Name: Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Skelettmuskelgewebe aus murinen Myoblast-Vorläuferzellen mit Hydrogel-Scaffold und Elektrostimulation. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Muskelstruktur und -funktion für regenerative Medizin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren wollen Yabin Wu für die Kultivierung der Gewebe in Abbildung 2 dargestellt danken, wurde das Bild von Bart van Overbeeke genommen. Die Arbeit wurde finanziell unterstützt durch SenterNovem, Gewährung ISO 42022 unterstützt.

Ein. Kultur Murine Myoblast Vorläuferzellen oder C2C12 Zellen <ol><li> Isolat Zellen gemäß dem Protokoll anfänglich durch Shefer und Kollegen 10 veröffentlicht und später von Collins et al. 11 und Boonen et al. 12 angepasst und speichern diese in flüssigem Stickstoff. Dies erfordert Mäusen, zB C57Bl / 6. Alternative Verfahren sind in anderen Labors verwendet werden, zB ein Verfahren, in Journal of Visualized Experiments durch Li Y et al. 13. Für die Reagenzien und Ausrüstung, die Sie in der Tabelle auf Seite 7 und 8 bezeichnet. Von den Muskel aus einer Maus, die Sie in der Regel erhalten, genügend Zellen auf etwa 20 Ampullen in flüssigem Stickstoff Kryokonservierung. Als nächstes starten wir das Protokoll, um die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff Speicher auftauen. </li><li> Platzieren der Zellen von 1 Fläschchen in einen 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) beschichteten Gewebekulturplatten eingewogen und Wachstumsmedium (GM), die aus (335 ml DMEM fortgeschrittene, 100 ml fötalem bovine Serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml L-Glutamin, 5 ml Hühnerembryo Extrakt (CEE)). </li></ol> Hinweis: Mantel für 2 Stunden bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Matrigel durch Aspiration. <ol start="3"><li> Subkultur die Zellen etwa 1:3 alle 3 Tage. Das bedeutet: am Tag 3: Passage Zellen aus einem 25 cm 2 auf eine 75 cm 2-Kolben, am Tag 6: passage Zellen aus einem 75 cm 2 Kolben auf zwei 150 cm 2-Kolben (mit 30 min Vorabscheidungsbehandlung in unbeschichteten Kolben). Am Tag 9 Transfer ein 150 cm 2 Kolben 1 Dreibettzimmer 150 cm 2-Kolben oder falls nicht verfügbar zu drei 150 cm 2 Flaschen (falls erforderlich Vorbeschichtungszyklus wiederum abhängig vom Phänotyp der Zellen). Am Tag 12 die Zellen sind bereit für die Aussaat in einen Muskel Konstrukt. </li></ol> Hinweise: - Per Triple 150 cm 2 die Anzahl der Zellen wird etwa 4,5 x 10 6 Zellen. - Über Verwendungls aus unterschiedlichen Isolierungen zu mischen, um eine gemischte Population von Zellen zum Zeitpunkt der Aussaat zu erhalten. Hinweis: Wenn Sie nicht mit primären Zellen arbeiten wollen, sind C2C12 Myoblasten eine gute Alternative. 2. Engineering Skeletal Muscle Tissues <ol><li> Bereiten Silikonkleber durch Mischen des &quot;Elastomer&quot; mit dem &quot;Härter&quot; (10:1). Cut + / - 5 mm quadratische Segmente von Klett mit einem dreieckigen Seitenteilen (Haus-Form; Abbildung 1). Leim das Klettelement in die Wells einer 6-Well-Kulturplatte in einem Abstand von etwa 12 mm zwischen den Quadraten. </li></ol> Hinweise: - Verwenden Sie nur die weiche Seite des Velcro und das Gesicht dieser Seite nach oben. - Sicherstellen, dass die Dächer einander gegenüberliegen. - Nur decken den Klettverschluss mit Silikonkleber, nicht Kleber während der gut verteilt. - Für die spätere elektrische Stimulation ist es sinnvoll, die Konstrukte in vertikaler Richtung des Bohrlochs auszurichten plaß (entlang der langen Achse). <ol start="2"><li> Lassen Sie es über Nacht trocknen im Vakuumofen, nicht beheizt, vor allem um Luftblasen zu entfernen. Sterilisieren durch Zugabe von 70% igem EtOH zu den Vertiefungen, Inkubation für 15 min. Abspülen mit PBS 3x und legte unter UV für 15 min. Entfernen Sie alle PBS aus dem Brunnen und den Klettverschluss und Ort im Inkubator bis zur Verwendung. </li><li> Auftauen Matrigel-Lösung in den Kühlschrank und bereiten die Kollagenlösung auf die gewünschte Konzentration kurz bevor die 3D-Konstrukte. Verdünnt das Lager Kollagen mit steriler 0,02% Essigsäure (Endkonzentration 3,2 mg / ml). </li></ol> Hinweis: lassen Sie alles auf Eis. <ol start="4"><li> Trypsinieren die Zellen, in GM und zählen zu resuspendieren. Lassen Sie Zellen in Zentrifugenröhrchen im Inkubator. </li><li> Fügen Sie die gewünschte Menge an Collagen Stammlösung für die Zahlen von Konstrukten, die Sie an einem Rohr (gemäß Tabelle 1) machen wollen, fügen Sie 0,5 M NaOH zu dieser Kollagenlösung bis zu einem hellrosa color ist, die einen pH-Wert von 7,5. Vorsichtig mischen durch Auf-und Abpipettieren und vermeiden Blasenbildung. Dann fügen Sie die Matrigel und mischen sehr sanft, aber gründlich. Schließlich, fügen Sie die GM auf die Kollagen / Matrigel Mischung (für die entsprechenden Mengen siehe Tabelle 1). </li></ol> Hinweise: - Führen Sie jeden Schritt auf dem Eis! Matrigel und Kollagen wird leicht Gel bei steigender Temperatur. - Vorsicht, dass die Farbe der Tat ist rosa! Eine Erhöhung des pH-Wertes wird auch induzieren schnelle Gelierung. - Final Konzentration von Kollagen: 1,6 mg / ml. <ol start="6"><li> Zentrifuge die gewünschte Menge der Zellen bei 1000 rpm für 5 min und Überstand. </li></ol> Anmerkung: - Je nach Aktivität der Zellen die Anzahl der Zellen pro Konstrukt angepasst werden muss. Typischerweise liegt die Anzahl der Zellen, die zwischen 750.000 und 1.250.000 Zellen pro Konstrukt. <ol start="7"><li> Verwenden einige der Gelmischung, um das Zellpellet zu resuspendierenund Übertragung der Zellen in das verbleibende Gemisch und sorgfältig vermischt, jedoch ohne Einleiten von Luftblasen. </li><li> Nehmen die vorerhitzten Well-Platten aus dem Inkubator und Pipette 0,35 -0,4 ml der Zell-Gel-Gemisch in den ersten Klettverschluss. Dann beginnen, um die Mischung aus der Mitte zwischen den Befestigungsstellen pipettieren und reichen bis zum Klettverschluss. Schließlich verwenden den Rest des Gels zu füllen die Lücke zwischen den beiden Velcro Anker und Pipette um die Velcro Stücke. </li><li> Vorsichtig nach 5-10 min überprüfen, ob die Gele solide genug übertragen werden sollen, dh leicht abklopfen Gerichte und Sichtprüfung, wenn das Gel ist starr. Wenn ja, legen Sie sorgfältig die Gerichte in einem Inkubator. Normalerweise können sie nach zehn Minuten abgeholt. Dann wird nach 1-2 Stunden, sanft überlagern Gels mit 4 ml warmem GM. </li></ol> Hinweis:-Nehmen Sie keine heftigen Bewegungen beim Umgang mit den Platten. <ol start="10"><li> Ersetzen GM durch Differenzierung Medium (Wachstumsmediumohne Hühnchenembryoextrakt) nach 24 h und mit frischem Medium alle 2-3 Tage zu ersetzen. Am Tag 7 sollten Sie reifen orientierten Muskelfasern erhalten haben, wie sie mit Färbung für Querstreifung Entwicklung in den fusionierten Muskelfasern ausgewertet werden. </li></ol> 3. Elektrostimulation <ol><li> Sterilisieren Sie die Elektroden aus dem ionoptix Platte (siehe Tabelle von Reagenzien und Geräte) vor dem Gebrauch mit 70% Ethanol und anschließend trocken unter UV in einer Sicherheitswerkbank. Die Platte mit Elektroden auf die Kulturplatte mit den Konstrukten und decken mit dem Deckel von der Kulturplatte und Transfer in einem Inkubator. Schließen Sie das Ionoptix C-Schrittmacher mit den entsprechenden Kabeln. </li></ol> Anmerkung: sind Elektroden parallel neben den Muskel-Konstrukt (Abbildung 2) platziert. <ol start="2"><li> Übernehmen Sie die Stimulationsprotokoll wie erwartet. </li></ol> Hinweis: Wir verwenden in der Regel 4 V / CM,6ms Impulse mit einer Frequenz von 2 Hz. Ändern Kulturmedium alle 24 Stunden während der Stimulation.

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
<li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li>
<li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells%3A+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li>
<li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+der+Schaft%2C+D+%22Tissue+Eng.+Part+A%22">Tissue Eng. Part A</a>. , (2011).</li>
<li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li>
<li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche%3A+optimizing+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li>
<li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol%3A+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li>
<li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li>
<li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , In revision (2013).</li>
<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Engineering von Muskelgewebe hat ein großes Potenzial für den Einsatz als eine Krankheit Modell für Wirkstoff-Screening, in der regenerativen Medizin und für die Fleischproduktion. Allerdings unterscheiden sich die Anforderungen für diese Anwendungen. Wir entschieden uns, mit einer Kombination aus Collagen und Matrigel arbeiten, weil Kollagen ermöglicht Zellausrichtung und weil die Myoblasten Vorläuferzellen erfordern das Vorhandensein von Basalmembran abgeleitete Proteine ​​wie in früheren Studien 2D 12 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Matrigel-Wachstumsfaktor reduziert </td><td> Beckton und Dickinson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM (hoher Glucose) * </td><td> Gibco </td><td> 42430 </td><td></td></tr><tr><td> Erweiterte DMEM </td><td> Gibco </td><td> 12491 </td><td></td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Gibco </td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Greiner </td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0,45 und 0,22 um Spritzenfilter * </td><td> Whatmann (Schleicher und Scheull) </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Kultur Kunststoff </td><td> Greiner </td><td></td><td> Inklusive Kulturflaschen und Pipetten </td></tr><tr><td> Hühnchenembryoextrakt </td><td> United States Biological </td><td> C3999 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteurpipette * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> Pasteurpipetten mit Verengung, mit Baumwolle, offene Spitze L: 230 mm mit Spitzendurchmesser von 0,9 - 1,1 mm </td></tr><tr><td> Pasteurpipette * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> Pasteur Pipetten, mit Verengung, mit Baumwolle, offene Spitze L: 230 mm mit Spitze Durchmesser von 1,4 - 1,6 mm </td></tr><tr><td> Pasteurpipette </td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ I* </td><td> Sigma </td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> 40 um Zellsieb * </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 19G Nadel </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elastomer </td><td> Dow Corning Corporation </td><td> 3097358-1004 </td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> Härter </td><td> Dow Corning Corporation </td><td></td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> Klettband </td><td> Regelmäßige Store </td><td></td><td> Sie können dies an einem regulären Geschäft zu kaufen, verwenden Sie nur die weiche Seite </td></tr><tr><td> Kollagen Typ I, Rattenschwanz </td><td> BD Biosciences </td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> C-Pace EP Kultur Pacer </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Kulturschalen zur elektrischen Stimulation </td><td> Beckton Dickinson-Falcon </td><td> BD Falcon # 353846 </td><td></td></tr><tr><td> C-Dish Kulturschale Elektroden </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Für die Isolierung von Zellen (Punkt 1.1) benötigt # Together in one kit </td></tr></tbody></table>

engineering skeletal muscle gewebe von murine myoblast progenitor cells und anwendung von elektrostimulation

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered Muskelgewebe kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, die die Produktion von Geweben für den Einsatz als eine Krankheit Modell in vitro, zB um Druckgeschwüre zu studieren, für die regenerative Medizin und als Fleisch Alternative 1. Die erste gemeldete 3D Muskel-Konstrukte wurden vor vielen Jahren und machte Pioniere auf dem Gebiet sind Vandenburgh und Kollegen 2,3. Advances in Muskelgewebe Technik gemacht sind nicht nur das Ergebnis aus dem großen Gewinn an Wissen über biochemische Faktoren, Stammzellen und Vorläuferzellen, sondern sind insbesondere auf der Basis von Erkenntnissen von Forschern gewonnen, dass physische Faktoren eine essentielle Rolle bei der Kontrolle von Verhalten der Zelle spielen und Gewebe Entwicklung. State-of-the-art engineered Muskel baut derzeit von Zell-besiedelten Hydrogel Konstrukten bestehen. In unserem Labor diese in der Regel aus murine Myoblasten Vorläuferzellen, aus murinen Hinterbein Muskeln isoliert oder einem murinen Myoblasten-Zelllinie C2C12, mixed mit einer Mischung aus Kollagen / Matrigel und ausplattiert zwischen zwei Verankerungspunkten, imitiert die Muskel Bänder. Andere Zellen können ebenfalls berücksichtigt werden, z. B. alternative Zelllinien wie L6 Ratte Myoblasten 4, neonataler Muskel abgeleitet Vorläuferzellen 5, aus adulten Muskelgewebe aus anderen Spezies, wie Mensch 6 oder sogar induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) 7 abgeleitete . Zellkontraktilität bewirkt Ausrichtung der Zellen entlang der langen Achse des Konstrukts 8,9 und Differenzierung der Muskel-Vorläuferzellen nach etwa einer Woche der Kultur. Außerdem kann die Anwendung der elektrischen Stimulation des Prozesses der Differenzierung teilweise 8 verbessern. Aufgrund seiner geringen Größe (8 x 2 x 0,5 mm) das komplette Gewebe analysiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zB Rentabilität, Differenzierung und Ausrichtung der Zellen zu überwachen. Abhängig von der spezifischen Anwendung der Bedingungen für die engineered Muskelgewebe variieren, z. B. Einsatz für die regenerative Medizin erfordert die Upscaling von Gewebe Größe und Vaskularisation, während als ein Fleisch alternative Übersetzung in andere Arten ist notwendig, zu dienen.

Das Endprodukt wird Muskel-Konstrukte wie in 3 angedeutet ist. Die Größe des Gewebes ca. 8 mm lang, 2 mm breit und 0,5 mm dick sein. Elektrische Stimulation während der Differenzierung ändert die Expression von Myosin schwere Kette-Isoformen, aber nicht wesentlich bessere Differenzierung wie durch den Differenzierungsmedium 8 induziert wird, sondern eine elektrische Stimulation kann auch am Ende des Verfahrens angewendet werden, um für die Funktionalität des Muskels zu überprüfen Da ein Muskel mit voll ...

Engineered Muskelgewebe hat ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin, als Krankheit Modell und auch als alternative Quelle für Fleisch. Hier beschreiben wir die Konstruktion von einem Muskel-Konstrukt, in diesem Fall von der Maus Myoblasten Vorläuferzellen, und die Stimulation durch elektrische Impulse.

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Künstlich hergestellte Muskelgewebe können für verschiedene Zwecke eingesetzt werden, darunter die Herstellung von Geweben zur Verwendung als In-vitro-Krankheitsmodell, z. B. um ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, konstruierte Muskelgewebe herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Satellitenzellen oder eine Myoblasten-Zelllinie kultiviert werden, um die erforderliche Zellanzahl zu erhalten. Der zweite Schritt besteht darin, die Verankerungspunkte herzustellen.Anschließend werden die Zellen mit einem Gel vermischt und die resultierende Mischung zwischen den Verankerungspunkten gegossen. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen in Muskelgewebe zu differenzieren. Letztendlich kann eine elektrische Stimulation verwendet werden, um Kontraktionen der Zellen hervorzurufen, und eine fluoreszierende Färbung sowie fluoreszierende oder konfokale Mikroskopie kann genutzt werden, um die sarkomerische Organisation des Cytoskeletts in den differenzierten Muskelzellen nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sich Muskelzellen in diesen Geweben in eine Richtung ausrichten. Diese Technik hat außerdem Auswirkungen für Patienten, die unter Muskelverlust leiden. Wenn wir beispielsweise in Zukunft die eigenen Zellen des Patienten verwenden, um diese Gewebe herzustellen, könnten diese für Transplantationszwecke genutzt werden.Diese Methode liefert Erkenntnisse über die Entwicklung von Muskelgewebe und Muskelverletzungen, bietet aber auch Einblicke für neuartige Anwendungen wie die regenerative Medizin und im Labor kultiviertes Fleisch. Die Durchführung des Verfahrens wird anhand von Arian-Methoden zur Isolierung und Einfrieren von Mirin demonstriert. Myoblast-Vorläuferzellen wurden an anderer Stelle beschrieben.Bitte konsultieren Sie das schriftliche Protokoll für vollständige Referenzen. Nachdem Sie das Röhrchen mit den murinen myoblastischen Vorläuferzellen aus flüssigem Stickstoff entnommen haben, stellen Sie das Röhrchen zum Auftauen in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius.Anschließend 10 Milliliter vorgewärmtes Wachstumsmedium zu einem 25 Quadratzentimeter großen, mit Matrigel beschichteten Zellkulturfläschchen hinzufügen. Sobald die Zellen aufgetaut sind, den Inhalt der Ampulle dem Medium zugeben. Die Zellen im Zellkulturfläschchen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren.Am dritten Tag der Inkubation die Zellen mit Trypsin ablösen, resuspendieren und bei 1000 U/min zentrifugieren. Anschließend die Zellen in einen mit Matrigel beschichteten Gewebekulturkolben mit einer Fläche von 75 cm² überführen, die Zellen alle drei Tage weiterpassagieren und am sechsten Tag in einen mit Matrigel beschichteten Gewebekulturkolben mit einer Fläche von 150 cm² überführen. Am neunten Tag die Zellen aus dem mit Matrigel beschichteten Gewebekulturkolben mit einer Fläche von 150 cm² in ein Tripel von 150 cm² großen, mit Matrigel beschichteten Gewebekulturkolben oder in drei separate 150 cm²-Kolben übertragen.Am 12. Tag der Inkubation sind die Zellen bereit, in einen Muskelkonstrukt ausgesät zu werden. Beginnen Sie damit, Segmente des Klettbands von etwa fünf Quadratmillimetern mit einer Kante in dreieckiger Form wie in diesem Schema dargestellt zuzuschneiden; es wird nur die weiche Seite des Klettbands verwendet. Bereiten Sie anschließend Silikonkleber vor, indem Sie das Elastomer mit dem Härter im Verhältnis 10 zu 1 mischen.Danach zwei Stücke Klettband in jedes Brunnen einer 6-Loch-Kulturplatte einkleben, wobei etwa 12 Millimeter Abstand zwischen den Stücken verbleiben, und über Nacht trocknen lassen. Am nächsten Tag die Brunnen und das Klettband sterilisieren, indem 70 % Ethanol in die Brunnen gegeben und 15 Minuten inkubiert wird. Anschließend die Brunnen dreimal mit PBS spülen.Lassen Sie die dritte Waschung in den Vertiefungen und setzen Sie die Platte 15 Minuten lang UV-Licht aus. Anschließend pipettieren Sie das PBS ab und stellen die Platten in den Zellkultur-Inkubator, bis sie verwendet werden. Bereiten Sie eine Lösung von 3,2 Milligramm pro Milliliter Kollagen in steriler 0,02 %iger Essigsäure vor.Stellen Sie die Kollagenlösung auf Eis zusammen mit der Matrigel-Lösung, die zuvor im Kühlschrank aufgetaut wurde. Anschließend gewinnen Sie die Zellen durch Trypsinierung und Zentrifugation. Suspendieren Sie dann das Zellpellet in Wachstumsmedium und führen Sie eine Zellzählung gemäß Standardverfahren durch.Nachdem die Zellen gezählt wurden, stellen Sie das Röhrchen mit den Zellen in den Zellkultur-Inkubator. Die Matrixlösung wird durch Mischen der Lösungen auf Eis in folgenden Prozentanteilen hergestellt: 51,3 % Kollagenlösung, 0,2 % 0,5 molare Natriumhydroxidlösung, 8,6 % Matrixgel und 39,9 % Wachstumsmedium. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Lösung rosa gefärbt ist, da ein Anstieg des pH-Werts zu einer schnellen Aushärtung führen kann.Das Endvolumen hängt von der Anzahl der zu beschickenden Vertiefungen ab. Diese Tabelle zeigt die Volumina für 10 Muskeln. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig resuspendiert sind, und überführen Sie 750.000 bis 1.250.000 Zellen pro Konstrukt in ein frisches Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 1000 U/min, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem kleinen, aber ausreichenden Volumen der Matrixmischung.Dann, sobald das Pellet vollständig resuspendiert ist, die Zellen zur verbleibenden Matrixmischung hinzufügen. Nachdem die vorgewärmten Platten aus dem Inkubator entnommen wurden, pipettieren Sie 0,35 bis 0,4 Milliliter der Zell-Matrix-Mischung in jedes Stück Klettband. Beginnen Sie dann, die Mischung von der Mitte zwischen den Befestigungsstellen aus zu pipettieren und bis zum Klettband fortzuführen.Verwenden Sie abschließend den Rest des Gels, um den Zwischenraum zwischen den beiden Klettverschluss-Ankern aufzufüllen, und pipettieren Sie vorsichtig um die Klettverschluss-Teile herum. Decken Sie die Platte ab und lassen Sie sie bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten lang stehen. Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Schale und überprüfen Sie visuell, ob das Gel starr ist.Falls ja, können die Schalen vorsichtig in den Zellkultur-Inkubator überführt werden. Nach ein bis zwei Stunden im Inkubator jede Gel mit vier Millilitern vorgewärmtem Wachstumsmedium bedecken. Anschließend die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen.Nach 24 Stunden ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch Differenzierungsmedium. Wiederholen Sie den Mediumwechsel alle zwei bis drei Tage. Am siebten Kulturtag sollten reife, ausgerichtete Muskel­fasern sichtbar sein.An diesem Punkt können die Fasern elektrisch stimuliert werden. Sterilisieren Sie zunächst die Elektroden der Ionenoptikplatte 15 Minuten lang mit 70 %igem Ethanol und trocknen Sie sie anschließend 30 Minuten unter UV-Licht. Anschließend werden die sterilisierten Elektroden auf die Kulturplatte platziert, wobei sichergestellt werden muss, dass die Elektroden parallel zum Muskelkonstrukt angeordnet sind, wie auf diesem Bild gezeigt, das die Unterseite einer Platte zeigt; die weißen Pfeile zeigen an, dass die Elektroden die Platte bedecken; die Platte wird mit ihrem Deckel versehen und in den Gewebekultur-Inkubator überführt.Verbinden Sie die Ionenoptik-C-Pacer mit den entsprechenden Kabeln und wenden Sie hier das Stimulationsprotokoll an. Es werden vier Volt pro Zentimeter verwendet. Sechs Millisekunden lange Impulse mit einer Frequenz von zwei Hertz werden angewendet.Die elektrische Stimulation wird üblicherweise über einen Zeitraum von 48 Stunden durchgeführt. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden während der Stimulation. Dieses Bild zeigt ein typisches Beispiel eines ausgereiften Muskelkonstrukts.Die Größe des Gewebes beträgt etwa acht Millimeter in der Länge, zwei Millimeter in der Breite und 0,5 Millimeter in der Dicke. Dieses Bild zeigt ein typisches Beispiel einer Muskelvorläuferzelle in engineerierten Skelettmuskelgeweben. Gefrorenschnitte von nicht stimulierten, spiegelbildlichen bioartifiziellen Muskeln oder M bms.Am achten Tag der Differenzierung wurden die Zellen für sarcomeres Alpha-Aktinin in Rot, sarcomeres Myosin in Grün und Kerne in Blau angefärbt. Die rechten Felder zeigen eine Vergrößerung der markierten Bereiche. Das Protokoll kann ebenfalls an C2C12-Zellen angewendet werden.Dieses Bild zeigt differenzierte C2C12-Zellen, die auf die gleiche Weise gefärbt wurden wie im vorherigen Bild. Sarkomeres Alpha-Aktinin ist rot dargestellt, sarkomeres Myosin grün und die Kerne blau.Auch hier sind die rechten Panels Vergrößerungen der markierten Bereiche. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alles auf Eis zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, wie beispielsweise die quantitative PCR, um Veränderungen in der Genexpressionsrate nach der Entwicklung nachzuweisen.Die Technik ebnete den Weg dafür, dass Forscher die Rolle der Mechanik bei der Gewebemorphogenese untersuchen konnten. Sie trug außerdem zur Entwicklung von konstruierten Herzmuskelmodellen bei. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe eines auf Hydrogel basierenden Gerüsts konstruierte Muskelgewebe erzeugt.

engineering-skeletal-muscle-tissues-from-murine-myoblast-progenitor

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Ein Mausmodell einer neuromuskulären Elektrostimulation (NME) eine sichere und kostengünstige klinische Modalität, um den vorderen Abteil Muskeln beschrieben. Dieses Modell hat den Vorteil, Modifizieren eines leicht verfügbaren klinischen Einrichtung zum Zweck hervorzurufen gezielten und spezifischen Muskelkontraktionen in Mäusen.

Einem Mausmodell der Muscle Training durch neuromuskuläre Elektrostimulation

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Dieses Protokoll verwendet Elektroporation, um fluoreszenzmarkierte Proteine in Muskelfasern von Mäusen einzuführen und zu exprimieren. Nach der Wiederherstellung nach der Elektroporation werden die Fasern isoliert. Einzelne Fasern werden dann mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Muskelstruktur sichtbar zu machen.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Wir beschreiben eine neuartige experimentelle Technik, die nennen wir Minimal Invasive Muskel einbetten (MIME), basiert auf dem Beweis Skelettmuskelgewebe lebensfähige myogen Zellen enthält, die Spender-Zell-vermittelten Myogenesis bei implantiert erleichtern können Ein Host-Muskel.

Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ausbildung einer Zellpopulation, die mit elektrischen und mechanischen Reizen emuliert kardiale Physiologie. Diese elektromechanische Stimulation erhöht das Cardiomyogenic Potenzial der behandelten Zellen und ist eine vielversprechende Strategie für weitere Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Drogen-Screening.

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

Myoblaste sind proliferierende Vorläuferzellen, die sich unterscheiden, um polynukleierte Myotuben und schließlich Skelettmuskelmyofien zu bilden. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultur von primären Myoblasten von jungen erwachsenen Mausskelettmuskeln vor. Die Methode ermöglicht molekulare, genetische und metabolische Studien von Muskelzellen in der Kultur.

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Erfahren Sie die Herstellung von Skelettmuskelgewebe aus murinen Myoblast-Vorläuferzellen mit Hydrogel-Scaffold und Elektrostimulation. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Muskelstruktur und -funktion für regenerative Medizin.

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Weitere Videos entdecken