Name: Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Erfahren Sie eine neue Methode zur Analyse neuronaler Mikroschaltkreise im Zentralnervensystem mittels trans-synaptischem Virus und TVA-Rezeptor-Spezifität. Diese Hochdurchsatz-Technik ermöglicht präzises Tracing synaptisch verbundener Neuronen.

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Wir möchten Sean Whelan zur Unterstützung bestätigen Sie mit Rettung rekombinanten VSV Varianten und Didem Goz und Ryan Chrenek für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von HHMI (CLC) unterstützt, und # NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Verwendung von Viren zu studieren neuronalen Schaltkreise ist eine relativ hohe Durchsatzleistung Verfahren zum Analysieren angeschlossenen Neuronen. Allerdings Erzeugung sowohl VSV und RABV Virionen ist nicht trivial. Obwohl die obige Protokoll zur Rettung Virus aus cDNA aufgeführten vorgesehen ist, ist es immer noch ein geringer Wahrscheinlichkeit Ereignis. Die Niveaus von jedem der N, P, und L Plasmide müssen fein eingestellt werden, und viele Studien und repliziert müssen getan, um virale Rettungs gewährleisten. Die...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Zellkultur&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Baby-Hamster-Nierenzellen (BSRT7)</td><td>auf Anfrage erhältlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia (vTF7-3)</td><td>auf Anfrage erhältlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pN, pP, pl-Plasmide</td><td>erhältlich auf Anfrage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-Zellen</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60-mm-TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Rechteckige schräg abgesetzte Zellkulturschale mit belüftetem Verschluss</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Medium: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, pH 7,4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Spritze: 5-ml-Luer-Lock-Spritze</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: Linearer PEI mit hoher Wirksamkeit</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Viruszentrifugation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Corning 150 ml Tube Top Vakuumfilter-System, 0,45 &amp;mu;m Pore</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall, ultraklar, 38,5 ml, 25 x 89 mm Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>SW28-Ultrazentrifugenrotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Mausinjektion&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kapillare Mikropipetten</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxie</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Ump-Injektor</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Vierkanal-Mikrocontroller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>M.TXB Tischmotor mit C.EMX-1 Drehzahlregelung, 115 Volt</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>H.10 Handstück, Schnellwechsel</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Schrittbohrer, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopie&amp;#8211;Elektrodenhalter</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>1-ml-Spritze</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadel, 30 Gauge</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Schutz-Augensalbe</td><td>Doctors Foster und Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Chirurgische und Dissektionswerkzeuge&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Standardpinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Springer-Scheren</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellerklingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Nähte</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Dissizierung und Antikörperfärbung&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Eselserum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Antikörper&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Esel-anti-Huhn-Dylight 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Esel-anti-Huhn Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Einbettung von Gewebe&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Superfrost-plus-Mikroskopobjektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 22 x 22, 0 Dicke</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Silikonelastomer</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Klarer Nagellack</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

viral tracing von genetisch definierten neural circuitry

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Klassische Methoden zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise sind ziemlich geringen Durchsatz. Transsynaptische Viren, insbesondere das Pseudorabiesvirus (PRV) und Tollwutvirus (RABV) und neuerdings vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV), eine Schaltung zur Untersuchung, wird immer beliebter. Diese höheren Durchsatz Methoden verwenden Viren, die zwischen den Neuronen entweder in der anterograde oder retrograde Richtung übertragen. Kürzlich wurde eine modifizierte RABV für monosynaptischen retrograden Tracing entwickelt. (Abbildung 1A). Bei diesem Verfahren wird das Glycoprotein (G)-Gen aus dem viralen Genom gelöscht und wieder zugeführt nur in gezielter Neuronen. Infektion Spezifität wird durch Substituieren eines chimären G, der extrazellulären Domäne des ASLV-A Glykoprotein und die zytoplasmatische Domäne des RABV-G (A / RG) zusammengesetzt ist, für die normale RABV-G 1 gelöst. Dieses chimäre G gezielt infiziert Zellen, die den TVA-Rezeptor-1. Das Gen kodiert TVA kann schon delivered durch verschiedene Verfahren 2-8. Nach RABV-G Infektion einer TVA-exprimierenden Neuronen, kann die RABV zu anderen, synaptisch verbundenen Neuronen in retrograder Richtung von der Natur des eigenen G, die mit dem Rezeptor TVA zusammen geliefert war zu übertragen. Diese Technik kennzeichnet eine relativ große Anzahl von Eingängen (5-10%) 2 auf einem definierten Zelltyp, Bereitstellen eines Probenahme von allen Eingängen auf einen definierten Starter Zelltyp. Wir haben vor kurzem diese Technik, um VSV als transsynaptische Tracer 9 verwenden modifiziert. VSV hat mehrere Vorteile, einschließlich der Schnelligkeit der Genexpression. Hier haben wir ausführlich eine neue virale Tracing-System mit VSV nützlich für das Sondieren Mikrotechnik mit erhöhter Auflösung. Während die ursprünglich veröffentlichten Strategien Wickersham et al. 4 und Beier et al. 9 Erlaubnis Beschriftung bei allen Neuronen, projizieren eingangs infiziert TVA-exprimierenden-Zellen, hier VSV dazu entworfen wurde, um nur zu übertragen, um TVA-exprimierenden Zellen (Abb. 1B). Das Virus wird zuerst mit RABV-G pseudotypisiert zur Infektion von Neuronen hinter TVA-exprimierenden Neuronen ermöglichen. Nach der Infektion dieses ersten Population von Zellen, das Virus freigesetzt nur infizieren TVA-exprimierenden Zellen. Weil die transsynaptische viralen Ausbreitung auf TVA-exprimierenden Zellen, die Anwesenheit von Abwesenheit von Konnektivität von definierten Zelltypen beschränkt wird dann mit hoher Auflösung untersucht werden. Eine experimentelle Flußdiagramm dieser Versuche ist in Abbildung 2 gezeigt. Hier zeigen wir, ein Modell-Schaltung, dass der Richtungswechsel-Selektivität bei der Maus Netzhaut. Wir untersuchen die Konnektivität starburst Amakrinzellen (SAC) an retinalen Ganglienzellen (RGZ).

Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Klassische Methoden zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise weisen einen recht geringen Durchsatz auf. Transsynaptische Viren, insbesondere das Pseudowut- (PRV) und das Tollwutvirus ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine neue Technik zur Analyse der Mikroschaltkreise im zentralen Nervensystem zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Population von Neuronen definiert wird, die durch die Expression des TVA-Rezeptors für eine Infektion präpariert wird. Im zweiten Schritt wird das transsynaptische Virus in das ZNS injiziert, wodurch die primären Zielneuronen infiziert werden.Anschließend breitet sich das Virus nur transsynaptisch auf verbundene Neuronen aus, die den TVA-Rezeptor exprimieren. Um zu überprüfen, ob diese Neuronen miteinander verbunden sind, werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass diese Technik zur Analyse von Mikroschaltkreisen verwendet werden kann, basierend auf der Validierung der Markierung bekannter verbundener Mikroschaltkreise. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektrophysiologie und der Mikroskopie besteht darin, dass sie eine Hochdurchsatzmethode zur Analyse neuronaler Schaltkreise darstellt.Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir die erste Studie zur monosynaptisch beschränkten viralen Tracing-Methode von Wickersham und Kollegen lasen. Wir waren der Ansicht, dass Viren weiter modifiziert werden könnten, um verbundene Neuronen auf neuartige Weise zu untersuchen. Weitere Einzelheiten zur Rekonstitution von VSV aus cDNA mithilfe des Vaccinia-T7-Systems zur Generierung von Zellen für die Passagierung finden Sie im schriftlichen Protokoll.VSV saugt zunächst das Medium von vier 80 % konfluenten 10-Zentimeter-Platten mit TV800-Zellen, die am Vortag gepflanzt wurden, ab und ersetzt es durch fünf Milliliter unsupplementiertes DMEM. Transfizieren Sie jede Platte mit fünf Mikrogramm des Plasmids, das das gewünschte Glykoprotein kodiert, gemäß Standardverfahren. Ersetzen Sie das Medium etwa sechs Stunden nach der Transfektion durch DMEM, das mit 10 % FBS supplementiert ist, und inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator bei 34 °C mit 5 % Kohlendioxid, um die Expression und Oberflächenakkumulation des Glykoproteins zu ermöglichen.Nach der Inkubation das Medium abziehen und durch fünf Milliliter DMEM mit 10 % FBS ersetzen, dann jede Platte mit VSV, das das MA-Rabies-G-Chimären-Glykoprotein enthält, bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01 bis 0,1 infizieren und über Nacht bei 34 Grad Celsius inkubieren. 24 Stunden später die Infektionsgrade jeder Platte mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüfen. Wenn mehr als 50 % der Zellen infiziert wurden, das Medium sammeln.Ersetzen Sie durch fünf Milliliter frisches Medium und frieren Sie das gesammelte Medium bei minus 80 Grad Celsius ein. Wiederholen Sie den Sammelvorgang 24 Stunden später für drei Tage, insgesamt vier Tage lang. Nachdem das letzte Aliquot vollständig bei minus 80 Grad Celsius eingefroren ist, frieren Sie jedes Aliquot des gesammelten Mediums ein, obwohl sich alle gesammelten Medium-Aliquots zu diesem Zeitpunkt bei 37 Grad Celsius befinden; es sollten 80 Milliliter gesammeltes Medium vorhanden sein, das durch 0,45-Mikrometer-Filter auf Eis filtriert wurde.Anschließend aliquotieren Sie 36 Milliliter des Virus in ein Beckman-Zentrifugenröhrchen und konzentrieren das Überstand durch Ultrazentrifugation bei 80.000 ×g für 90 Minuten bei vier Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass der Rotor nach der Zentrifugation ordnungsgemäß ausbalanciert ist, zählen Sie in ein Gefäß mit 10 % Bleiche und verwenden Sie einen Aspirator, um die Flüssigkeit von der Röhrenwand zu entfernen. Danach schütteln Sie die Röhrchen mit dem Virus eine Stunde lang bei 120 U/min bei vier Grad Celsius und resuspendieren das virale Pellet in einem möglichst kleinen Volumen, das gewöhnlich etwa 30 Mikroliter beträgt.Einmal, wenn das Virus resuspendiert ist, titrieren Sie das Virus, indem Sie eine 24-Well-Platte mit 293T-Zellen mit einer Verdünnungsreihe im Verhältnis 1 zu 1 Million in zehnfacher Verdünnung infizieren und etwa zwei Tage nach der Infektion titrieren. Gemäß Standardverfahren können virusinfizierte Zellen durch Fluoreszenz nachgewiesen werden. Es ist wichtig, die korrekte Molinie für diese Experimente zu verwenden.Das Ziel besteht darin, den TVA-Rezeptor in den Zelltypen exprimiert zu haben, in die man eingrenzen möchte. Dies kann durch die Expression des TVA-Rezeptors mittels viraler Methoden oder über ein transgenes Allel erreicht werden. Dieses Experiment verwendet sechs bis zehn Wochen alte triple transgene Mäuse.Mäuse, die ein bedingtes TVA-Allel exprimieren, werden mit Mäusen, die ein chat-, Cree-Allel exprimieren, gekreuzt. Anschließend wurden diese Mäuse mit einer Linie gekreuzt, die ein fluoreszierendes TD-Tomato-Allel exprimiert. Die endgültige transgene Maus exprimiert TVA und ein bedingtes TD-Tomato-Allel in allen Zellen, die Cree exprimieren, einschließlich der interessierenden sternförmigen Omikronzellen.Und diese Expression kann mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Überprüfen Sie die stereotaktischen Koordinaten für das Zielgebiet in einem Mausgehirn-Atlas und bereiten Sie das stereotaktische Gerät vor, indem Sie den Mikroinjektor-Controller einschalten und den Kolben sowie den Elektrohalter in Position bringen. Danach füllen Sie die Kanüle mit Inertöl auf, um eine Grenzfläche zum Virus zu schaffen, und setzen die Kanüle auf den Kolben, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Luftblasen in der Kanüle befinden.Entnehmen Sie das Virus und stellen Sie es auf Eis. Stellen Sie den Mikroinjektor auf Rückzug ein und bewegen Sie das Röhrchen mit dem Virus unterhalb der Kapillare des Mikroinjektors. Senken Sie die Spitze der Kapillare in das Virus ein und ziehen Sie die für das Experiment erforderliche Menge Virus auf.Nach der Gabe einer präoperativen Dosis Buprenorphin wird das Tier gemäß den institutionellen Richtlinien angemessen anästhesiert. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch und stellen Sie sicher, dass die Reflexantwort fehlt. Vor Beginn des Eingriffs.Platzieren Sie die anästhetisierte Maus auf eine Heizplatte, die auf einem beweglichen Ständer befestigt ist, um die Maus zu positionieren. Tragen Sie Augensalbe auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, während das Tier anästhesiert ist. Platzieren Sie die Maus nun vorsichtig, indem Sie die Ohrstifte in den Gehörgang einführen, in die stereotaktische Vorrichtung.Stellen Sie sicher, dass der Kopf parallel zur Basis des Stereomikroskops ausgerichtet ist und sich nicht seitlich bewegt. Passen Sie anschließend den Bisssteg an, um den Kopf zu stabilisieren. Entfernen Sie das Fell im Bereich des Einschnitts.Anschließend diesen Bereich dreimal mit Ethanol und danach dreimal mit Jod spülen. Nachdem mit einer Schere ein sagittaler Schnitt in die Haut gemacht wurde, um den Schädel freizulegen, wird die Haut mit selbstgebauten chirurgischen Haken zurückgezogen. Danach die Mikrokapi­lle mit bgma auffüllen und mithilfe der Einstellknöpfe den Mikroinjektor zu den Koordinaten für den Nucleus geniculatus lateralis bewegen.Nachdem das LGN lokalisiert wurde, bohren Sie ein kleines Loch in den Schädel über der Injektionsstelle. Positionieren Sie die Kapillare über dem Loch und senken Sie sie langsam bis knapp dorsal zur Gehirnoberfläche ab. Dies ist die Nullposition der dorsoventralen Koordinate.Die Mikrokappe sollte scharf genug sein, um die Mausdura zu durchstoßen. Senken Sie sie daher langsam auf eine Tiefe von 2,75 Millimetern ab und injizieren Sie die erforderliche Menge Virus mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 Litern pro Minute. Lassen Sie die Nadel etwa sieben Minuten lang im Gehirn, um die Diffusion des Virus aus der Injektionsstelle zu ermöglichen und zu verhindern, dass das Virus entlang der Nadel aufsteigt.Ziehen Sie die Nadel dann über einen Zeitraum von zwei Minuten sehr langsam zurück, heben Sie die Nadel aus der Injektionsstelle und aus dem Gehirn heraus. Verschließen Sie abschließend die Operationsstelle mit einer Naht und überwachen Sie die Tiere, bis sie sich von der Anästhesie erholt haben. Verabreichen Sie Buprenorphin alle 12 Stunden über zwei Tage hinweg.Im Allgemeinen kann die transsynaptische Ausbreitung von VSV etwa 24 Stunden nach der Injektion beobachtet werden. Längere Wartezeiten führen jedoch zu einer stärkeren Ausbreitung. Nach der Tötung der Maus durch Einatmen von Kohlendioxid das Auge herausschneiden und in 4 % Formaldehyd geben, dann eine Stunde lang inkubieren, wobei sichergestellt werden muss, dass das Auge vollständig untergetaucht bleibt.Überführen Sie dann das Auge in eine Petrischale mit PBS. Entfernen Sie mit einer Nr. 55-Pinzette schnell die Hornhaut und lösen und dissezieren Sie die Netzhaut von anderen Geweben. Die Ganzpräparatanalyse.Schneiden Sie die Netzhaut auf einem Objektträger derart, dass sie flach aufliegt. Plazieren Sie Silikonabstandshalter um die Ränder des Objektträgers, bedecken Sie diese mit langanhaltendem Gold-Montagemedium und decken Sie sie anschließend mit einem Deckglas mit Null-Dicke ab, um Netzhautschnitte zu analysieren. Geben Sie die Netzhaut in 30 % Saccharose in PBS, bis die Netzhaut untertaucht.Dann die Retina in eine Mischung aus OCT und 30 %iger Saccharoslösung im Verhältnis 1:1 für drei Stunden geben. Schließlich die Retina schnell einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie zum Schneiden bereit ist. Dieses Bild zeigt einen zeitlichen Verlauf eines Experiments, das die Infektiosität von TVA 800-Zellen und 293T-Zellen durch VSV-A/rg demonstriert.Die oberen Bilder zeigen TVA 800 Zellen sechs Stunden, einen Tag und zwei Tage nach der Infektion. Die unteren Bilder zeigen 2 9 3 T Zellen zu den gleichen Zeitpunkten. Das Virus breitet sich zwischen TVA-exprimierenden Zellen innerhalb weniger Stunden aus, während die Ausbreitung auf 2 9 3 T Zellen, die den TVA-Rezeptor nicht exprimieren, obwohl sie stattfindet, deutlich langsamer verläuft.Die Maßstabsleiste entspricht 100 Mikrometern. Dieses Bild zeigt eine repräsentative Infektion von retinalen Ganglienzellen bei Mäusen ohne TVA-Expression. Die Tiere wurden mit dem VSV-A/RG-Virus in den LGN injiziert.Pseudo-infiziert mit R-A-B-V-G und das Gewebe wurde zwei Tage nach der Injektion entnommen. Hier ist eine schwache Infektion zu sehen, wobei die retinalen Ganglienzellen durch den gelben Pfeil markiert sind. Dieses Bild zeigt eine dichtere Infektion.Dies kann mit einem höheren Infektiositätstiter des Virus und einer Injektion guter Qualität erreicht werden, wie hier gezeigt. Verschiedene Typen retinaler Ganglienzellen können anhand ihrer Morphologie identifiziert werden, einschließlich kleiner verzweigter Ganglienzellen, melanopsinhaltiger Ganglienzellen vom Typ eins, richtungsselektiver Ganglienzellen oder DS-GCs sowie on-off-DS-GCs. Die Maßstabsleiste entspricht hier 50 Mikrometern, wie in den folgenden Bildern von einer TVA-exprimierenden Maus zu sehen.Die VSVA-slash-RG-Übertragung von On-Off-DS-GCs zu Starburst-Omics folgt dem erwarteten Muster. Die mit weißem Pfeil markierten On-Off-DS-GCs, die grün gefärbt sind, übertragen das Virus auf mehrere Starburst-Omics, die durch gelbe Pfeile gekennzeichnet sind. Wie hier zu sehen ist, tragen alle grünen Zellen, die keine DS-GCs sind, zusätzlich das Cre-Reporter-Gen, was darauf hinweist, dass es sich um TVA-exprimierende Starburst-Omics handelt.Die durch weiße Pfeilspitzen mit grüner Füllung gekennzeichneten DS-GCs und die durch gelbe Pfeilspitzen markierten Sternchen-Omics, die die entsprechenden Schichten der inneren plexiformen Schicht der Retina oder IPL stratifizieren, umfassen die Zellen, an die das Virus übertragen wird, sowohl On- als auch Off-Zellen. Sternchen-Omicron. Die Zahlen in dieser Abbildung zeigen die Schichten des IPL an. Sobald der Vorgang beherrscht ist, kann das gesamte Experiment in ein oder zwei Tagen durchgeführt werden, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird.Die Geschwindigkeit von VSV ist einer der Hauptvorteile nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie die Verwendung von Channelrhodopsin zur abbildungsbasierten Schaltkreismapping können durchgeführt werden, um die virale Schaltkreisverfolgung zu validieren und die Eigenschaften dieser synaptischen Verbindungen zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die meisten verschiedenen Schritte der viralen Schaltkreisverfolgung haben – von der Virusvermehrung über die In-vivo-Injektion bis hin zur Analyse fluoreszenzmarkierter Neuronen.

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Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

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Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

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Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

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