen mikrofluidischen Bauteilen, bei längeren Bearbeitungszeiten sind notwendig, um Zielzellen mit genügend Zeit, um mit einer Oberfläche interagieren zu erfassen. Die Antikörper gegen epitheliale Ziele vorgegeben werden CTC-Spezifität zu dem Gerät, sowie eine leicht einstellbare Parameter, um eine Isolation zu stimmen. Schließlich ermöglicht die Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung deutlich verbesserte Isolation zu anderen Techniken, indem sich schnell bewegenden Zellen einzufangen, Bereitstellen vergrößerte Oberfläche für die Proteinadsorption und Abwehr von Leukozyten, 3,4 verglichen. Dieses Gerät ist durch eine einfache Technik unter Verwendung von Off-the-shelf Materialien hergestellt, und wurde erfolgreich eingesetzt, um Krebszellen aus dem Blut von metastasierendem erfassenKrebspatienten. Captured Zellen werden für bis zu 15 Tage in Kultur nach der Isolierung gehalten wird, und diese Proben bestehen typischerweise aus&gt; 50% lebensfähig primären Krebszellen von jedem Patienten. Dieses Gerät wurde verwendet, um lebensfähig CTC sowohl aus verdünntem Vollblut und Buffy-Coat-Proben zu erfassen. Schließlich präsentieren wir eine Technik, mit der Funktionalität in einer klinischen Umgebung, um persönliche Krebstherapien zu entwickeln.

Zirkulierender Tumorzellen aus dem Blut von Krebspatienten ohne zugleich Zellschäden isoliert. Isolierung von Tumorzellen wird unter Verwendung eines bimolekularen Oberfläche von E-Selektin neben Antikörpern gegen epitheliale Marker. Ein Nanoröhrchen-Beschichtung fördert gezielt Krebs Zelladhäsion was zu hohen Reinheiten Gefangennahme.

Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

Zirkulierende Tumorzellen (CTC) sind Zellen, die von einem Primärtumor über das Kreislaufsystem disseminieren und letztendlich sekundäre ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebensfähige zirkulierende Tumorzellen aus Blutproben zu isolieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Isolations-Mikroröhrchen, anschließend isolieren Sie die Buffy Coat-Fraktion aus den Blutproben. Danach wird die Buffy Coat-Fraktion durch die funktionalisierte Mikroröhrchenvorrichtung verarbeitet.Isolieren Sie die gewonnenen Zellen aus dem Mikroröhrchen und kultivieren Sie sie weiter, indem Sie ein Gerät verwenden, das physiologisch eine Venenumgebung nachahmt, um strömende CTCs biomimetisch zu erfassen, ohne die Zellen zu schädigen. Diese Technik bietet eine funktionelle Anwendung im klinischen Umfeld zur Entwicklung personalisierter Krebstherapien. Die wichtigsten Vorteile sind, dass es sich um eine einfache Methode handelt, die allgemein verfügbare Materialien nutzt, und dass sie den natürlichen, in Blutgefäßen ablaufenden Prozess der Feststoffgewebebildung nachbildet.Ich bin Mike King, außerordentlicher Professor für biomedizinische Technik an der Cornell University. Das Verfahren wird von Jeff Madison demonstriert, einem leitenden Techniker aus meinem Labor. Der folgende Protokollablauf dient der Herstellung eines einzelnen Mikrorohrgeräts: Geben Sie 250 Mikroliter einer 6,6 %igen Halo-Site-Nanorohrlösung in ein Gefäß und behandeln Sie die Lösung 30 Sekunden lang im Ultraschallbad. Kühlen Sie die Lösung währenddessen mit kaltem Wasser.Nach einer zweiten Sonifikation wird die Lösung in eine Spritze aufgezogen. Die Lösung wird durch einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter in ein sauberes Mikrogefäße umgewirbelt. Die Halosit-Nanoröhren-Lösung wird gelegentlich vortexiert.Um die Homogenität aufrechtzuerhalten, beschaffen Sie einen 50 Zentimeter langen Abschnitt Mikro-Rehan-Mikroschlauch. Schneiden Sie den Mikroschlauch-Einlass schräg ab und führen Sie ein Ende des Mikroschlauchs in ein kleines IDEXX-Adapterstück ein, während Sie eine Spritzenkanüle in das andere Ende des Mikroschlauchs einführen. Um den Mikroschlauch zu reinigen, stellen Sie das offene Ende des Mikroschlauchs in 70 % Ethanol und ziehen etwa 50 Mikroliter Ethanol in die Spritze, um den Mikroschlauch zu füllen und das Ethanol aus dem Mikroschlauch herauszuspülen.Ziehen Sie eine großzügige Menge destilliertes Wasser in die Spritze. Trennen Sie nun die Spritze vom Mikroröhrchen, leeren Sie die Spritze und verbinden Sie sie erneut mit dem Mikroröhrchen. Ziehen Sie 50 µL einer 0,02 Gewicht pro Volumen-Lösung auf.Polyol-Lysin in das Mikroröhrchen geben und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend 100 Mikroliter gefilterte Nanoröhrchen-Lösung in das Mikroröhrchen aufziehen und drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zum Spülen der Nanoröhrchen-Lösung 100 Mikroliter Wasser durch das Mikroröhrchen aufziehen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren, danach 50 Mikroliter PBS durch das Mikroröhrchen aufziehen, gefolgt von 50 Mikrolitern 10 Mikrogramm pro Milliliter.Lösung von Protein G 90 Minuten bei Raumtemperatur anpassen. Anschließend 50 Mikroliter einer Lösung mit fünf Mikrogramm pro Milliliter E-Selectin-IgG und 50 Mikrogramm pro Milliliter Antikörperlösung in das Mikroröhrchen pipettieren. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren und unspezifische zelluläre Adhäsion mit 5 % Milchprotein blockieren.Danach PBS bei Raumtemperatur inkubieren, bis die Blut- oder Buffy-Coat-Proben 10 Minuten vor der Verwendung des Mikroröhrchens zur Zellisolierung bereit sind. 50 Mikroliter kalziumgesättigtes PBS in eine heparinisierte Röhre ziehen, um die Selektinmoleküle zu aktivieren. Eine 10-Milliliter-Blutprobe von einem Patienten zur Lymphozytenisolierung entnehmen.Geben Sie 10 Milliliter Fol-Pack-Lösung in eine 50-Milliliter-Zentrifugenrobe. Vorsichtig darauf die 10 Milliliter Vollblutprobe zentrifugieren bei 2000 × g für 15 Minuten bei 4 °C mit minimaler Verzögerung. Danach die Buffy-Coat-Schicht in ein neues Röhrchen überführen.Waschen Sie die Büffelcoat-Fraktion mit PBS und zentrifugieren Sie, um die Erythrozyten zu lysieren. Lösen Sie die Zellpellets vorsichtig in einem Milliliter RBC-Lysepuffer auf und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend 10 Milliliter hinzufügen.PBS vorsichtig mischen und Gaumenzellen durch Zentrifugation. Die Zellen vorsichtig in PBS plus unter Verwendung von IDEXX-Adaptern resuspendieren. Ein Ende des funktionalisierten Mikroröhrchens an eine Fünf-Milliliter-Spritze anschließen.Befestigen Sie die Spritze an einer Spritzenpumpe und tauchen Sie das offene Ende des funktionalisierten Mikroröhrchens in die Zellprävention ein. Leiten Sie die Zellsuspension durch das Mikroröhrchen, um nicht gebundene und locker gebundene Zellen zu entfernen. Überführen Sie das offene Ende des Mikroröhrchens in ein Röhrchen, das PBS plus enthält.Ziehen Sie 300 Mikroliter PBS zusätzlich in die Spritze auf. Stellen Sie danach das offene Ende des Mikroröhrchens in ein sauberes Röhrchen. Trennen Sie die Spritze vom Mikroröhrchen und setzen Sie eine Spritze mit Puffer an, um vorsichtig den Puffer durchzupressen, um das Mikroröhrchen zu füllen.Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur einen Spritze mit einem Milliliter Wachstumsmedium anschließen, die Mikroröhre perfundieren und das Ablaufmedium in geeignetem Gewebe sammeln. Die Kulturplatten zur Kultivierung weiterverarbeiten. Die isolierten Zellen, zirkulierende Tumorzellen, wurden nach fünf Tagen aus Blutproben einer Brustkrebspatientin und eines Lungenkrebspatienten isoliert.In Kultur. Diese Präparationen wurden hinsichtlich der CTC-Aufnahme anhand der Färbung für das epitheliale Zellmolekül Epican charakterisiert, und die Reinheit der Kernaufnahme wurde als Prozentsatz der als CT C identifizierten Zellen im Verhältnis zur Gesamtanzahl der aufgefangenen Zellen berechnet. Dieses Bild zeigt repräsentative Mikroaufnahmen von CTCs, die von Spendern A und B isoliert wurden. Nach fünf Tagen in Kultur wurden die Zellen fluoreszent mit EPAM und Alexa Fluor 4 88 gefärbt.Die Kerne wurden durch DPI-Färbung sichtbar gemacht. Nach diesem Verfahren können lebensfähige Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) und Kulturen verwendet werden, um patientenspezifische Informationen wie Arzneimittelempfindlichkeit oder die Expression von Zellmarkern zu erhalten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg.

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Biotechnik

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen aus der Vollblutprobe eines euthanasierten kolorektalen Tumormausmodells. Diese isolierten CTCs können kultiviert und für die vorgesehene Downstream-Analyse verwendet werden.

CTC-Isolierung aus einer Vollblutprobe: Eine Methode zur Gewinnung von CTCs aus dem Modell des murinen Darmkrebses

Es wurde gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen (CTCs) eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung spielen. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Isolierung und Vermehrung von CTCs aus dem Vollblut eines syngenen Maustumormodells der Metastasierung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) beschrieben.

Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Ein Protokoll , ein Poly (N iso-propylacrylamid) (PIPAAm) beschichtet Mikro für effektive Erfassung und thermoresponsive Freisetzung von lebenden zirkulierenden Tumorzellen (CTC) präsentiert zu nutzen. Diese Methode ermöglicht Erfassung von CTC aus dem Blut des Patienten und die anschließende Freisetzung von lebensfähigen CTC für Downstream-Off-Chip-Kultur, Analysen und Charakterisierung.

Erfassung und Veröffentlichung durchführbare zirkulierender Tumorzellen aus Blut

Wir beschreiben die Etablierung von orthotopen kolorektalen Tumoren durch Injektion von Tumorzellen oder Organoiden in den Cecum von Mäusen und die anschließende Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus diesem Modell.

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Dieses Protokoll ist zu erholen und molekulare genetische Charakterisierung der Ebene der einzelligen seltene Zielzellen aus einer Mischung mit Nichtziel-hintergrundzellen vorbereiten. DNA-Qualität entspricht nicht behandelten Einzelzellen und einzellige Anwendung (sowohl Screening basiert und gezielte Analyse) ermöglicht.

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Hier stellen wir einen integrierten Workflow vor, um phänotypische und molekulare Merkmale zu identifizieren, die zirkulierende Tumorzellen (CTCs) charakterisieren. Wir kombinieren Live-Immunfärmonierung und robotische Mikromanipulation einzelner und gruppierter CTCs mit einzelnen zellbasierten Techniken zur nachgelagerten Analyse und Bewertung der Metastasisis-Sägefähigkeit.

Mikromanipulation von zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Molekulare Analyse und die metastasierende Potenzialbewertung

Die Kultivierung von CTCs ermöglicht eine tiefere funktionelle Charakterisierung von Krebs, unter anderem durch die Untersuchung der spezifischen Markerexpression und die Bewertung der Arzneimittelresistenz und der Fähigkeit, die Leber zu besiedeln. Insgesamt könnte die CTC-Kultur ein vielversprechendes klinisches Werkzeug für die personalisierte Medizin sein, um das Patientenergebnis zu verbessern.

Zirkulierende Tumorzelllinien: ein innovatives Werkzeug für die Grundlagen- und Translationsforschung

Dieser Artikel beschreibt die Anwendung automatisierter Geräte zur einfachen und effizienten Trennung und Sammlung von Substanzen, wie z. B. zellfreier DNA und zirkulierenden Tumorzellen, aus Vollblut.

Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben

Der klinische Mikrofluidik-Chip ist eine wichtige biomedizinische Analysetechnik, die die Vorverarbeitung klinischer Patientenblutproben vereinfacht und zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in situ auf dem Chip immunfluoreszent färbt, was den schnellen Nachweis und die Identifizierung eines einzelnen CTC ermöglicht.

Klinische Mikrofluidik-Chip-Plattform zur Isolierung vielseitig zirkulierender Tumorzellen

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind entscheidend für die Untersuchung des Fortschreitens und der Metastasierung von Krebs. In diesem Artikel wird ein integriertes Protokoll mit hohem Durchsatz für die CTC-Anreicherung und die Einzel-CTC-Sequenzierung vorgestellt, das die Abscheidungseffizienz und CTC-Reinheit verbessert und gleichzeitig die Kontaminations- und Sequenzierungskosten senkt und so die Präzisionsonkologieforschung und klinische Anwendungen voranbringt.

Mikrofluidik-basierte Hochdurchsatz-Sortierung von zirkulierenden Tumorzellen und Einzelzellsequenzierungstechnologie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Isolierung seltener Krebszellen aus einer künstlichen Probe mit Vollblut und Spitzen in Lungenkrebszellen veranschaulicht. Das Protokoll nutzt eine halbautomatisierte, labelfreie Zellisolationsplattform. Angereicherte Zellen werden anschließend mittels Tropfen-Digital-PCR auf Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors untersucht.

Profilierung von DNA-Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in zirkulierenden seltenen Zellen mittels eines Zellisolationssystems und der digitalen PCR des Tröpfchens

Erfahren Sie die Isolierung lebensfähiger zirkulierender Tumorzellen aus Patientenblutproben mit funktionalisierten Mikroröhrchen. Diese Methode ermöglicht schonende Zellgewinnung für personalisierte Krebstherapien.

Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

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