Name: Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Erfahren Sie eine neue Methode zur Analyse neuronaler Mikroschaltkreise im Zentralnervensystem mittels trans-synaptischem Virus und TVA-Rezeptor-Spezifität. Diese Hochdurchsatz-Technik ermöglicht präzises Tracing synaptisch verbundener Neuronen.

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Wir möchten Sean Whelan zur Unterstützung bestätigen Sie mit Rettung rekombinanten VSV Varianten und Didem Goz und Ryan Chrenek für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von HHMI (CLC) unterstützt, und # NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Verwendung von Viren zu studieren neuronalen Schaltkreise ist eine relativ hohe Durchsatzleistung Verfahren zum Analysieren angeschlossenen Neuronen. Allerdings Erzeugung sowohl VSV und RABV Virionen ist nicht trivial. Obwohl die obige Protokoll zur Rettung Virus aus cDNA aufgeführten vorgesehen ist, ist es immer noch ein geringer Wahrscheinlichkeit Ereignis. Die Niveaus von jedem der N, P, und L Plasmide müssen fein eingestellt werden, und viele Studien und repliziert müssen getan, um virale Rettungs gewährleisten. Die...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Zellkultur&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Baby-Hamster-Nierenzellen (BSRT7)</td><td>auf Anfrage erhältlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia (vTF7-3)</td><td>auf Anfrage erhältlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pN, pP, pl-Plasmide</td><td>erhältlich auf Anfrage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-Zellen</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60-mm-TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Rechteckige schräg abgesetzte Zellkulturschale mit belüftetem Verschluss</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Medium: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, pH 7,4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Spritze: 5-ml-Luer-Lock-Spritze</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: Linearer PEI mit hoher Wirksamkeit</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Viruszentrifugation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Corning 150 ml Tube Top Vakuumfilter-System, 0,45 &amp;mu;m Pore</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall, ultraklar, 38,5 ml, 25 x 89 mm Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>SW28-Ultrazentrifugenrotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Mausinjektion&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kapillare Mikropipetten</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxie</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Ump-Injektor</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Vierkanal-Mikrocontroller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>M.TXB Tischmotor mit C.EMX-1 Drehzahlregelung, 115 Volt</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>H.10 Handstück, Schnellwechsel</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Schrittbohrer, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopie&amp;#8211;Elektrodenhalter</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>1-ml-Spritze</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadel, 30 Gauge</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Schutz-Augensalbe</td><td>Doctors Foster und Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Chirurgische und Dissektionswerkzeuge&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Standardpinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Springer-Scheren</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellerklingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Nähte</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Dissizierung und Antikörperfärbung&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Eselserum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Antikörper&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Esel-anti-Huhn-Dylight 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Esel-anti-Huhn Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;Einbettung von Gewebe&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Superfrost-plus-Mikroskopobjektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 22 x 22, 0 Dicke</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Silikonelastomer</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Klarer Nagellack</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

viral tracing von genetisch definierten neural circuitry

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Klassische Methoden zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise sind ziemlich geringen Durchsatz. Transsynaptische Viren, insbesondere das Pseudorabiesvirus (PRV) und Tollwutvirus (RABV) und neuerdings vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV), eine Schaltung zur Untersuchung, wird immer beliebter. Diese höheren Durchsatz Methoden verwenden Viren, die zwischen den Neuronen entweder in der anterograde oder retrograde Richtung übertragen. Kürzlich wurde eine modifizierte RABV für monosynaptischen retrograden Tracing entwickelt. (Abbildung 1A). Bei diesem Verfahren wird das Glycoprotein (G)-Gen aus dem viralen Genom gelöscht und wieder zugeführt nur in gezielter Neuronen. Infektion Spezifität wird durch Substituieren eines chimären G, der extrazellulären Domäne des ASLV-A Glykoprotein und die zytoplasmatische Domäne des RABV-G (A / RG) zusammengesetzt ist, für die normale RABV-G 1 gelöst. Dieses chimäre G gezielt infiziert Zellen, die den TVA-Rezeptor-1. Das Gen kodiert TVA kann schon delivered durch verschiedene Verfahren 2-8. Nach RABV-G Infektion einer TVA-exprimierenden Neuronen, kann die RABV zu anderen, synaptisch verbundenen Neuronen in retrograder Richtung von der Natur des eigenen G, die mit dem Rezeptor TVA zusammen geliefert war zu übertragen. Diese Technik kennzeichnet eine relativ große Anzahl von Eingängen (5-10%) 2 auf einem definierten Zelltyp, Bereitstellen eines Probenahme von allen Eingängen auf einen definierten Starter Zelltyp. Wir haben vor kurzem diese Technik, um VSV als transsynaptische Tracer 9 verwenden modifiziert. VSV hat mehrere Vorteile, einschließlich der Schnelligkeit der Genexpression. Hier haben wir ausführlich eine neue virale Tracing-System mit VSV nützlich für das Sondieren Mikrotechnik mit erhöhter Auflösung. Während die ursprünglich veröffentlichten Strategien Wickersham et al. 4 und Beier et al. 9 Erlaubnis Beschriftung bei allen Neuronen, projizieren eingangs infiziert TVA-exprimierenden-Zellen, hier VSV dazu entworfen wurde, um nur zu übertragen, um TVA-exprimierenden Zellen (Abb. 1B). Das Virus wird zuerst mit RABV-G pseudotypisiert zur Infektion von Neuronen hinter TVA-exprimierenden Neuronen ermöglichen. Nach der Infektion dieses ersten Population von Zellen, das Virus freigesetzt nur infizieren TVA-exprimierenden Zellen. Weil die transsynaptische viralen Ausbreitung auf TVA-exprimierenden Zellen, die Anwesenheit von Abwesenheit von Konnektivität von definierten Zelltypen beschränkt wird dann mit hoher Auflösung untersucht werden. Eine experimentelle Flußdiagramm dieser Versuche ist in Abbildung 2 gezeigt. Hier zeigen wir, ein Modell-Schaltung, dass der Richtungswechsel-Selektivität bei der Maus Netzhaut. Wir untersuchen die Konnektivität starburst Amakrinzellen (SAC) an retinalen Ganglienzellen (RGZ).

Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Klassische Methoden zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise weisen einen recht geringen Durchsatz auf. Transsynaptische Viren, insbesondere das Pseudowut- (PRV) und das Tollwutvirus ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine neue Technik zur Analyse der Mikroschaltkreise im zentralen Nervensystem zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Population von Neuronen definiert wird, die durch die Expression des TVA-Rezeptors für eine Infektion präpariert wird. Im zweiten Schritt wird das transsynaptische Virus in das ZNS injiziert, wodurch die primären Zielneuronen infiziert werden.Anschließend breitet sich das Virus nur transsynaptisch auf verbundene Neuronen aus, die den TVA-Rezeptor exprimieren. Um zu überprüfen, ob diese Neuronen miteinander verbunden sind, werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass diese Technik zur Analyse von Mikroschaltkreisen verwendet werden kann, basierend auf der Validierung der Markierung bekannter verbundener Mikroschaltkreise. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektrophysiologie und der Mikroskopie besteht darin, dass sie eine Hochdurchsatzmethode zur Analyse neuronaler Schaltkreise darstellt.Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir die erste Studie zur monosynaptisch beschränkten viralen Tracing-Methode von Wickersham und Kollegen lasen. Wir waren der An

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir bieten eine praktische Anleitung für die Bereitstellung von...

Revealing Neural Circuits Topographie in Multi-Color

Transsynaptisches Tracing ist zu einem mächtigen Werkzeug für die Analyse zentraler Efferenten geworden, die periphere Ziele durch multisynaptische Schaltkreise regulieren. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das das transsynaptische Pseudotollwutvirus ausnutzt, um einen funktionsfähigen Gehirnschaltkreis zu identifizieren und zu lokalisieren, gefolgt von klassischen Traktverfolgungstechniken, um spezifische Verbindungen im Schaltkreis zwischen identifizierten Gruppen von Neuronen zu validieren.

Transsynaptische Tracing von Peripherie Targets mit Pseudorabies-Virus durch Cholera Toxin und biotinyliertes Dextran Amine Doppelmarkierung Gefolgt

Unter Ausnutzung einer binären genetischen Strategie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verfolgung neuronaler Schaltkreise in Mäusen zur Verfügung, die komplementäre transsynaptische Tracer nach Cre-vermittelter Rekombination exprimieren. Da die zellspezifische Tracerproduktion genetisch kodiert ist, ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung des embryonalen Gehirns von Mäusen mit einer Einzelzellauflösung...

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das auf der Verwendung von lentiviralen Partikeln zur langfristigen genetischen Modifikation von neuralen Stammzellen und/oder ihren benachbarten ependymalen Zellen in der adulten ventrikulär-subventrikulären neurogenen Nische basiert und die getrennte Analyse von zellautonomen und nicht-autonomen, nischenabhängigen Effekten auf neurale Stammzellen ermöglicht.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion selektiver neuronaler Populationen, etikettiert folgende retrograden Infektion mit einem modifizierten Tollwutvirus Fluoreszenzmarker exprimieren, und unabhängig, unvoreingenommen Clusteranalysen, umfassende Charakterisierung der morphologischen Metriken unter verschiedene neuronale Subklassen ermöglichen.

Großflächige Rekonstruktionen und Independent, Unvoreingenommene Clustering Basierend auf Morphologische Metriken Klassifizieren Neurons in Selective Populations

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Dieses Protokoll zielt darauf ab, direkt umprogrammierte Interneuronen in vivo zu erzeugen, indem ein AAV-basiertes Virussystem im Gehirn und ein FLEX synapsingesteuerter GFP-Reporter verwendet werden, der die Zellidentifikation und weitere Analyse in vivo ermöglicht.

In Vivo Direkte Reprogrammierung von Resident Glial Cells in Interneurons durch Intracerebral Injection of Viral Vectors

Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.

Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Erfahren Sie eine neue Methode zur Analyse neuronaler Mikroschaltkreise im Zentralnervensystem mittels trans-synaptischem Virus und TVA-Rezeptor-Spezifität. Diese Hochdurchsatz-Technik ermöglicht präzises Tracing synaptisch verbundener Neuronen.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

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