Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, künstliches Muskelgewebe zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Satellitenzellen oder eine Myoblastenzelllinie kultiviert werden, um die erforderliche Anzahl von Zellen zu erreichen. Der zweite Schritt besteht darin, die Verankerungspunkte herzustellen.

Als nächstes werden die Zellen mit einem Gel vermischt und die resultierende Mischung zwischen die Verankerungspunkte gegossen. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen in Muskelgewebe zu differenzieren. Letztendlich kann die elektrische Stimulation verwendet werden, um Kontraktionen der Zellen zu induzieren, und die Fluoreszenzfärbung und die Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie können verwendet werden, um die sarkomerische Organisation des Zytoskeletts in den differenzierten Muskelzellen nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sich die Muskelzellen in diesen Geweben in eine Richtung ausrichten. Diese Technik hat auch Auswirkungen auf Patienten, die unter Muskelschwund leiden. Wenn wir zum Beispiel in Zukunft patienteneigene Zellen für die Herstellung dieser Gewebe verwenden, können diese für Transplantationszwecke verwendet werden.

Diese Methode bietet Einblicke in die Entwicklung von Muskeln und Muskelschäden, aber auch Einblicke für neuartige Anwendungen wie die regenerative Medizin und e-vitro-kultiviertes Fleisch. Demonstriert wird das Verfahren anhand von Methoden zur Isolierung und zum Einfrieren von Mirin. Myoblasten-Vorläuferzellen wurden an anderer Stelle beschrieben.

Bitte konsultieren Sie das schriftliche Protokoll für vollständige Referenzen. Nach der Entnahme des Fläschchens mit Maus-Myoblasten-Vorläuferzellen aus flüssigem Stickstoff. Stellen Sie das Fläschchen zum Auftauen in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie dann 10 Milliliter erwärmtes Wachstumsmedium in einen 25 Zentimeter großen, mit Matric-Gel beschichteten Gewebekulturkolben. Sobald die Zellen aufgetaut sind, geben Sie den Inhalt der Durchstechflasche in das Medium. Im Gewebekulturkolben werden die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Am dritten Tag der Inkubation werden die Zellen mit Trypsin, Hornisierung und Zentrifugation geerntet. Bei 1000 U/min werden die Zellen dann in einen 75 Zentimeter großen, mit Gel beschichteten Gewebekulturkolben geleitet, der die Zellen alle drei Tage aufteilt, und am sechsten Tag werden die Zellen in einen 150 Zentimeter großen, quadratischen, mit Matri-Gel beschichteten Gewebekulturkolben geleitet. Am neunten Tag übertragen Sie die Zellen aus dem 150 Zentimeter großen, mit Matri-Gel beschichteten Gewebekulturkolben in einen dreifachen 150 Zentimeter großen, mit Matri-Gel beschichteten Gewebekulturkolben oder in drei 150-Zentimeter-Quadrat-Kolben.

Am 12. Tag der Inkubation sind die Zellen bereit für die Aussaat zu einem Muskelkonstrukt. Beginnen Sie mit dem Schneiden von Velcro-Segmenten von etwa fünf Millimetern im Quadrat mit einer Kante in dreieckiger Form, wie in diesem Schema dargestellt, wird nur die weiche Seite des Velcro verwendet. Bereiten Sie dann Silikonkleber vor, indem Sie das Elastomer mit dem Härter im Verhältnis 10 zu eins mischen.

Kleben Sie dann zwei Stücke Velcro in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Kulturplatte, lassen Sie etwa 12 Millimeter zwischen den Stücken und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Am nächsten Tag sterilisieren Sie die Vertiefungen und den Velcro, indem Sie 70 % Ethanol in die Vertiefungen geben und 15 Minuten lang inkubieren. Spülen Sie anschließend die Vertiefungen dreimal mit PBS.

Lassen Sie die dritte Wäsche in den Vertiefungen und setzen Sie die Platte 15 Minuten lang UV-Licht aus. Aspirieren Sie dann das PBS und überführen Sie die Platten bis zur Verwendung in den Gewebekultur-Inkubator. Bereiten Sie eine Lösung von 3,2 Milligramm pro Milliliter, Kollagen und steriler 0,02%iger Essigsäure vor.

Legen Sie die Kollagenlösung zusammen mit der Matrigellösung, die zuvor im Kühlschrank aufgetaut wurde, auf Eis. Als nächstes ernten Sie die Zellen durch Trypsin, Isierung und Zentrifugation. Anschließend wird das Zellpellet in Wachstumsmedium resuspendiert und eine Zellzählung nach Standardverfahren durchgeführt.

Nachdem die Zellen gezählt wurden, stellen Sie das Röhrchen mit den Zellen in den Gewebekultur-Inkubator. Die Matrixlösung wird hergestellt, indem die Lösungen auf Eis in den folgenden Prozentsätzen gemischt werden: 51,3 % Kollagenlösung, 0,2 %, 0,5 molare Natriumhydroxide, 8,6 % Matrixgel und 39,9 % Wachstum. Mittel. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Lösung eine rosa Farbe hat, da ein Anstieg des pH-Werts zu einer schnellen Färbung führen kann.

Das endgültige Volumen hängt von der Anzahl der zu plattierenden Vertiefungen ab. Diese Tabelle zeigt die Volumina für 10 Muskeln. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig resuspendiert sind, und übertragen Sie 750.000 bis 1.250.000 Zellen pro Konstrukt für fünf Minuten in eine frische Zentrifugenröhrchenzentrifuge bei 1000 U/min, saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem kleinen, aber ausreichenden Volumen der Matrixmischung.

Sobald das Pellet vollständig resuspendiert ist, fügen Sie die Zellen zum verbleibenden Volumen der Matrixmischung hinzu. Nun nach der Entnahme der vorwärmten Platten aus dem Inkubatorrohr bei 0,35 bis 0,4 Millilitern der Zellmatrixmischung in jedes Stück Velcro. Beginnen Sie dann, das Gemisch von der Mitte zwischen den Befestigungsstellen her zu spritzen und bis zum Velcro zu verlängern.

Verwenden Sie zum Schluss den Rest des Gels, um den Spalt zwischen den beiden Velcro-Ankern zu füllen, und pipettieren Sie um die Velcro-Stücke. Decken Sie den Teller ab und lassen Sie ihn fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Schale und prüfen Sie, ob das Gel starr ist.

Ist dies der Fall, können die Schalen schonend in den Gewebekultur-Inkubator überführt werden. Nach ein bis zwei Stunden im Inkubator beschichten Sie jedes Gel vorsichtig mit vier Millilitern vorwarmem Wachstumsmedium. Stellen Sie die Platte dann wieder in den Gewebekultur-Inkubator ein.

Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Wachstumsmedium durch ein Differenzierungsmedium. Wiederholen Sie den Medienwechsel alle zwei bis drei Tage. Reife, orientierte Muskelfasern sollten am siebten Tag der Kultur sichtbar sein.

An dieser Stelle können die Fasern elektrisch stimuliert werden. Zuerst sterilisieren Sie die Elektroden von der Ionenoptikplatte mit 70% Ethanol für 15 Minuten und trocknen Sie sie 30 Minuten lang unter UV-Licht. Platzieren Sie dann die sterilisierten Elektroden auf der Kulturplatte und stellen Sie sicher, dass die Elektroden parallel zum Muskelkonstrukt platziert sind, wie in diesem Bild gezeigt, das den Boden einer Platte zeigt, die weißen Pfeile zeigen an, dass die Elektroden die Platte mit ihrem Deckel abdecken und in den Gewebekultur-Inkubator übertragen werden.

Verbinden Sie den ionenoptischen C-Schrittmacher mit den entsprechenden Kabeln und wenden Sie hier das Stimulationsprotokoll an. Vier Volt pro Zentimeter. Zum Einsatz kommen Sechs-Millisekunden-Pulse mit einer Frequenz von zwei Hertz.

Die elektrische Stimulation wird in der Regel über einen Zeitraum von 48 Stunden durchgeführt. Wechseln Sie den Nährboden während der Stimulation alle 24 Stunden. Dieses Bild zeigt ein typisches Beispiel für ein ausgereiftes Muskelkonstrukt.

Die Größe des Gewebes ist etwa acht Millimeter lang, zwei Millimeter breit und 0,5 Millimeter dick. Dieses Bild zeigt ein typisches Beispiel für eine Muskelvorläuferzelle in manipuliertem Skelettmuskelgewebe. Gefrorene Schnitte von nicht stimulierten, bio-künstlichen Muskeln oder M bms.

Am achten Tag der Differenzierung wurden sarkomerisches alpha-Actinin in rot, sarkomeres Myosin in grün und Zellkerne in blau gefärbt. Die Felder auf der rechten Seite sind eine Vergrößerung der eingerahmten Bereiche. Das Protokoll kann auch auf C zwei C 12 Zellen verwendet werden.

Dieses Bild zeigt differenzierte C zwei C 12 Zellen, die auf die gleiche Weise wie im letzten Bild gefärbt wurden. Sarkomerisches Alpha-Actinin ist rot dargestellt. Sarkomerisches Myosin ist grün dargestellt und Zellkerne sind blau dargestellt.

Auch hier handelt es sich bei den Panels auf der rechten Seite um Vergrößerungen der geschachtelten Bereiche. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alles auf Eis zu legen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. quantitative PCR, um Veränderungen der Genexpressionsniveaus nach seiner Entwicklung nachzuweisen.

Die Technik ebnete den Weg für Forscher, die Rolle der Mechanik bei der Morphogenese des Gewebes zu untersuchen. Es half auch bei der Entwicklung von konstruierten Herzmuskelmodellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man künstliches Muskelgewebe mit einem Gerüst auf Hydrogelbasis erzeugt.