Name: Herstellung Drosophila Central Neuronen In situ Patch Clamping (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Flugmotorneuronen für Patch-Clamp-Aufzeichnungen in situ. Diese Methode nutzt GFP-Tagging und Protease-Behandlung zur Entfernung von Trümmern und Tracheen.

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<ol><li>Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+genomic+and+complementary+DNA+from+Shaker%2C+a+putative+potassium+channel+gene+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.</a> Science. 237, 749-753 (1987).</li>
<li>Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+a+probable+potassium+channel+component+encoded+at+Shaker+locus+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila.</a> Science. 237, 770-775 (1987).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (6), e248(2007).</li>
<li>Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2-type+calcium+channels+encoded+by+cac+regulate+AP-independent+neurotransmitter+release+at+cholinergic+synapses+in+adult+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain.</a> J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).</li>
<li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).</li>
<li>Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+the+voltage-gated+sodium+channel+DmNav+regulates+activation%2C+inactivation%2C+and+persistent+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current.</a> J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).</li>
<li>Worrell, J. W., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+voltage-dependent+Ca2%2B+currents+in+identified+Drosophila+motoneurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ.</a> J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).</li>
<li>Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+differences+in+firing+properties+and+potassium+currents+in+Drosophila+larval+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons.</a> J. Neurophysiol. , (2011).</li>
<li>Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+identified+motor+neurons+in+the+Drosophila+third+instar+larva+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system.</a> J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).</li>
<li>Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike+integration+and+cellular+memory+in+a+rhythmic+network+from+Na%2B%2FK%2B+pump+current+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics.</a> Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).</li>
<li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS Biol. 4, e63(2006).</li>
<li>Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+elongation+and+dendritic+branching+are+affected+separately+by+different+forms+of+intrinsic+motoneuron+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.</a> J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).</li>
<li>Ryglewski, S., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaker+and+Shal+mediate+transient+calcium-independent+potassium+current+in+a+Drosophila+flight+motoneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.</a> J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).</li>
<li>Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2+Channels+Mediate+LVA+and+HVA+Calcium+Currents+in+Drosophila+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons.</a> J. Physiol. , (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Koenig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+identification+of+the+motor+neurons+innervating+the+dorsal+longitudinal+flight+muscle+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Preparation+of+the+Adult+Drosophila+Ventral+Nerve+Cord+for+Giant+Fiber+Dye+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection.</a> J. Vis. Exp. (52), e3080(2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wenn die Visualisierung der Zellen, die mit fluoreszierenden Proteinen wie GFP, ist es wichtig, nicht zu stark freizulegen die Herstellung zu viel Licht. Dies kann im Foto führen. Wir verwenden 100W HBO Kurzbogen Quecksilberbirnen für die Beleuchtung, und nutzen wir auch neutrale Dichte (ND) von 0,8 (Chroma ND-Filter 0,3 und 0,5). Um die Qualität des Reinigungsprozesses gute Sichtbarkeit beurteilen ist entscheidend. Daher kann ND-Filter für kurze Zeiträume von etwa 20 s für mehrere Male entfernt werden. <p class="jo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agent / Artikel </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Protease Typ XIV </td><td> Sigma Aldrich USA </td><td> P5147 </td></tr><tr><td> Microfil flexiblen Injektionsnadel </td><td> World Precision Instruments USA </td><td> MF28G-5 </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren, od 1,5 mm, ID 1,0 mm, kein Filament </td><td> World Precision Instruments USA </td><td> PG52151-4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen USA </td><td> D3899 </td></tr><tr><td> Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) </td><td> <a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank">www.ellsworth.com</a> </td><td> 184 SIL ELAST KIT </td></tr><tr><td> ND-Filter-Set (unmontiert) </td><td> Chroma </td><td> 22000b Serie </td></tr><tr><td> Elektrodenhalter 1-HL-U </td><td> Momolekularen Devices </td><td> 1-HL-U </td></tr></tbody></table>

herstellung<em&gt; drosophila</em&gt; central neuronen<em&gt; in situ</em&gt; patch clamping

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short Generationszeiten und einfache genetische Techniken machen die Fruchtfliege Drosophila melanogaster eine hervorragende genetische Modell in grundlegenden neurowissenschaftlichen Forschung. Ionenkanäle sind die Grundlage aller Verhalten, da sie die neuronale Erregbarkeit zu vermitteln. Die erste Spannung Ionenkanal geklont war der Drosophila Spannung Kaliumkanal Shaker 1,2. Gegen das Verständnis der Rolle von Ionenkanälen und Membranerregbarkeit für die Funktion des Nervensystems ist es sinnvoll zu kombinieren leistungsfähige genetische Werkzeuge in Drosophila mit in situ Patch Clamp Messungen. Seit vielen Jahren solche Aufnahmen wurden von der geringen Größe der Drosophila CNS behindert worden. Darüber hinaus bildeten eine robuste Hülle aus Glia und Kollagen Hindernisse für Patch-Pipette Zugang zu zentralen Neuronen. Das Entfernen dieser Hülle ist eine notwendige Voraussetzung für Patch Clamp Messungen von jedem Neuron in der erwachsenen Drosophila CNS. In den letzten JahrenWissenschaftler konnten in situ Patch Clamp Messungen von Neuronen im erwachsenen Gehirn 3,4 und Bauchmark von embryonalen 5,6, Larven 7,8,9,10 und erwachsenen Drosophila 11,12,13,14 befragen. Eine stabile Giga-Dichtung ist die wichtigste Voraussetzung für eine gute Patch und hängt von sauberen Kontakt der Patch-Pipette mit der Zellmembran, um Kriechströme zu vermeiden. Daher muss für die gesamte Zelle in situ Patch Clamp Messungen von erwachsenen Drosophila Neuronen gründlich gereinigt werden. Im ersten Schritt hat der Ganglien-Hülle an enzymatisch behandelt und mechanisch entfernt, um die Zielzellen zu erreichen. Im zweiten Schritt hat der Zellmembran so poliert werden, dass keine Schicht aus Glia, Kollagen oder anderen Materials kann Giga-Dichtung Formation zu stören. Dieser Artikel beschreibt, wie Sie einen identifizierten zentralen Neuron in der Drosophila Bauchmark, die Flucht Motoneuron 5 (MN5 15), bereiten für somatische ganzen cell Patch Clamp Messungen. Identifizierung und Sichtbarkeit des Neurons wird durch gezielte Expression von GFP in MN5 erreicht. Wir zielen nicht auf die Patch-Clamp-Technik selbst zu erklären.

In situ Patch Clamp Messungen sind für elektrophysiologische Charakterisierung von Neuronen im intakten Schaltung verwendet. In der Drosophila genetische Modell Patch-Clamp ist schwierig, weil das ZNS ist klein und umgeben von einer robusten Hülle. Dieser Artikel beschreibt die Vorgehensweise, um die Scheide und sauber Neuronen für nachfolgende Patch Clamp Messungen entfernen.

Herstellung<em&gt; Drosophila</em&gt; Central Neuronen<em&gt; In situ</em&gt; Patch Clamping

Kurze Generationszeiten und einfache genetische Techniken machen die Fruchtfliege Drosophila melanogaster zu einem exzellenten genetischen Modell in der grundlegenden Neurowissenschaft ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Flugmotorneuronen fünf der Drosophila für C2-Patch-Clamp-Aufzeichnungen vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem man zunächst das ventrale Nervensystem der Drosophila mit den mittels GFP markierten Flugmotorneuronen eins bis fünf über eine 40x-Wasser-Immersionslinse sichtbar macht. Der zweite Schritt besteht darin, eine gebrochene, mit Protease gefüllte Patch-Pipette zu verwenden, um Protease auf die GFP-markierten Motorneuronen aufzutragen, um so die Debris-Glia und die Tracheen zu lösen, die den Zugang zum Motorneuron fünf behindern.Als Nächstes werden Trümmer, Gliazellen und die Trachea entfernt, indem man die gelockerten Trümmer und Gliazellen vorsichtig mit der Pipette ansaugt und die Trachea durch Anlegen von positivem und negativem Druck beiseiteschiebt. Alternativ kann zu diesem Zeitpunkt helles Licht verwendet werden, um die verbleibenden Trümmer zu entfernen, die unter fluoreszierendem Licht mit GFP-Filter nicht sichtbar sind. Schließlich ist das gereinigte Motoneuron Fünf im hellen Licht nur schwach sichtbar, jedoch deutlich unter Verwendung von fluoreszierendem Licht mit GFP-Filter erkennbar.Nachdem die Zellen

preparation-of-drosophila-central-neurons-for-in-situ-patch-clamping

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Diese Technik macht die Drosophila embryonale neuromusculature für die Immunhistochemie oder elektrophysiologische Ableitung. Es ist für das Studium frühen Ereignisse in neuromuskulären Entwicklung oder Durchführung Elektrophysiologie in Mutanten, die nicht brüten können nützlich.

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung...

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Das Video zeigt, wie die elektrische Aktivität in den Photorezeptorneuronen des Ommatidiums von Drosophila aufgezeichnet wird, indem eine Ganzzellkonfiguration etabliert wird. Es hebt die Aktivierung transienter Rezeptorpotentialkanäle durch Lichtimpulse hervor, was zu messbaren Quantenbumps führt.

Ganzzell-Spannungsklemmen-Aufzeichnungen von Drosophila-Photorezeptoren

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Dieses Protokoll zeigt, wie Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf die retinale Neuronen aus einem flachen-Mount-Vorbereitung durchzuführen.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Synaptische Ströme können fokal aus visualisierten synaptischen Boutons bei der Drosophila dritte Instar Larven neuromuskulären Synapse aufgenommen werden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Tätigkeit von einem einzigen synaptische Bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.

Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

In diesem Artikel besprechen wir drei Gehirn-Präparate für die ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung die Retinotectal Schaltung von Xenopus Laevis Kaulquappen zu studieren. Jede Vorbereitung, mit ihren eigenen spezifischen Vorteilen, trägt zur experimentellen Lenkbarkeit des Xenopus Kaulquappe als Vorbild für neuronale Schaltkreis-Funktion zu untersuchen.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Flugmotorneuronen für Patch-Clamp-Aufzeichnungen in situ. Diese Methode nutzt GFP-Tagging und Protease-Behandlung zur Entfernung von Trümmern und Tracheen.

Herstellung

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