Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Das Ziel des folgenden Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie die Lysosomen von zwei Arten von Proben, Mausembryonen und differenzierten Stammzellen, mit Lyo-Tracker-Farbstoff erhalten werden können, um Muster des Zelltods zu erkennen. Um Embryonenproben vorzubereiten, werden die Embryonen zunächst chirurgisch isoliert und in eine Schale gelegt, um differenzierte Zellen vorzubereiten. Embryonale Stammzellen werden verwendet, um Embryokörper zu erzeugen.

Diese Embryokörper werden in Suspension kultiviert und dann als Monoschicht auf einem Objektträger gezüchtet. Die Embryonen, die alle Monolayer verkaufen, können in ot tracker red inkubiert werden und werden dann gespült und fixierte Proben können dann fotografiert werden, um die Färbeergebnisse zu untersuchen und zu quantifizieren, die Liso Tracker zeigen. Die Färbung ist ein einfaches Verfahren, mit dem der Zelltod von Embryonen und kultivierten Zellen getestet werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Tunnelanalyse besteht darin, dass dickes Gewebe schnell und einfach untersucht werden kann, da es sich bei dem OT-Tracker-Farbstoff um ein kleines Molekül handelt. Obwohl diese Methode Einblicke in Muster des programmierten Zelltods in Mausembryonen und differenzierten Kulturen geben kann, kann sie auch auf andere Gewebetypen wie Hühnerembryonen und differenzierende adulte Stammzellen angewendet werden. Verpaaren Sie junge weibliche Mäuse mit einem Rüden und suchen Sie am nächsten Morgen nach einem Vaginalpfropfen, der darauf hinweist, dass die Paarung stattgefunden hat.

Der Mittag des Tages, an dem der Vaginalpfropfen erscheint, beträgt effektiv 0,5 Tage. Nach dem Cotus am embryonalen Tag des Interesses, euthanasieren Sie das Weibchen gemäß den genehmigten Protokollen und entfernen Sie die Gebärmutter in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit Hank's BSS und spülen Sie jegliches Blut ab. Trennen Sie die Embryonen und entfernen Sie sie aus der Gebärmutter.

Entfernen Sie die überschüssigen embryonalen Membranen und spülen Sie mindestens einmal mit Hank's BSS, um Fremdgewebe und Blut zu entfernen. Halten Sie die präparierten Embryonen während der Reinigung auf Eis. Die anderen.

Bereiten Sie fünf Milliliter Liso tracker Embryo-Färbelösung vor. Dies ist ein ausreichendes Volumen für eine oder zwei Embryoentnahmen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, um den Farbstoff gleichmäßig zu verteilen, dann übertragen Sie die Embryonen in die Lösung und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Spülen Sie die Embryonen nach der Inkubation viermal vorsichtig für jeweils fünf Minuten in Hank's BSS aus. Es ist wichtig, die Spülungen vorsichtig durchzuführen, um das Gewebe nicht zu beschädigen. Entfernen Sie die Flüssigkeit, achten Sie langsam genau darauf, wo sich die empfindlichen Embryonen befinden, und lassen Sie immer einen Teil der Flüssigkeit zurück, um sie zu bedecken.

Fixieren Sie die Embryonen dann am nächsten Tag über Nacht in 4%para Formaldehyd. Spülen Sie die Embryonen einmal 10 Minuten lang in Hank's BSS, um das Fixiermittel zu entfernen. Dehydrieren Sie nun das Gewebe durch eine Methanolreihe, um Hintergrundflecken zu vermeiden.

Dieser Schritt verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis während der Bildgebung vor der Speicherung. Entnehmen Sie bei Bedarf von jedem Embryo eine Gewebeprobe für die genetische Analyse. Rehydrieren Sie später die Gewebeprobe vor der Genotypisierung.

Trennen Sie die Embryonen in einzelne Röhrchen mit Etiketten, die zur Gewebeprobe passen. Nun ist es möglich, die isolierten Embryonen unbegrenzt in Methanol von minus 20 Grad Celsius zu lagern. Geschützt vor Licht.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Embryokörper mit der Hanging Drop-Methode. Mit einer Ausgangsdichte von 500 Zellen pro 20 Mikroliter Tropfen nach drei Tagen werden die Embryokörper in Suspensionskulturen auf 10 Zentimeter großen, nicht anhaftenden Petrischalen überführt. Kultivieren Sie sie fünf Tage lang, wobei das Medium nach fünf Tagen alle zwei Tage gewechselt wird.

Übertragen Sie die Embryokörper auf gelatinierte Objektträger mit acht Kammern, wobei ein oder zwei Embryokörper in jede Kammer gelegt werden. Kultivieren Sie die Embryokörper für weitere 10 Tage. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag nach 10 Tagen, saugen Sie das vorhandene Medium vorsichtig an und geben Sie 300 Mikroliter Lyo tracker Zellfärbelösung in jede Kammer.

Achten Sie darauf, das Medium manuell herauszupipettieren, indem Sie die Pipettenspitze in die Ecke der Kammer legen. Auf diese Weise entfernen Sie nicht versehentlich die und befestigen immer noch jeden Körper an der Glasoberfläche. Wenn Sie das Medium wieder hinzufügen, platzieren Sie die Pipettenspitze in der Ecke der Kammer und geben Sie das Medium sehr langsam wieder ein.

Inkubieren Sie die Kammern 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie sie dann zweimal fünf Minuten pro Spülgang mit DPBS aus. Fixieren Sie nun die Zellen für 15 Minuten bei Raumtemperatur in 4%Paraldehyd.

Entfernen Sie dann das Fixiermittel mit DPBS in zwei fünfminütigen Spülgängen. Um die Embryonen zu montieren, legen Sie sie in einen tiefen Vertiefungsglasobjektträger oder einen kleinen Petrischale-Infektionsschutzschild. Bereiten Sie die Zellproben für die Mikroskopie vor, indem Sie das DPBS aspirieren.

Nehmen Sie die Kammer aus dem Objektträger und lassen Sie sie etwa fünf Minuten lang an der Luft trocknen. Mit Folie abdecken, um den Schneeflur zu schützen. Fügen Sie dann ein wässriges Eindeckmedium wie z.B. Vector Shield mit Dappy hinzu und legen Sie einen Deckglas darauf.

Nun ist der Objektträger montiert und bereit für die Bildgebung. Visualisieren Sie die Proben mit einem Präparier- oder Verbundmikroskop, das mit einem Stab-, Domine- oder Texas-Rotfilter ausgestattet ist. Die Färbung ist in der Regel recht hell, so dass lange Belichtungszeiten im manuellen Modus in der Regel nicht erforderlich sind.

Machen Sie digitale Fotos von allen Proben unter den gleichen Belichtungsbedingungen. Um die Bilder zu quantifizieren, öffnen Sie sie in Adobe Photoshop oder einem ähnlichen Bildbearbeitungsprogramm. Um die Menge der Lyo-Tracker-Flecken zu bestimmen, wählen Sie den roten Kanal aus.

Notieren Sie sich die Pixelzahl für das gesamte Bild, wie sie durch die Histogrammfunktion angezeigt wird. Nächster Schwellenwert, das Bild so, dass die rote Färbung jetzt durch weiße Pixel dargestellt wird. Dadurch wird das Bild in Schwarzweiß umgewandelt.

Wählen Sie einen Schwellenwert aus und verwenden Sie diesen Wert für alle Bilder im Set. Wählen Sie die weißen Pixel mit dem Farbbereichswerkzeug aus und verwenden Sie die Histogrammfunktion, um die Gesamtanzahl der weißen Pixel zu erhalten. Verwenden Sie den blauen Kanal, um die Anzahl der Kerne im Feld zu zählen.

Es kann nützlich sein, die Zählung aufzuzeichnen, indem Sie das Bild mit Anmerkungen versehen, die Werte aufzeichnen und sie zur Berechnung des durchschnittlichen Färbegrades pro Zelle verwenden. Wiederholen Sie diese Analyse mit der gleichen Schwellenwerteinstellung für alle verbleibenden Bilder. Zur Probenahme wurde ly o tracker verwendet, um Sonic Hedgehog mutierte Embryonen zu färben.

Da ly O tracker ein kleines, hoch diffundierbares Molekül ist, waren die Bereiche tief in der Mitte eines ganzen Embryos, wie er 10,5 Tage nach dem Cotus gefärbt wurde, der programmierte Zelltod oder PCG in Sonic Hedgehog nullmutierten Embryonen stark erhöht, insbesondere in den Extremitäten und so auch in den Regionen. Die Knospen der Gliedmaßen wurden in Lochhalterungen bei höherer Vergrößerung abgebildet, um das Gesamtmuster zu beurteilen. Präparierte Teile wurden ebenfalls mit einem vibrierenden Mikroton geschnitten.

Die Pfeilspitze deutet auf eine erhöhte Färbung in der schalldistalen Hedgehog-Nullspitze in Schnitten hin, die mit einem Kryostaten erhalten wurden. In diesen Schichten wurde eine Tunnelfärbung in Verbindung mit OT Tracker verwendet, obwohl es keine strikte Eins-zu-Eins-Korrelation zwischen Lyo-Tracker und Tunnelfärbung gibt, überlappen sich die allgemeinen Bereiche der PCD erheblich unter höherer Vergrößerung. Es ist möglich, eine Punktion zu sehen, die mit dem Tunnelassay positiv gefärbt wurde, aber nicht die Otra-Stanzpunktion, die nur mit dem Lyra-Stempel färbt, und die Punktion, die eine überlappende Färbung aufweist. Nach 10 Tagen embryonaler Körperkultur differenzierten sich die Zellen in eine Vielzahl von Zelltypen, darunter Neuronen, Muskelzellen und Kardiomyozyten.

In der normalen Kultur differenzierter ES-Zellen gibt es einige Zellen, die einer PCD unterzogen wurden, wie mit Lyo-Tracker- und Tunnel-Assays nachgewiesen wurde. Als nächstes wurden die Zellen mit Wasserstoffperoxid behandelt, um den Tod der oxidativen Stresszellen zu induzieren. Eine niedrige Dosis Wasserstoffperoxid erhöhte sowohl die Lyo-Tracker- als auch die Tunnelfärbung im Vergleich zu keiner Behandlung.

Ähnlich wie bei den Ergebnissen im Embryo markierten beide Färbungen gemeinsame und einzigartige Zellen. Eine hohe Dosis Wasserstoffperoxid führte zu einer Zellschrumpfung und einer weiter verbreiteten OT-Tracker- und Tunnelpositivität. Zum Vergleich wurde Serummangel verwendet, um die Autophagie nach einer Stunde Serummangel zu induzieren.

Die Verfärbung des OT-Trackers nahm zu. Die Tunnelpositivität blieb jedoch auf einem normalen Niveau. Obwohl reer einfach und nützlich ist, ist es wichtig, nach der Quantifizierung der Proben zusätzliche Assays durchzuführen, um festzustellen, ob die Färbung Apoptose oder Autophagie darstellt.

Unter Verwendung der zuvor gezeigten einfachen Photoshop-Methode bestätigten die Ergebnisse, dass eine Erhöhung der Konzentrationen von Wasserstoffperoxid zu einer höheren Lys-Tracker-Färbung führte. Einmal gemeistert, kann dieses Färbeverfahren in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Andere Methoden wie NX in der Fünf- oder Skalen-Immunfärbung können durchgeführt werden, um die Art des Zelltods zu bestätigen. Vergessen Sie nicht, dass Trecker Green derzeit nur bei lebenden Zellen wirkt, daher ist Reca Red die beste Option für Proben, die fixiert werden müssen.