Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, konstruierte Muskelgewebe herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Satellitenzellen oder eine Myoblasten-Zelllinie kultiviert werden, um die erforderliche Zellanzahl zu erhalten. Der zweite Schritt besteht darin, die Verankerungspunkte herzustellen.

Anschließend werden die Zellen mit einem Gel vermischt und die resultierende Mischung zwischen den Verankerungspunkten gegossen. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen in Muskelgewebe zu differenzieren. Letztendlich kann eine elektrische Stimulation verwendet werden, um Kontraktionen der Zellen hervorzurufen, und eine fluoreszierende Färbung sowie fluoreszierende oder konfokale Mikroskopie kann genutzt werden, um die sarkomerische Organisation des Cytoskeletts in den differenzierten Muskelzellen nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sich Muskelzellen in diesen Geweben in eine Richtung ausrichten. Diese Technik hat außerdem Auswirkungen für Patienten, die unter Muskelverlust leiden. Wenn wir beispielsweise in Zukunft die eigenen Zellen des Patienten verwenden, um diese Gewebe herzustellen, könnten diese für Transplantationszwecke genutzt werden.

Diese Methode liefert Erkenntnisse über die Entwicklung von Muskelgewebe und Muskelverletzungen, bietet aber auch Einblicke für neuartige Anwendungen wie die regenerative Medizin und im Labor kultiviertes Fleisch. Die Durchführung des Verfahrens wird anhand von Arian-Methoden zur Isolierung und Einfrieren von Mirin demonstriert. Myoblast-Vorläuferzellen wurden an anderer Stelle beschrieben.

Bitte konsultieren Sie das schriftliche Protokoll für vollständige Referenzen. Nachdem Sie das Röhrchen mit den murinen myoblastischen Vorläuferzellen aus flüssigem Stickstoff entnommen haben, stellen Sie das Röhrchen zum Auftauen in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Anschließend 10 Milliliter vorgewärmtes Wachstumsmedium zu einem 25 Quadratzentimeter großen, mit Matrigel beschichteten Zellkulturfläschchen hinzufügen. Sobald die Zellen aufgetaut sind, den Inhalt der Ampulle dem Medium zugeben. Die Zellen im Zellkulturfläschchen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Am dritten Tag der Inkubation die Zellen mit Trypsin ablösen, resuspendieren und bei 1000 U/min zentrifugieren. Anschließend die Zellen in einen mit Matrigel beschichteten Gewebekulturkolben mit einer Fläche von 75 cm² überführen, die Zellen alle drei Tage weiterpassagieren und am sechsten Tag in einen mit Matrigel beschichteten Gewebekulturkolben mit einer Fläche von 150 cm² überführen. Am neunten Tag die Zellen aus dem mit Matrigel beschichteten Gewebekulturkolben mit einer Fläche von 150 cm² in ein Tripel von 150 cm² großen, mit Matrigel beschichteten Gewebekulturkolben oder in drei separate 150 cm²-Kolben übertragen.

Am 12. Tag der Inkubation sind die Zellen bereit, in einen Muskelkonstrukt ausgesät zu werden. Beginnen Sie damit, Segmente des Klettbands von etwa fünf Quadratmillimetern mit einer Kante in dreieckiger Form wie in diesem Schema dargestellt zuzuschneiden; es wird nur die weiche Seite des Klettbands verwendet. Bereiten Sie anschließend Silikonkleber vor, indem Sie das Elastomer mit dem Härter im Verhältnis 10 zu 1 mischen.

Danach zwei Stücke Klettband in jedes Brunnen einer 6-Loch-Kulturplatte einkleben, wobei etwa 12 Millimeter Abstand zwischen den Stücken verbleiben, und über Nacht trocknen lassen. Am nächsten Tag die Brunnen und das Klettband sterilisieren, indem 70 % Ethanol in die Brunnen gegeben und 15 Minuten inkubiert wird. Anschließend die Brunnen dreimal mit PBS spülen.

Lassen Sie die dritte Waschung in den Vertiefungen und setzen Sie die Platte 15 Minuten lang UV-Licht aus. Anschließend pipettieren Sie das PBS ab und stellen die Platten in den Zellkultur-Inkubator, bis sie verwendet werden. Bereiten Sie eine Lösung von 3,2 Milligramm pro Milliliter Kollagen in steriler 0,02 %iger Essigsäure vor.

Stellen Sie die Kollagenlösung auf Eis zusammen mit der Matrigel-Lösung, die zuvor im Kühlschrank aufgetaut wurde. Anschließend gewinnen Sie die Zellen durch Trypsinierung und Zentrifugation. Suspendieren Sie dann das Zellpellet in Wachstumsmedium und führen Sie eine Zellzählung gemäß Standardverfahren durch.

Nachdem die Zellen gezählt wurden, stellen Sie das Röhrchen mit den Zellen in den Zellkultur-Inkubator. Die Matrixlösung wird durch Mischen der Lösungen auf Eis in folgenden Prozentanteilen hergestellt: 51,3 % Kollagenlösung, 0,2 % 0,5 molare Natriumhydroxidlösung, 8,6 % Matrixgel und 39,9 % Wachstumsmedium. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Lösung rosa gefärbt ist, da ein Anstieg des pH-Werts zu einer schnellen Aushärtung führen kann.

Das Endvolumen hängt von der Anzahl der zu beschickenden Vertiefungen ab. Diese Tabelle zeigt die Volumina für 10 Muskeln. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig resuspendiert sind, und überführen Sie 750.000 bis 1.250.000 Zellen pro Konstrukt in ein frisches Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 1000 U/min, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem kleinen, aber ausreichenden Volumen der Matrixmischung.

Dann, sobald das Pellet vollständig resuspendiert ist, die Zellen zur verbleibenden Matrixmischung hinzufügen. Nachdem die vorgewärmten Platten aus dem Inkubator entnommen wurden, pipettieren Sie 0,35 bis 0,4 Milliliter der Zell-Matrix-Mischung in jedes Stück Klettband. Beginnen Sie dann, die Mischung von der Mitte zwischen den Befestigungsstellen aus zu pipettieren und bis zum Klettband fortzuführen.

Verwenden Sie abschließend den Rest des Gels, um den Zwischenraum zwischen den beiden Klettverschluss-Ankern aufzufüllen, und pipettieren Sie vorsichtig um die Klettverschluss-Teile herum. Decken Sie die Platte ab und lassen Sie sie bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten lang stehen. Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Schale und überprüfen Sie visuell, ob das Gel starr ist.

Falls ja, können die Schalen vorsichtig in den Zellkultur-Inkubator überführt werden. Nach ein bis zwei Stunden im Inkubator jede Gel mit vier Millilitern vorgewärmtem Wachstumsmedium bedecken. Anschließend die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen.

Nach 24 Stunden ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch Differenzierungsmedium. Wiederholen Sie den Mediumwechsel alle zwei bis drei Tage. Am siebten Kulturtag sollten reife, ausgerichtete Muskel­fasern sichtbar sein.

An diesem Punkt können die Fasern elektrisch stimuliert werden. Sterilisieren Sie zunächst die Elektroden der Ionenoptikplatte 15 Minuten lang mit 70 %igem Ethanol und trocknen Sie sie anschließend 30 Minuten unter UV-Licht. Anschließend werden die sterilisierten Elektroden auf die Kulturplatte platziert, wobei sichergestellt werden muss, dass die Elektroden parallel zum Muskelkonstrukt angeordnet sind, wie auf diesem Bild gezeigt, das die Unterseite einer Platte zeigt; die weißen Pfeile zeigen an, dass die Elektroden die Platte bedecken; die Platte wird mit ihrem Deckel versehen und in den Gewebekultur-Inkubator überführt.

Verbinden Sie die Ionenoptik-C-Pacer mit den entsprechenden Kabeln und wenden Sie hier das Stimulationsprotokoll an. Es werden vier Volt pro Zentimeter verwendet. Sechs Millisekunden lange Impulse mit einer Frequenz von zwei Hertz werden angewendet.

Die elektrische Stimulation wird üblicherweise über einen Zeitraum von 48 Stunden durchgeführt. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden während der Stimulation. Dieses Bild zeigt ein typisches Beispiel eines ausgereiften Muskelkonstrukts.

Die Größe des Gewebes beträgt etwa acht Millimeter in der Länge, zwei Millimeter in der Breite und 0,5 Millimeter in der Dicke. Dieses Bild zeigt ein typisches Beispiel einer Muskelvorläuferzelle in engineerierten Skelettmuskelgeweben. Gefrorenschnitte von nicht stimulierten, spiegelbildlichen bioartifiziellen Muskeln oder M bms.

Am achten Tag der Differenzierung wurden die Zellen für sarcomeres Alpha-Aktinin in Rot, sarcomeres Myosin in Grün und Kerne in Blau angefärbt. Die rechten Felder zeigen eine Vergrößerung der markierten Bereiche. Das Protokoll kann ebenfalls an C2C12-Zellen angewendet werden.

Dieses Bild zeigt differenzierte C2C12-Zellen, die auf die gleiche Weise gefärbt wurden wie im vorherigen Bild. Sarkomeres Alpha-Aktinin ist rot dargestellt, sarkomeres Myosin grün und die Kerne blau.

Auch hier sind die rechten Panels Vergrößerungen der markierten Bereiche. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alles auf Eis zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, wie beispielsweise die quantitative PCR, um Veränderungen in der Genexpressionsrate nach der Entwicklung nachzuweisen.

Die Technik ebnete den Weg dafür, dass Forscher die Rolle der Mechanik bei der Gewebemorphogenese untersuchen konnten. Sie trug außerdem zur Entwicklung von konstruierten Herzmuskelmodellen bei. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe eines auf Hydrogel basierenden Gerüsts konstruierte Muskelgewebe erzeugt.