Wiederkehrende Herpetic Stromakeratitis in Mäuse, ein Modell für das Studium der menschlichen HSK

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine rezidivierende Infektion mit dem Herpes-simplex-Virus (HSV) zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Mäuse zunächst so infiziert werden, dass sie latent infiziert werden, ohne dass eine Hornhautschädigung auftritt. Nachdem die Latenz vollständig etabliert ist, erfolgt der nächste Schritt, das Virus durch Bestrahlung mit UVB-Licht zu reaktivieren. Im letzten Schritt wird der Tränenfilm zur Detektion einer viralen Ausscheidung gesammelt, und die Maus wird anschließend mindestens fünf Wochen lang beobachtet, um den Krankheitsverlauf zu überwachen.

Letztendlich kann das Ausmaß der Erkrankung bei Mäusen durch die Bewertung der Herpetischen stromalen Keratitis beurteilt werden. Diese Erkrankung betrifft weltweit viele Menschen und ist eine der führenden Ursachen für infektiöse Erblindung.

Wir verfügen über ein Modell, das wir bei Mäusen verwenden, um diese bestimmte Krankheit nachzuahmen. Es gibt andere Modelle, die diese Krankheit ebenfalls nachahmen können, aber wir sind der Ansicht, dass dieses Modell die beste Repräsentation dieser speziellen Erkrankung darstellt. Ich möchte heute einige Minuten nutzen, um die Personen vorzustellen, die Sie in diesem Video sehen werden.

Dies ist Chloe, die seit mehreren Monaten mit mir zusammenarbeitet. Dies ist Nippo, ein Sommerpraktikant, der im Labor arbeitet. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie HSV Typ 1 für drei bis vier Tage zu 80 % Konfluenz in einer T150-Flasche auf Vero-Zellen kultivieren.

Zu diesem Zeitpunkt haben sich die Zellen aufgerundet und lassen sich leicht durch Anschlagen des Kolbens lösen. Überführen Sie die Zellsuspension in sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend 15 Minuten lang. Fügen Sie 1.510 × g bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge hinzu.

Überführen Sie anschließend den Überstand in 50-Milliliter-sterile Oak-Ridge-Röhrchen und verteilen Sie insgesamt fünf Milliliter Medium gleichmäßig auf die konischen Röhrchen für die Resus. Suspendieren Sie die großen Pellets und sonifizieren Sie die resuspendierten Pellets für eine Minute in zwei 32stel-Sekunden-Impulsen. Nach der Zentrifugation des Überstands in einer Hochgeschwindigkeitsboden-Zentrifuge entsteht ein kleines virales Pellet.

Nach dem Verwerfen des Überstandes die Zellen mit den kleinen viralen Pellets kombinieren und erneut 45 Sekunden lang beschallen. Anschließend die beschallte Zell- und Viruslösung erneut fünf Minuten bei 280 × g und 4 °C in der Tischzentrifuge zentrifugieren und den Überstand für die Lagerung als Virusstamm bei −70 °C portionieren, um ihn später in der Titerplatte zu bestimmen.

Zehnfache Verdünnungen des Virus aus dem Virusstammsupernatanten von 10 hoch null bis 10 hoch minus acht, jeweils zweifach aus zwei separaten Verdünnungsreihen, werden auf Vero-Zellen in 12er-Platten aufgetragen, um die Infektion zu beginnen. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Maus anästhesieren. Die Maus sollte vollständig anästhesiert bleiben für 20 bis 30 Minuten, damit das Virus absorbiert werden kann, bevor die Maus wieder aufwacht.

Verwenden Sie dann unter einem Stereomikroskop eine Nadel mit 30 Gauge, um die Hornhaut des rechten Auges anzukratzen. Kennzeichnen Sie das Tier nun durch eine Ohrstanze. Injizieren Sie anschließend die Maus mit einem Milliliter gepooltem menschlichem Serum, um die Hornhäute während der primären Infektion vor Schäden zu schützen.

Verwenden Sie dann einen 20-Mikroliter-Pipettierer, um das angeritzte Auge mit 10 hoch 6 Plaque-bildenden Einheiten zu infizieren, und geben Sie fünf Mikroliter HBSS in das andere Auge, um es feucht zu halten, während das Tier anästhesiert ist, um die Infektion zu bestätigen. Befeuchten Sie einen sterilen Wattetupfer mit einem Milliliter Vero-Medium. Drei Tage nach der Infektion beproben Sie das infizierte Auge mit dem Tupfer und übertragen anschließend 100 Mikroliter des abgestrichenen Mediums auf Vero-Zellen, die mindestens fünf Wochen nach der Erstinfektion in 48-Well-Platten kultiviert wurden.

Beproben Sie das infizierte Auge einer anesthetisierten Maus wie gerade gezeigt mit einem Abstrich. Kennzeichnen Sie den Abstrich als Tag null auf dem Deckel einer 48-Loch-Platte, um spontane Schließbewegungen zu kontrollieren. Stellen Sie anschließend die Maus auf einen Transluminator, der UVB-Licht mit einer Spitzenwellenlänge von 302 Nanometern emittieren kann, sodass nur ein einziges Auge dem UVB-Licht ausgesetzt ist, und bestrahlen Sie die Maus mit 250 Millijoule UVB-Licht pro Quadratzentimeter.

Befeuchten Sie das Auge anschließend täglich von Tag eins bis sieben mit einem Abstrich. Nach der UVB-Bestrahlung quantifizieren Sie die Virusmenge bei den Abstrichen, die infektiöses Virus enthalten, mittels eines standardisierten Plaque-Assays unter Verwendung von 12-Loch-Platten, um die Mäuse auf eine klinische Augenerkrankung zu untersuchen. Stellen Sie die Maus unter ein binokulares Stereomikroskop.

Die Hornhauttrübung wird anhand einer Skala von null bis vier bewertet, wobei null eine klare S-Stroma, eins eine leichte stromale Trübung, zwei eine moderate Trübung mit erkennbarer Iris, drei eine dichte Trübung mit Verlust definierter Irisdetails – mit Ausnahme der Pupillenränder – und vier eine vollständige Trübung ohne Sicht auf die Hinteransicht anzeigt.

Die Neovaskularisation wird anhand einer Skala von eins bis acht bewertet, indem die Hornhaut in vier gleiche Quadranten unterteilt und das Ausmaß der Vaskularisation in jedem dieser Quadranten bestimmt wird. In dieser ersten Abbildung wurden latent infizierte Mäuse mittels UVB-Bestrahlung zur Reaktivierung gebracht und anschließend über einen Zeitraum von 35 Tagen auf Hornhauttrübung überwacht. Diese Daten zeigen, dass männliche C57BL/6-Mäuse signifikant weniger Hornhauttrübung aufweisen als weibliche C57BL/6-Mäuse, da bei den weiblichen C57BL/6-Mäusen von Tag 14 bis Tag 35 eine signifikant stärkere virusinduzierte Erkrankung auftrat.

Ebenso zeigten männliche Mäuse bei der Bewertung der Hornhautneovaskularisierung unter denselben Versuchsbedingungen signifikant weniger Neubildung von Blutgefäßen in der Hornhaut als weibliche Mäuse, und erneut kam es bei weiblichen C57BL/6-Mäusen an den Tagen 14 bis 28 zu einer signifikant stärkeren virusinduzierten Erkrankung. Beachten Sie beim Durchführen dieses Verfahrens, die Mäuse vollständig zu anästhesieren, sodass sie zwischen 20 und 30 Minuten lang schlafen. Nach dem Ansehen dieses Videos hoffe ich, dass Sie verstanden haben, wie das Mausmodell der rezidivierenden stromalen Keratitis verwendet werden kann, um diese menschliche Erkrankung zu untersuchen.