Name: 3-Dimensional Resin Casting und Imaging of Mouse Pfortader oder intrahepatische Gallengang-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Lernen Sie die dreidimensionale Harzabdrucktechnik zur Visualisierung der Pfortader und intrahepatischen Gallengänge bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse vaskulärer Architekturen in situ.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (NIH), SSH (R01-DK078640), aus dem Howard Hughes Medical Institute (HHMI) durch die HHMI / Vanderbilt University Certificate Program in Molecular Medicine, um TJW (GRDOT56006779), die unterstützt Vanderbilt Diabetes Research and Training Center (P30-DK020593) und der Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404), die Core Services.

Ein. Bereiten Kanüle <ol><li> Warm eine 1-Zoll langen Abschnitt der PE10-Schlauch mit Ihren Fingerspitzen und strecken, so dass der Schlauch dünn wird. Anmerkung: die Größe des Gefäßes oder Gangs zu kanüliert werden den Grad der Dehnung zu bestimmen. Die Kanüle muss Gallengang wirft gut gedehnt werden kann aber nur dann erforderlich, bis mäßig gedehnt werden, um innerhalb der größeren Pfortader angepasst werden. </li><li> Schneiden Sie das gestreckte Schlauch an einer Diagonale eine abgeschrägte Spitze zu generieren. </li><li> Schneiden Sie die andere Kante des Schlauchs an einen 5-6 Zoll-Segment zu schaffen. </li><li> Einfügen einer 32 Gauge, ½ Zoll Injektionsnadel in die nicht abgeschrägte Kante des Schlauchs. </li></ol> 2. Bereiten Spritze mit PBS <ol><li> Füllen Sie eine 3 ml Spritze mit PBS. </li><li> Schrauben Sie die Spritze auf die Injektionsnadel mit angeschlossenem gezogen PE10 Schlauch zuvor vorbereitet. </li><li> Flick Spritze und Push Spritzenkolben, dass PBS zu gewährleisten, hat die Nadel und Schläuche gefülltes gibt keine Luftblasen in der Spritze. </li><li> Legen Sie die gefüllte Spritze mit PBS in eine Spritze-Halter aus Modelliermasse geformt. Diese Halterung hält die Spritze stetig, während der Schlauch in den Kanal eingeführt wird. </li></ol> 3. Andere Set-up <ol><li> Wiegen 0,1 g Katalysator in einen kleinen Behälter, z. B. eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. </li><li> Ziehen Sie 1 ml Harz in eine 3 ml Spritze. Anmerkung: die relativen Mengen des Katalysators und des Harzes eingestellt werden, um Aushärtungszeit zu verändern. Sinkende Menge des Katalysators kann jedoch erhöht gegossen Schrumpfung und führen zu einer weniger wünschenswert Stimmen. Hinweis: Beim Umgang mit Harz, Vorsichtsmaßnahmen ergreifen, um Kontakt mit Harz oder Einatmen der Dämpfe Harz zu vermeiden. Tragen Sie immer Schutzhandschuhe und führen Sie die Schritte mit Harz in einem gut belüfteten Raum, wie einer chemischen Abzugshaube </li><li> Schneiden Sie ein Stück von 5,0 Seidennaht von ca. 5 cm als einer Ligatur verwendet werden. </li></ol> 4. Bereiten Maus <ol&gt; <li> Sacrifice erwachsenen Maus. Legen Sie mit der Maus auf den Rücken und öffnen Sie die Bauchhöhle. </li><li> Lay Maus auf Binokular Plattform. Positionieren Sie eine 15 ml konischen Röhrchen senkrecht der Unterseite der Maus, um die Sichtbarkeit und Zugänglichkeit der Leber zu erhöhen. </li><li> Befeuchten Sie ein Wattestäbchen mit PBS und verwenden Sie es, um die Leber nach oben und weg von Ihnen, um die dorsale Ansicht der Leber zusammen mit dem extrahepatischen Pfortader oder Choledochus Setzen kippen. </li><li> Für Pfortader Abgüsse, können Sie verhindern die Blutgerinnung durch Spülen der Vene mit Raumtemperatur PBS. Bringen Sie eine Nadel in eine 3 ml Spritze mit PBS gefüllt und Nadel in extrahepatischen Pfortader so weit von der Leber, wie Sie können. Schieben PBS durch in die Pfortader. Machen Sie einen nick in der gemeinsamen Cardinalvene Blut abfließen. Benutzen Sie einen nassen Wattestäbchen zur Massage der Leber, verbessert Blut Entwässerung. Dieser Schritt ist für den Gallengang empfohlen und eventuell nicht notwendig, dass alle Gefäßsystems. Hinweis: Dieser Schritt kann auch perfo werdenRMED mit 4% Paraformaldehyd anstelle von PBS. Verwendung von 4% Paraformaldehyd kann vaskuläre Integrität und führen zu einer genaueren gegossenen erhöhen, speziell von kleineren Gefäßstrukturen. </li></ol> 5. Kanülieren extrahepatischen Pfortader oder Choledochus <ol><li> Verwenden gekrümmten Zange, um das chirurgische Nahtmaterial Ligatur unterhalb der Pfortader oder Gallengang passieren, ungefähr ¼ Zoll von der Leber. </li><li> Binden Sie die Naht in einem lockeren gemeinsamen Knoten. Ziehen Sie die Knoten. </li><li> Wenn Sie mit einem offenen System arbeiten, kann es hilfreich sein zu binden und ziehen eine Ligatur am anderen Ende des Systems. Wenn Sie die gemeinsame Cardinalvene geöffnet haben, um das Blut aus der Pfortader abfließen, binden eine Ligatur um ihn herum, um den Druck in der Pfortader zu erhöhen und zu verhindern, Harz Leckage in der zentralen Lebervene. </li><li> Verwenden Frühjahr Schere einen kleinen Schnitt in der Pfortader oder Gallengang, etwa ¼ Zoll unter der Naht Knoten zu machen. Diese cut sollte dringen nicht mehr als der Hälfte des Durchmessers der Pfortader oder Gallengang. </li><li> Mit # 5 Zangen, halten Sie die Pfortader oder Gallengang an der Stelle des Schnittes und legen abgeschrägte Ende des Schlauches in den Gallengang. </li><li> Schieben Spitze des Schlauchs an der Pre-gebundenen Blattschraube und zur Leber. </li><li> Test für Kanülierung Genauigkeit durch die Injektion von PBS durch die Kanüle und beobachten, um zu sehen, ob es die Pfortader oder Gallengang gelangt. </li><li> Ziehen Sie die Ligatur um die Kanüle in Position zu halten. </li></ol> 6. Resin Cast der Pfortader oder intrahepatischen Gallengang <ol><li> Fügen abgemessene 1 ml Harz abgemessene 0,1 g Katalysator und gründlich mischen. Vermeiden Erzeugung von Luftblasen. </li><li> Zeichnen Harz-Katalysator-Gemisch wieder in den 3 ml Spritze. Entfernen Sie alle Luftblasen durch leichtes Ausklopfen der Spritze und Vertreibung Blasen. Hinweis: zum Gießen kleine Strukturen, kann es hilfreich sein, um eine Vakuumkammer verwenden, um sehr kleine Luftblasen aus th entfernene Harz und verbessern Gussqualität. Um Zeit für diesen Schritt zu ermöglichen, wird es erforderlich sein, den Katalysator / Harz-Verhältnis von dem oben vorgeschlagen, um Harzhärtung verlangsamen verringern. </li><li> Vorsichtig wieder PBS-haltigen Spritze mit Harz enthaltenden Spritze, so dass die 32-Gauge-Nadel an der Kanüle. </li><li> Langsam und vorsichtig Harz in die Pfortader oder Gallengang, bis Widerstand ansteigt und Leber gefüllt ist. </li><li> Verwenden nassen Wattestäbchen sanft massieren Leber und fördern eine gleichmäßige Füllung. </li><li> Entfernen Kanüle aus der Struktur und schnell wieder anziehen Ligatur Harz zu verhindern. </li><li> Lassen Maus lag bei Raumtemperatur Wohnung für 20 min, während das Harz härtet, dann entfernen Sie Leber. </li><li> Fahren Sie mit dem entweder für die Beseitigung oder Mazeration der Leber. </li></ol> 7. Klare Leber für Visualisierung in situ <ol><li> Fix die Leber in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C, Schaukeln. </li><li> Waschen Sie die Leberin PBS für mindestens vier Stunden, Schaukeln. An dieser Stelle können Sie trennen die Leberlappen, falls gewünscht. </li><li> Entwässern in 50% Methanol und anschließend in 100% Methanol für mindestens vier Stunden jeden, Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Deaktivieren Sie die Leber in einer 1:2-Lösung von Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB) für mindestens 24 Stunden, Schaukeln. Längere Waschzeiten notwendig sein. Wenn die Leber nicht vollständig nach 2-3 Tagen klar, wieder auf 100% Methanol für 24 Stunden zu verschieben und wiederholen BABB Lichtung. </li><li> Tauchen Leber in BABB in einem Glas Petrischale für die Bildgebung in situ. </li></ol> 8. Mazerieren Lebergewebe <ol><li> Entfernen der Leber von Mäusen und in einem 50 ml konischen Röhrchen mit Wasser. Warten Sie 1 Stunde zur vollständigen Aushärtung. Separate Leberlappen falls gewünscht. </li><li> Gießen Sie das Wasser und bewegen Leber zu einer Glasflasche. Tauchen in 15% KOH. Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur. Nicht rocken. </li><li> Vorsichtig abgießen KOH und waschen Besetzung in destilliertem Wasser. Hinweis: Die Besetzung ist very zerbrechlich und sollte mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Verhindern, dass die Besetzung beim Hinzufügen oder Entfernen von Flüssigkeit aus dem Rohr. </li><li> Wenn Harz gegossenen sauber ist, sanft auf einem Kimwipe zum Trocknen lag, dann zu einem Behälter abgelegt werden übertragen. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Eine erfolgreiche Besetzung der Pfortader oder Gallengang zeigen ein kontinuierliches Netzwerk von immer kleiner Zweige, die sich aus dem Hilus der Leber Peripherie. Abbildung 1 zeigt eine Pfortader gegossen als visualisierte in situ nach BABB Lichtung. 1A die Besetzung des gesamten linken Leberlappen und die Form und Größe der Besetzung zeigt. Abbildung 1B zeigt eine Nahaufnahme der gleichen Besetzung, was die Eindringen des Harzes in die kleinsten Pfortaderäste an der Leber Peripherie. Abbildung 2 zeigt eine Pfortader Besetzung, KOH ma durchlaufen hatceration. 2A zeigt die gesamte linke Leberlappen und 2B ist eine Nahaufnahme der kleinen peripheren Äste. Diese Technik wurde auch erfolgreich auf die intrahepatischen Gallengang eingesetzt und veröffentlicht sowohl mit dem BABB Clearing und KOH Mazeration Techniken 1,2,7. Häufige Probleme sind unvollständig ausfüllt, demonstriert Blasen in dem Harz, und Überlauf in umgebenden Systemen oder Geweben. Abbildung 3, wie eine unvollständige Füllung (3A), Blasen (3A) und einen Überlauf von Harz aus der Pfortader zu erkennen, um die Zentralvene (3B). Alle Bilder sind aufgenommen mit einem Leica MZ 16 FA Stereoskop und QImaging RETIGA 4000R Kamera. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig1.jpg" /> Abbildung 1. BABB geräumten Resin der Leber links lobe Pfortader. A. Resin gegossen zeigt eine hierarchische Verzweigung Struktur, die sich aus dem Hilus der Leber Peripherie. Resin erscheint in gelber Farbe in blau getönt Leberlappen. B. Eine Nahaufnahme zeigt, dass Harz zu füllen, um kleine Äste in der Leber Peripherie erstreckt. Resin ist weißlich über gelöscht Leber. Maßstab = 1 mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig2.jpg" /> Abbildung 2. Tissue-mazerierten Resin der Leber links lobe Pfortader. A. Resin ganzer Leberlappen gegossen zeigt viele Niederlassungen in unterschiedlichen Größen. B. Close-up zeigt, kleine Äste in der Peripherie der Leber. Weiche Auftreten von kleinen Zweigen stellt Harzfüllung von sinusförmigen Räume und kann oder kann nicht auf Harz sichtbar wirft und die scheinbare Niederlassung Dichte zu erhöhen, falls vorhanden. Resin ist in der Farbe weiß. Maßstab = 1 mm. Abbildung 3. Gemeinsame Probleme mit Harz Würfe. A. Eine unvollständige Füllung des linken Lappens Pfortader ist durch einige oder alle Stimmen Niederlassungen nicht gelingt, auf die Leber Peripherie erweitern offensichtlich. Diese Besetzung zeigt auch Blasen, sichtbar als Pausen in der kontinuierlichen Besetzung (Pfeil). B. Durch die Nähe der Pfortader und zentrale Vene Niederlassungen in einigen Orten wird die Pfortader Harz oft geben und füllen Sie die zentrale Vene. Dies erkennt man, wenn zwei unterschiedliche hilar Niederlassungen (Pfeile) und zwei verzweigte Strukturen, die unterschiedliche Muster und Überschneidungen haben sollen. Unterscheidung zwischen technischen Fehlern und wahre morphologische Veränderungen kann auf zwei Arten erfolgen. Erstens sollte das Gußgefüge der Struktur erwartet bezogen auf 2-dimensionale Analyse oder andere Verfahren verglichen werden. Zweitens ist es wichtig, führen mehrere Wiederholungen, und wenn möglich, zu quantifizieren structure und statistische Analysen, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen und wenn es eine statistisch signifikante morphologische Veränderung zwischen und in verschiedenen experimentellen und Querlenker.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben die spezifischen Beispiele, wie die Pfortader und intrahepatische Gallengang Systemen der Leber umgewandelt werden kann beschrieben, aber diese Technik kann auf praktisch jedem anderen Duktus oder Gefäßsystem mit geringen Anpassungen aufgebracht werden. Frühere Arbeiten haben die Machbarkeit dieser Technik in mehreren Arten, darunter Maus 1,2,7-9, Entlein 10,11, Kaninchen 12,13, Hund 14 und Schwein 15, und in vielen Organen, einschließlich nasaler Stopfbuc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> PE10 Polyethylenschlauch </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1417012P </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 chirurgische schwarzen geflochtenen Seide </td><td> Roboz Surgical </td><td> SUT-15-1 </td><td></td></tr><tr><td> Steriject 32 G x 13 mm Nadel </td><td> Air-tite </td><td> TSK3213 </td><td></td></tr><tr><td> Frühling Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Number 5 Zangen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mercox II Kit </td><td> Ladd Research </td><td> 21247 </td><td></td></tr><tr><td> Benzylalkohol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1816-04 </td><td> Only für BABB-Clearing erforderlich </td></tr><tr><td> Benzylbenzoat </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 154839 </td><td> Nur für BABB-Clearing erforderlich </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Modelliermasse </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Maßstab </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laborscheren </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ml cap Polypropylenröhrchen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4% paraformaldahyde </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15% Kaliumhydroxid (KOH) </td><td></td><td></td><td> Nur für Mazeration erforderlich </td></tr><tr><td> Rasierklinge </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100% Methanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Luer-Lock-Spritze </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3-dimensional resin casting und imaging of mouse pfortader oder intrahepatische gallengang-system

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In Organen, ist die richtige Architektur von vaskulären und duktalen Strukturen für die richtige physiologische Funktion unentbehrlich, und die Bildung und Aufrechterhaltung dieser Strukturen ist ein hoch regulierten Prozess. Die Analyse dieser komplexen 3-dimensionalen Strukturen hat sich stark auf beiden 2-dimensionalen Prüfung im Bereich oder auf Farbstoffinjektion Studien abhängt. Diese Techniken sind jedoch nicht in der Lage, eine vollständige und quantifizierbare Darstellung der duktalen oder Gefäßstrukturen sie vorgesehen sind aufzuklären bereitzustellen. Alternativ erzeugt der Natur der 3-dimensionalen Kunststoffharz Abgüsse eine permanente Momentaufnahme des Systems und ist ein neuartiges und nützliches Verfahren weithin zur Visualisierung und Quantifizierung von 3-dimensionalen Strukturen und Netze. Ein entscheidender Vorteil des Harzes Gießsystem ist die Fähigkeit, die intakt und verbunden oder kommuniziert, Struktur eines Blutgefäßes oder Kanal zu bestimmen. Die Struktur von vaskulären und ductal-Netzwerke sind entscheidend für Organfunktion, und diese Technik hat das Potential Studie von vaskulären und Duktus-Netzwerke in mehrfacher Hinsicht zu unterstützen. Gießharz kann verwendet werden, um normale Morphologie und funktionelle Architektur eines luminalen Struktur analysieren, Entwicklungsstörungen morphogenetischen Veränderungen und aufzudecken morphologischen Unterschiede im Gewebe Architektur zwischen Normal-und Krankheitszuständen werden. Frühere Arbeiten haben Harz Gießen zu studieren Verwendete beispielsweise architektonischen und funktionalen Mängeln in der Maus intrahepatischen Gallengang System, die nicht in 2-dimensionale Analyse der Struktur reflektiert wurden 1,2, Veränderungen im Gehirn Gefäßsystem eines Alzheimer Mausmodell 3 , Pfortader Abnormalitäten in Portal hypertensiven und Leberzirrhose Mäusen 4, Entwicklungsschritte in Ratten lymphatischen Reifung zwischen unreifen und adulte Lunge 5, sofortige mikrovaskulären Veränderungen in der Rattenleber, Pankreas und Niere in Antwort auf chemische Schädigung in6. Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Erzeugung einer 3-dimensionalen Resin einer Maus vaskuläre oder Milchgangsystem, die speziell auf die Pfortader und intrahepatischen Gallengang. Diese Umwandlungen können durch Löschen oder Mazerieren des Gewebes visualisiert werden und kann dann analysiert werden. Diese Technik kann auf nahezu jedem Gefäß-oder duktalen System angewendet werden und wäre direkt anwendbar für jeden Studie anfragenden in die Entwicklung, Funktion, Wartung, oder der Verletzung eines 3-dimensionalen duktalen oder vaskuläre Struktur.

Ein Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung der 3-dimensionalen Struktur von Maus Pfortader oder intrahepatischen Gallengang wird beschrieben. Dieses Harz gegossenen Technik kann auch auf andere duktalen oder vaskulären Systemen angewendet werden und ermöglicht<em&gt; In situ</em&gt; Visualisierung oder Quantifizierung eines Systems intakt kommunizieren Architektur.

3-Dimensional Resin Casting und Imaging of Mouse Pfortader oder intrahepatische Gallengang-System

In Organen ist die korrekte Architektur vaskulärer und duktaler Strukturen für eine ordnungsgemäße physiologische Funktion unerlässlich, und die Bildung und ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen dreidimensionalen Abguss eines vaskulären oder ductalen Gewebes zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zielstruktur, beispielsweise die Vena portae, präpariert und kaniert wird, wobei der Katheter an Ort und Stelle fixiert wird. Anschließend wird das Harz vorbereitet, in die Vena portae injiziert und zum Aushärten belassen. Anschließend wird die Leber entfernt und das Gewebe fixiert oder makert. Schließlich wird die Leber geklärt und die Gussstruktur sichtbar gemacht. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden.Diese Methode zeigt Veränderungen in der Architektur des vaskulären oder duktalen Gewebes durch visuelle Analyse oder Quantifizierung mittels Mikro-CT. Obwohl diese Methode Einblicke in die Architektur der Leber ermöglicht, kann sie ebenso auf die vaskulären oder duktalen Systeme jedes Organs angewendet werden, einschließlich Gehirn, Lunge, Pankreas und Nieren.Um die Kanüle vorzubereiten, erwärmen Sie mit den Fingerspitzen einen etwa einen Zoll langen Abschnitt PE-10-Schlauch und ziehen ihn vorsichtig, sodass er dünner wird. Schneiden Sie den gedehnten Schlauch schräg ab. Um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen, schneiden Sie das andere Ende des Schlauchs ab, um ein fünf bis sechs Zoll langes Segment zu erhalten.Setzen Sie eine halbzöllige Hohlnadel mit 32 Gauge an der nicht abgeschrägten Kante des Schlauchs ein. Bereiten Sie eine Dreimilliliterspritze vor, indem Sie sie zunächst mit PBS füllen, und schrauben Sie die Nadel mit dem Schlauch auf. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden, und füllen Sie die Nadel vollständig mit PBS, indem Sie leicht gegen die Spritze klopfen und den Kolben betätigen.Wiegen Sie 0,1 Gramm Katalysator in einen kleinen Behälter ein. Ziehen Sie dann ein Milliliter Harz in eine Drei-Milliliter-Spritze. Schneiden Sie abschließend ein fünf Zoll langes Stück Seidenlitze ab, das als Ligatur verwendet wird.Nachdem ein erwachsenes Mäuschen getötet wurde, lege es auf den Rücken und öffne die Bauchhöhle. Platziere die Maus auf dem Träger eines Stereomikroskops und stelle ein 15-Milliliter-Kegelrohr senkrecht unter die Maus, um die Sichtbarkeit und Zugänglichkeit der Leber zu verbessern. Benetze einen Wattestäbchen mit PBS und verwende ihn, um die Leber nach oben und wegzuheben, um die dorsale Ansicht der Leber sowie den extrahepatischen Portal, die Vene oder den Ductus choledochus freizulegen.Um die Bildung von Blutgerinnseln bei Gusspräparaten der Vena portae zu verhindern, spülen Sie die Vene mit PBS bei Raumtemperatur aus. Befestigen Sie eine Nadel an einer mit PBS gefüllten Dreimilliliterspritze und führen Sie sie so weit wie möglich vom Leber entfernt in die extrahepatische Vena portae ein.Danach vorsichtig PBS in die Pfortader injizieren. Anschließend, falls erforderlich, um die Blutentleerung zu verbessern, in die gemeinsame Kardinalvene einen kleinen Einschnitt machen und die Leber mit einem angefeuchteten Wattestäbchen massieren. Wenn mit einem offenen System gearbeitet wird, kann es hilfreich sein, am anderen Ende des Systems eine Ligatur zu legen und festzuziehen.Wenn die Vena cardinalis geöffnet wird, um Blut aus der Vena portae abzuleiten, wird ein Ligatur um diese gelegt, um den Druck innerhalb der Vena portae zu erhöhen und ein Eindringen des Harzes in die zentrale hepatische Vene zu verhindern. Verwenden Sie gebogene Pinzette, um die chirurgische Nahtligatur unter eine der Strukturen etwa ein Viertel Zoll von der Leber entfernt hindurchzuführen. Knoten Sie die Naht zu einem lockeren einfachen Knoten, ohne diesen festzuziehen.Als Nächstes verwenden Sie eine Feder-Schere, um einen kleinen Schnitt in die Vena portae oder den Gallengang etwa ein Viertel Zoll unterhalb des Nahtknotens anzulegen. Dieser Schnitt sollte nicht mehr als die Hälfte des Durchmessers der jeweiligen Struktur durchdringen. Halten Sie dann mit einer Pinzette Nr. 5 die Vena portae oder den Gallengang an der Schnittstelle fest und führen Sie das abgeschrägte Ende des Schlauchs ein.Schieben Sie die Spitze des Schlauchs an der vorher angelegten Ligatur vorbei in Richtung Leber. Überprüfen Sie die korrekte Kanülierung, indem Sie PBS durch die Kanüle injizieren und beobachten, ob die Flüssigkeit in die Pfortader oder den Gallengang eindringt. Ziehen Sie die Ligatur fest, um die Kanüle an Ort und Stelle zu halten.Geben Sie das vorgemessene eine Milliliter Harz zu den vorgemessenen 0,1 Gramm Katalysator und mischen Sie gründlich unter Vermeidung von Luftblasen. Ziehen Sie das Harz-Katalysator-Gemisch wieder in die Drei-Milliliter-Spritze zurück. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen, indem Sie vorsichtig gegen die Spritze klopfen und die Blasen ausstoßen.Ersetzen Sie die Spritze mit PBS vorsichtig durch die Spritze mit Harz, wobei die Nadel mit 32 Gauge an der Kanüle angebracht bleibt. Drücken Sie langsam und behutsam Harz in die Pfortader oder Gallenwege, bis ein erhöhter Widerstand spürbar ist und die Leber vollständig gefüllt ist. Um eine gleichmäßige Füllung zu fördern.Massieren Sie die Leber mit einem feuchten Wattestäbchen, entfernen Sie die Kanüle und ziehen Sie die Ligatur schnell wieder fest, um Harzaustritt zu verhindern. Lassen Sie die Maus 20 Minuten lang bei Raumtemperatur liegen, während der Harz aushärtet, bevor Sie die Leber entnehmen, um diese für die innere Visualisierung freizulegen, fixieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius in 4 % Paraformaldehyd. Gießen Sie am nächsten Tag das Fixansatz ab und geben Sie PBS hinzu.Spülen Sie die Leber mindestens vier Stunden lang in PBS. Die Leberlappen können gegebenenfalls zu diesem Zeitpunkt getrennt werden. Dehydrieren Sie das Gewebe in 50% Methanol und anschließend in 100% Methanol jeweils mindestens vier Stunden lang.Schütteln bei Raumtemperatur. Klären Sie die Leber in einer Lösung aus einem bis zwei Teilen Benzylalkohol und Benzylbenzoat mindestens weitere 24 Stunden lang. Es können mehrere Waschschritte erforderlich sein, um eine Bildgebung im Situ durchzuführen.Das Lebergewebe als alternative Methode zur Gewebemazerierung in BABB in einer Glas-Petrischale versenken. Nach dem Entfernen der Leber aus dem Tier in ein 50-Milliliter-Konischgefäß mit Wasser geben. Eine Stunde warten, bis die Harzaushärtung vollständig ist.Gießen Sie das Wasser ab und überführen Sie die Leber in eine Glasflasche. Tauchen Sie sie in 15 % Kaliumhydroxid ein und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur vorsichtig ohne Schütteln stehen. Gießen Sie das Kaliumhydroxid ab und waschen Sie den Abguss mit destilliertem Wasser. Vermeiden Sie es, den Abdruck beim Hinzufügen oder Entfernen von Flüssigkeit aus dem Röhrchen zu beschädigen. Wenn der Harzabdruck sauber ist, legen Sie ihn vorsichtig auf ein Kim-Tuch, um ihn trocknen zu lassen, und überführen Sie ihn anschließend in ein Behältnis zur Aufbewahrung. Diese Abbildung zeigt einen Pfortaderabdruck, wie er nach der BABB-Klärung in situ visualisiert wurde. Hier ist der Abguss des gesamten linken Leberlappens sowie die Form und Größe des Abgusses zu sehen. Diese Nahaufnahme desselben Abgusses zeigt das Eindringen des Harzes in die kleinsten Äste der Vena portae am Leberrand. Hier wurde ein Abguss der Vena portae mittels Kaliumhydroxid maziert, wobei der gesamte linke Lappen dargestellt ist, sowie eine Vergrößerung der kleinen peripheren Äste.Häufige Probleme umfassen unvollständige Füllungen, Blasen im Harz und Überlauf in umgebende Systeme oder Gewebe. Diese Abbildung zeigt, wie man eine unvollständige Füllung, Blasen und einen Überlauf von Harz von der Pfortader zur Zentralvene erkennt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Harz äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten in einem gut belüfteten Bereich sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens beachtet werden.

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