Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Das Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie die Lysosomen von zwei Probenarten – Mausembryonen und differenzierten Stammzellen – mit einem Lyo-Tracker-Farbstoff stabilisiert werden können, um Muster des Zelltods nachzuweisen. Zur Vorbereitung der Embryoproben werden Embryonen zunächst chirurgisch isoliert und in eine Petrischale gegeben, um differenzierte Zellen vorzubereiten. Embryonale Stammzellen werden zur Erzeugung von Embryoidkörpern verwendet.

Diese Embryoidkörper werden in Suspension kultiviert und anschließend als Monolayer auf einer Kammerplatte gezüchtet. Der gesamte Zellmonolayer der Embryonen kann in Ot Tracker Rot inkubiert werden, danach werden die Proben gespült, fixiert und anschließend fotografiert, um die Färbungsergebnisse zu untersuchen und zu quantifizieren, die Liso Tracker zeigen. Die Färbung ist ein einfaches Verfahren, das zur Untersuchung des programmierten Zelltods in Embryonen und kultivierten Zellen verwendet werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Tunnel-Analyse liegt darin, dass, da die OT-Tracker-Farbstoffe kleine Moleküle sind, dickes Gewebe schnell und einfach untersucht werden kann. Obwohl diese Methode Einblicke in die Muster des programmierten Zelltods in Maus-Embryonen und differenzierten Kulturen ermöglicht, kann sie auch auf andere Gewebetypen wie Hühnerembryonen und differenzierende adulte Stammzellen angewendet werden. Paaren Sie junge weibliche Mäuse mit einem Zuchtmännchen und überprüfen Sie an den folgenden Morgen auf einen Vaginalpfropfen, der angibt, dass die Paarung stattgefunden hat.

Mittags zu dem Tag, an dem der Vaginalpfropfen erscheint, entspricht effektiv 0,5 Tage. Nach der Empfängnis am gewünschten embryonalen Tag euthanasieren Sie das Weibchen gemäß genehmigter Protokolle und entfernen den Uterus in eine 10 cm große Petrischale mit Hank's BSS, um jegliches Blut abzuspülen. Trennen Sie die Embryonen und entfernen Sie sie aus dem Uterus.

Entfernen Sie die extraembryonalen Membranen und waschen Sie mindestens einmal mit Hank's BSS, um überflüssige Gewebe und Blut zu entfernen. Halten Sie die präparierten Embryonen während der Reinigung auf Eis. Die anderen.

Bereiten Sie fünf Milliliter Liso-Tracker-Embryofärbungslösung vor. Dieses Volumen reicht für eine oder zwei Embryosammlungen aus. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, um den Farbstoff zu verteilen, geben Sie anschließend die Embryonen in die Lösung und inkubieren Sie sie 45 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation die Embryonen vorsichtig viermal mit Hank's BSS spülen, wobei jede Waschung fünf Minuten dauert. Es ist wichtig, die Spülgänge sanft durchzuführen, um das Gewebe nicht zu beschädigen. Die Flüssigkeit entfernen, dabei langsam und sorgfältig darauf achten, wo sich die empfindlichen Embryonen befinden, und stets einen Teil der Flüssigkeit zurücklassen, der sie bedeckt.

Danach die Embryonen am nächsten Tag über Nacht in 4 % Paraformaldehyd fixieren. Die Embryonen einmalig 10 Minuten lang in Hank's BSS spülen, um das Fixativ zu entfernen. Anschließend die Gewebe durch eine Methanolreihe dehydrieren, um Hintergrundfärbungen zu eliminieren.

Dieser Schritt verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis während der Bildgebung vor der Lagerung. Falls erforderlich, entnehmen Sie von jedem Embryo eine Gewebeprobe zur genetischen Analyse. Rehydrieren Sie die Gewebeprobe später vor der Genotypisierung.

Trennen Sie die Embryonen in einzelne Röhrchen, die mit den Gewebeproben übereinstimmende Etiketten tragen. Nun können die isolierten Embryonen unbegrenzt bei minus 20 Grad Celsius in Methanol gelagert werden. Lichtgeschützt.

Beginnen Sie mit der Herstellung von Embryoidkörpern nach der Hängetropfen-Methode. Bei einer Startdichte von 500 Zellen pro 20-Mikroliter-Tropfen übertragen Sie die Embryoidkörper nach drei Tagen in Suspensionkulturen auf 10 cm großen nicht-adhärenten Petrischalen. Kultivieren Sie sie fünf Tage lang, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt wird, beginnend nach fünf Tagen.

Übertragen Sie die Embryoidkörper auf gelatinierte Acht-Kammerobjektträger, wobei ein oder zwei Embryoidkörper pro Kammer platziert werden. Kultivieren Sie die Embryoidkörper weitere 10 Tage. Wechseln Sie nach 10 Tagen alle zwei Tage das Medium, aspirieren Sie vorsichtig das vorhandene Medium und geben Sie 300 Mikroliter Lyo-Tracker-Zellfärbungslösung zu jeder Kammer hinzu.

Achten Sie darauf, das Medium vorsichtig manuell abzusaugen, indem Sie die Pipettenspitze in die Ecke der Kammer platzieren. Auf diese Weise entfernen Sie versehentlich nicht die noch andockenden Zellen von der Glasoberfläche. Wenn Sie das Medium erneut hinzufügen, stellen Sie die Pipettenspitze erneut in die Ecke der Kammer und geben Sie das Medium sehr langsam zurück.

Inkubieren Sie die Kammer bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Anschließend spülen Sie sie zweimal mit DPBS, jeweils fünf Minuten pro Spülgang. Fixieren Sie die Zellen nun 15 Minuten bei Raumtemperatur in 4 % Paraldehyd.

Entfernen Sie anschließend das Fixiermittel durch zwei fünfundzwanzigminütige Spülungen mit DPBS. Um die Embryonen zu montieren, legen Sie sie in eine Vertiefungsscheibe aus Glas oder einen kleinen Petrischalen-Infektionsschutz. Bereiten Sie die Zellproben für die Mikroskopie vor, indem Sie das DPBS abpipettieren.

Entfernen Sie die Kammer vom Objektträger und lassen Sie sie etwa fünf Minuten lang an der Luft trocknen. Decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab, um den Farbstoff vor Licht zu schützen. Geben Sie dann ein wässriges Eindeckmedium wie Vector Shield mit DAPI hinzu und legen Sie einen Deckgläser auf.

Jetzt ist die Probe auf dem Objektträger befestigt und bereit zur Bildgebung. Visualisieren Sie die Proben mit einem Stereomikroskop oder einem auflichtmikroskopischen Aufbau, der mit einem Rodamin-, DAPI- oder Texas-Red-Filter ausgestattet ist. Die Färbung ist typischerweise sehr intensiv, sodass lange Belichtungszeiten im manuellen Modus in der Regel nicht erforderlich sind.

Machen Sie digitale Fotos aller Proben unter identischen Belichtungsbedingungen. Öffnen Sie die Bilder zur Quantifizierung in Adobe Photoshop oder einem ähnlichen Bildbearbeitungsprogramm. Wählen Sie zum Bestimmen der Menge an Lyo-Tracer-Färbung den Rotkanal aus.

Notieren Sie die Pixelanzahl für das gesamte Bild, wie sie von der Histogrammfunktion angezeigt wird. Schwellen Sie anschließend das Bild so, dass die rote Färbung nun durch weiße Pixel dargestellt wird. Dadurch wird das Bild in Schwarzweiß umgewandelt.

Wählen Sie einen Schwellenwert und verwenden Sie diesen für alle Bilder im Datensatz. Wählen Sie die weißen Pixel mithilfe des Farbbereichs-Werkzeugs aus und nutzen Sie die Histogrammfunktion, um die Gesamtanzahl der weißen Pixel zu ermitteln. Verwenden Sie den blauen Kanal, um die Anzahl der Kerne im Bildfeld zu zählen.

Es kann sinnvoll sein, die Zählung durch Anmerkungen am Bild zu dokumentieren, die Werte zu erfassen und zur Berechnung der durchschnittlichen Färbungsintensität pro Zelle zu verwenden. Wiederholen Sie diese Analyse mit denselben Schwellenwerten für alle verbleibenden Bilder. Zum Probieren wurde Ly o Tracker verwendet, um sonic hedgehog-Mutanten-Embryonen anzufärben.

Da Ly O Tracker ein kleines, hochdiffusibles Molekül ist, waren Bereiche im Inneren des Mesenchyms eines gesamten Embryos, die bei 10,5 Tagen post coitum gefärbt wurden, stark von programmiertem Zelltod oder PCG betroffen, insbesondere in den Gliedmaßen und bestimmten anderen Regionen. Gliedmaßenanlagen wurden in Ganzpräparaten bei höherer Vergrößerung abgebildet, um das Gesamtmuster zu beurteilen. Dissektierte Teile wurden außerdem mit einem vibrierenden Mikrotom geschnitten.

Der Pfeil zeigt auf eine verstärkte Färbung in der distalen Spitze des sonic hedgehog-Null-Mutationsgewebes in Schnitten, die mit einem Kryostaten erhalten wurden. Die Tunnel-Färbung wurde in Verbindung mit OT Tracker in diesen Schnitten verwendet, obwohl keine strikte Eins-zu-eins-Korrelation zwischen Lyo Tracker und Tunnel-Färbung besteht, überlappen sich die allgemeinen Bereiche der programmierten Zelltod (PCD) unter höherer Vergrößerung erheblich. Es ist möglich, Punktionen zu erkennen, die positiv im Tunnel-Assay gefärbt sind, jedoch nicht im Otra-Die-Punktionen, die nur mit dem Lyra-Die gefärbt sind, sowie Punktionen mit überlappenden Färbungen. Nach 10 Tagen Kultur von Embryonalzellen differenzierten sich die Zellen in eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Muskelzellen und Kardiomyozyten.

Bei der normalen Kultur differenzierter ES-Zellen gibt es einige Zellen, die eine programmierte Zelltod (PCD) durchlaufen haben, wie durch Lyo-Tracker- und TUNEL-Assays nachgewiesen wurde. Anschließend wurden die Zellen mit Wasserstoffperoxid behandelt, um einen oxidativen Stress und Zelltod zu induzieren. Eine geringe Dosis Wasserstoffperoxid erhöhte sowohl die Lyo-Tracker- als auch die TUNEL-Färbung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.

Ähnlich wie bei den Ergebnissen im Embryo färbten beide Farbstoffe gemeinsame und einzigartige Zellen an. Eine hohe Dosis Wasserstoffperoxid führte zu einer Schrumpfung der Zellen sowie zu einer stärkeren und weitverbreiteten Positivität für OT-Tracker und TUNEL. Zum Vergleich wurde eine Serumverarmung angewendet, um nach einer Stunde Serumverarmung die Autophagie auszulösen.

Die OT-Tracker-Färbung nahm zu. Allerdings blieb die Tunnel-Positivität auf normalem Niveau. Daher ist es wichtig, nachfolgend zusätzliche Assays durchzuführen, um festzustellen, ob die Färbung Apoptose oder Autophagie widerspiegelt, obwohl reer einfach und nützlich ist, nachdem die Proben quantifiziert wurden.

Mit der zuvor gezeigten einfachen Photoshop-Methode wurde bestätigt, dass eine Erhöhung der Konzentration von Wasserstoffperoxid zu einer stärkeren Lys-Tracker-Färbung führt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann dieser Färbeprozess bei korrekter Durchführung innerhalb von weniger als zwei Stunden abgeschlossen werden. Andere Methoden wie NX in fünf oder LC3-Immunfärbung können durchgeführt werden, um den Zelltodtyp zu bestätigen. Beachten Sie, dass Trecker Green derzeit nur bei lebenden Zellen funktioniert, sodass Reca Red die beste Wahl für Proben ist, die fixiert werden müssen.