Name: Untersuchen BCL-2 Family Funktion mit großen unilamellaren Vesikeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie große unilamellare Vesikel zur Analyse von BCL-2-Familienproteininteraktionen nutzen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der mitochondrialen Membranpermeabilisierung in vitro.

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Wir möchten uns bei allen Mitgliedern des Chipuk-Laboratoriums für ihre Kollegialität und Unterstützung bedanken. Außerdem möchten wir Tomomi Kuwana und Donald Newmeyer für die Schaffung der experimentellen Grundlage dieser Arbeit danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch: NIH CA157740 (an J.E.C.) und ein Pilotprojekt von NIH P20AA017067 (an J.E.C.). Diese Arbeit wurde außerdem teilweise durch einen Forschungsbeihilfeantrag 5-FY11-74 der March of Dimes Foundation (an J.E.C.) unterstützt.

1. Lipide mischen und einen Lipidfilm erzeugen
<ol>
	<li>Unter Arbeit in einer Abzugshaube mit minimalem Licht werden chloroformlösliche Lipide mit einer mit Chloroform gespülten gasdichten Hamilton-Glasspritze in ein 1,5-ml-Braunglasfläschchen gegeben. Diese Mischung ergibt etwa 4 mg Lipid (Abbildung 1A).
	<ul>
		<li>Cardiolipin 10 mg/ml (CL) – 63 μl</li>
		<li>Phosphatidylcholin 10 mg/ml (PC) – 84 μl</li>
		<li>Phosphatidylethanolamin 10 mg/ml (PE) – 125 μl</li>
		<li>Phosphatidylinositol 10 mg/ml (PI) – 59,5 μl</li>
		<li>Phosphatidylserin 10 mg/ml (PS) – 65 μl</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Um das Chloroform zu entfernen, leitet man einen schwachen Strom eines inerten Gases (z. B. Stickstoff oder Argon) in das Fläschchen. Ein sichtbarer Lipidfilm bildet sich am Boden und an den Wänden des Fläschchens, sobald es trocken ist, was typischerweise 2–3 Stunden dauert (Abbildung 1A).</li>
</ol>
2. Liposomenlösung herstellen
<ol>
	<li>Bereiten Sie in 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 500 μl einer 12,5 mM ANTS-Lösung im LUV-Puffer (0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) und 500 μl einer 45 mM DPX-Lösung im LUV-Puffer vor (Abbildung 1B).</li>
	<li>Vermischen Sie die ANTS- und DPX-Lösungen, wirbeln Sie 1 Minute lang und sonifizieren Sie 1 Minute lang bei Raumtemperatur. Die Sonifizierung erfolgt in einem Ultraschallbad (z. B. Branson 3510MTH, keine Einstellung, einfach „ein“). Dadurch wird sichergestellt, dass die Lösungen vollständig gelöst und homogen sind.</li>
	<li>Geben Sie die ANTS/DPX-Lösung auf den Lipidfilm und verschließen Sie das Gefäß mit Parafilm (Abbildung 1B).</li>
	<li>Sonifizieren Sie den Lipidfilm im oben genannten Wasserbad 5 Minuten lang. Nach der Sonifizierung erscheint die Lösung trüb. Stellen Sie sicher, dass der Lipidfilm vollständig gelöst ist, da kleine Lipidaggregate die nachfolgenden Schritte negativ beeinflussen würden. Überprüfen Sie außerdem die Seitenwände und den Boden des Gefäßes, um sicherzustellen, dass kein Lipidfilm mehr vorhanden ist (Abbildung 1B).</li>
</ol>
3. Extrusion und Reinigung von Liposomen
<ol>
	<li>Bauen Sie den Extruder gemäß den Herstelleranweisungen zusammen, wobei Sie LUV-Puffer verwenden, um die Filterträger und die Polycarbonatmembran anzufeuchten. Ziehen Sie das Gehäuse des Geräts so fest an, dass kein Volumenverlust während der Extrusion auftritt, jedoch nicht so fest, dass die Membran reißt. Es ist außerdem ratsam, den Extruder zunächst mit LUV-Puffer zu testen, um sicherzustellen, dass keine Leckagen oder Probleme auftreten.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Lipidlösung in der rechten Spritze und extrudieren Sie die Lipidlösung 31-mal; die LUVs befinden sich danach in der linken Spritze. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Lipide mindestens einmal durch die Membran gepresst wurden. Für die ersten Durchgänge kann etwas mehr Druck erforderlich sein, um die Membran zu durchdringen. Wenn die Lösung plötzlich sehr schnell durch die Membran fließt, überprüfen Sie die Membran auf Risse und ersetzen Sie sie gegebenenfalls (Abbildung 1C).</li>
	<li>Richten Sie eine 10 ml Sepharose S-500-Säule mit Schwerkraftfluss ein (1,0 cm × 20 cm, 10 ml Kugelvolumen). Waschen Sie die Säule mit 3 Säulenvolumina LUV-Puffer, lassen Sie den Durchfluss stoppen und verschließen Sie die Säule. Da dieser Schritt einige Zeit in Anspruch nimmt, ist es empfehlenswert, die Waschung zu beginnen, sobald die Lipide zum Trocknen eingebracht werden. Halten Sie die Säule einfach verschlossen, bis Sie sie verwenden möchten.</li>
	<li>Geben Sie die extrudierten LUVs in einem Schritt auf die Säule und vermeiden Sie dabei eine Störung der Bead-Grenzfläche. Lassen Sie den Puffer aus der Säule ablaufen, bis der Durchfluss stoppt, und verschließen Sie die Säule. Füllen Sie die Säule vorsichtig mit LUV-Puffer auf. Auch hier ist Vorsicht geboten, um die Beads nicht zu stören (Abbildung 1C).</li>
	<li>Entfernen Sie den Verschluss und sammeln Sie 6 Fraktionen à 1 ml. Die LUVs eluieren normalerweise in den Fraktionen 3 und 4 und sind an ihrer trüben Erscheinung erkennbar. Nach dem Sammeln der Fraktionen waschen Sie die Säule mit 5 Volumina Wasser und 2 Volumina 20 %igem Ethanol. Lagern Sie die Säule bei 4 °C (Abbildung 1C).</li>
	<li>Lagern Sie die Fraktionen bei 4 °C im Dunkeln, bis sie verwendet werden.</li>
</ol>
4. Testen Sie die Säulensäulenfraktionen
<ol>
	<li>Die Säulenfraktionen werden nun hinsichtlich ihrer Fluoreszenz getestet, wobei LUV-Puffer mit LUV-Puffer, der mit 0,5 % CHAPS angereichert wurde, verglichen wird. Fraktionen, die aufgrund der Anwesenheit von CHAPS einen Anstieg der Fluoreszenz zeigen, enthalten LUVs. Geben Sie jeweils 100 μl LUV-Puffer oder LUV-Puffer + 0,5 % CHAPS in sechs Vertiefungen und fügen Sie 5 μl der entsprechenden Fraktion hinzu, anschließend mischen. Verwenden Sie für alle LUV-Untersuchungen opake, schwarze, unbehandelte 96-Loch-Platten (Abbildung 1D).</li>
	<li>Lesen Sie die Platte bei 37 °C mit folgenden Parametern ab: Anregungs-Wellenlänge: 355 nm; Emissions-Wellenlänge: 520 nm; Verstärkung (Spannung): 125; Optikposition: Oben; Lesehöhe: 5,5 mm. Diese Einstellung gilt für das BioTek H1 Synergy mit der Gen 5 2.0-Software (Abbildung 1D).</li>
	<li>Fraktionen 3 und 4 zeigen im Allgemeinen einen 5- bis 10-fachen Anstieg der Fluoreszenz. Nach der Analyse werden die Fraktionen, die LUVs enthalten, vereinigt und bei 4 °C im Dunkeln gelagert; dabei werden etwa 2 ml einer ca. 2 mM Lipidlösung gewonnen (Abbildung 1D).</li>
</ol>
5. Untersuchungen der BCL-2-Familie unter Verwendung von LUVs
<ol>
	<li>Es wird getestet, ob BCL-2-Proteine die direkte Permeabilisierung von LUVs auslösen können und ob sie die Permeabilisierungsaktivität regulieren. LUV-Assays werden normalerweise in 100 μl Volumen bei 37 °C durchgeführt und können entweder als einzelner Zeitpunkt nach 30–60 min (Abbildung 2A–C, 3A–B) oder als kinetische Untersuchung alle 1–2 min über einen Zeitraum von bis zu 1 Stunde (Abbildung 2D) analysiert werden. Ein repräsentatives Assaydesign, das Komponenten, Stammlösungs-/Endkonzentrationen sowie die Reihenfolge der Zugabe beschreibt, wird bereitgestellt (Tabelle 1). Es ist außerdem ratsam, den Mikroplattenreader vor jeder Messung sanft schütteln zu lassen. Die ersten Minuten ergeben oft unregelmäßige Messwerte (vermutlich aufgrund von Temperaturschwankungen, Vermischung usw.), weshalb wir in kinetischen Studien in der Regel die Datenpunkte nach den ersten 2–3 Messungen berücksichtigen. Es ist ebenfalls nicht ungewöhnlich, dass für einige Bedingungen große Fehlerbalken entstehen, bedingt durch die Variabilität der LUV-Partien und die Effizienz der Proteininteraktionen bei Konzentrationen nahe der Aktivierungs- oder Hemmschwelle.</li>
	<li>Stammlösungen der BCL-2-Familie-Proteine sollten in LUV-Puffer auf eine 100-fache Konzentration verdünnt werden, und es müssen Titrationen von BAX, BID sowie aller weiteren Proteine durchgeführt werden, um die niedrigsten Konzentrationen zu ermitteln, die erforderlich sind, um eine minimale, BAX-abhängige LUV-Permeabilisierung in Abwesenheit von BID sowie eine signifikante Synergie zwischen BAX und BID nachzuweisen. Außerdem sind Titrationen aller weiteren Proteine erforderlich, um Proteinverschwendung zu vermeiden und die Konzentrationen nachfolgender Proteinzugaben zu minimieren.</li>
</ol>
6. Repräsentative Ergebnisse
Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, die BCL-2-Familie-abhängige Regulation der LUV-Permeabilisierung zu beobachten und zu untersuchen. Um eine positive Kontrolle für die LUV-Permeabilisierung zu erzeugen, verwenden wir detergensaktiviertes BAX12. Das Detergens n-Octyl-β-D-glucosid (OG) löst künstlich die Aktivierung von BAX aus (für 100 μl von 2,3 μM OG-BAX: 5 μg BAX + 0,7 % OG in LUV-Puffer, 60 min bei 4 °C inkubieren, Aliquote herstellen und bei -80 °C lagern), weshalb OG-BAX (10–100 nM) als zuverlässige positive Kontrolle verwendet werden kann. Es sei darauf hingewiesen, dass OG-Konzentrationen unterhalb von 0,025 % die LUV-Permeabilisierung nicht direkt beeinflussen. Eine Behandlung mit 0,5 % CHAPS dient dazu, die maximale Menge an LUV-Fluoreszenz pro Assay zu bestimmen, und dieser Wert wird als 100 %-Wert festgelegt. Alle Behandlungen sollten im Dreifachansatz angelegt werden. Ein Beispiel für den Aufbau eines LUV-Kontrollassays ist in Tabelle 1 dargestellt, und die entsprechenden Daten werden in Abbildung 2A gezeigt.
Ein notwendiger Ausgangspunkt für die Untersuchung der Permeabilisierung von LUVs durch BCL-2-Familienproteine ist die Bestimmung der Konzentrationen von BAX und BID, die eine optimale Freisetzung fördern. Da verschiedene Proteinpräparationen unterschiedliche Hintergrund-Permeabilisierungsaktivitäten aufweisen, empfiehlt es sich, vor komplexeren Analysen eine Titration durchzuführen. BAX (50–200 nM) und BID (0–10 nM) müssen hinsichtlich minimaler Hintergrundfreisetzung und optimaler Synergie titriert werden, wie in Abbildung 2B–C dargestellt. Verschiedene Formen des BID-Proteins können von R&amp;D Systems bezogen werden; alternativ ist das BID-BH3-Domänen-Peptid von Anaspec erhältlich. Es gibt keine kommerzielle Form von BAX, die für LUV-Assays geeignet ist; daher muss es mithilfe publizierter Methoden exprimiert und gereinigt werden3,13.
Sobald die Konzentrationen von BAX und BID sowie deren Synergie festgelegt sind, besteht ein gängiger Test darin, den Einfluss anti-apoptotischer Proteine auf die BAX- und BID-abhängige Permeabilisierung von LUVs zu bestimmen. BCL-xL ist ein anti-apoptotisches Mitglied der BCL-2-Familie, das kommerziell erhältlich ist und in einer dosisabhängigen Weise die Aktivität von BAX und BID hemmt, üblicherweise im Bereich eines 5- bis 10-fachen molaren Überschusses gegenüber BAX oder BID (Abbildung 3A). Diese hemmende Wirkung kann durch die Zugabe nachfolgender BH3-only-Proteine (2- bis 5-facher molarer Überschuss gegenüber BCL-xL) oder BH3-Domänen-Peptide (5- bis 10-facher molarer Überschuss gegenüber BCL-xL) aufgehoben werden, die an BCL-xL binden und dadurch BAX und BID ermöglichen, synergistisch zu wirken und die LUVs zu permeabilisieren (Abbildung 3B). In Abbildung 3B zeigen wir die Wirkung des vollständigen rekombinanten humanen PUMAβ; das PUMA-BH3-Domänen-Peptid zeigt eine funktionell ähnliche Wirkung (Daten nicht gezeigt)8. Dieses Experiment wird üblicherweise als „Derepressionsassay“ bezeichnet, da das PUMA-Protein die hemmende Wirkung von BCL-xL auf BAX und BID aufhebt. Idealerweise sollte die Zugabe des dereprimierenden BH3-only-Proteins oder -Peptids nur minimale Auswirkungen auf die BAX-Aktivierung haben14.
<img alt="Diagramm zum Lipidsynthese- und Reinigungsprozess; detaillierte Schritte zur Chromatographie und Fraktionsanalyse." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. (A) Chloroform-lösliche Lipide werden vereinigt, eingeengt, um einen Lipidfilm zu bilden, und verschlossen. (B) Lösungen von ANTS und DPX werden hergestellt, gemischt und beschallt, um vollständige Löslichkeit und Homogenisierung sicherzustellen. Die Lösung wird dem Lipidfilm zugesetzt, das Gefäß mit Parafilm verschlossen und 5 min im Wasserbad beschallt. Die Lösung erscheint danach milchig. (C) Die beschallte Lipidlösung wird in den Mini-Extruder gegeben, 31-mal verarbeitet und anschließend auf eine vorbereitete Sepharose-S-500-Säule zur weiteren Reinigung aufgetragen. (D) Die nach der Größenauschlusschromatographie erhaltenen Fraktionen werden analysiert, indem die relativen Fluoreszenzeinheiten (RFUs) in LUV-Puffer und LUV-Puffer + 0,5 % CHAPS verglichen werden. Die Messung im „LUV-Puffer“ zeigt die Hintergrundfluoreszenz bei intakten LUVs an; die Bedingung „LUV-Puffer + 0,5 % CHAPS“ zeigt einen fluoreszenzsteigernden Lysiseffekt, der auf das Vorhandensein von LUVs hinweist. Fraktionen 3 und 4 enthalten gewöhnlich die LUVs und werden nach der Analyse vereinigt. Fraktionen 5 und 6 enthalten nicht eingebauten ANTS (d. h. nicht in den LUVs nach der Extrusion), der unabhängig von CHAPS eine hohe Fluoreszenz zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4291/4291fig1large.jpg" target="_blank"> Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Balkendiagramme zur LUV-Permeabilisierung, die Titrationseffekte von BAX und BID zeigen; Graph der Fluoreszenzintensität über die Zeit." fo:content-width="5.45in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. BCL-2-Familie-Kontrollexperimente und BAX/BID-Titrationen unter Verwendung von LUVs. (A) Kontrollexperimente. LUVs wurden ausschließlich mit LUV-Puffer, 0,025 % Octylglucosid „OG“, 50 nM BAX oder 50 nM OG-BAX behandelt. Die Inkubation der LUVs erfolgte 60 min bei 37 °C. Die prozentuale Permeabilisierung (%) wurde bestimmt, indem die Fluoreszenz der Pufferkontrolle von allen Proben abgezogen wurde; 100 % Permeabilisierung wurde anhand einer mit 0,5 % CHAPS solubilisierten Probe definiert. Die experimentellen Werte wurden durch den CHAPS-Wert dividiert, um die % LUV-Permeabilisierung zu erhalten. OG-BAX ist detergentaktiviertes BAX und dient als zuverlässige positive Kontrolle für die LUV-Permeabilisierung. (B) Ermittlung der optimalen BAX-Konzentration. LUVs wurden mit steigenden BAX-Konzentrationen (50–200 nM) in Gegenwart von 10 nM C8-BID „BID“ oder allein mit Puffer behandelt. (C) Ermittlung der optimalen BID-Konzentration. LUVs wurden mit steigenden BID-Konzentrationen (0–10 nM) in Gegenwart von 100 nM BAX behandelt. (D) Beispiel eines kinetischen Datensatzes zur LUV-Permeabilisierung. LUVs wurden mit BAX (100 nM) ± BID (10 nM) behandelt. Die Messungen wurden alle zwei Minuten über einen Zeitraum von 30 Minuten durchgeführt, wobei vor jeder Messung zwei Sekunden lang sanft geschüttelt wurde. Die ersten drei Messungen (0, 2 und 4 min) sind in der Grafik nicht enthalten. Die minimalen und maximalen relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) wurden wie in Abschnitt 4.3 beschrieben bestimmt. Die Fehlerbalken in Abbildung 2A–C repräsentieren die Standardabweichung aus dreifachen Messungen. Die Daten in 2D stammen aus einem zweifach durchgeführten Assay.
<img alt="Bar Diagramme zur LUV-Permeabilisierung; Einfluss von BID/BAX/BCL-xL und PUMA; experimentelle Analyse." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Beispiele häufiger Wechselwirkungen der BCL-2-Familie, die mithilfe von LUVs untersucht wurden. (A) Die durch BAX und BID vermittelte LUV-Permeabilisierung wird durch BCL-xL gehemmt. LUVs wurden mit 100 nM BAX, 10 nM BID und steigenden Konzentrationen von BCL-xL (0–500 nM) inkubiert. Die Inkubation der LUVs erfolgte 60 min bei 37 °C. (B) PUMA hebt die Repression durch BCL-xL auf, um die Funktion von BAX und BID zu fördern. LUVs wurden mit Kombinationen aus 100 nM BAX, 10 nM BID, 500 nM BCL-xL und (0–2,5 μM) PUMA 60 min bei 37 °C inkubiert. PUMA wurde bei alleiniger Verwendung mit BAX in einer Konzentration von 2,5 μM eingesetzt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aus dreifach durchgeführten Messungen.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reihenfolge der Zugabe:</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEDINGUNGEN</td>
			<td>LUV 
			Puffer</td>
			<td>OG 
			(0,7 %)</td>
			<td>BAX 
			(2,3 μM)</td>
			<td>OG-BAX 
			(2,3 μM)</td>
			<td>CHAPS 
			(10 %)</td>
			<td>LUVs 
			(2 mM)</td>
			<td>GESAMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puffer</td>
			<td>95 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG (0,015 %)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAX (50 nM)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td>-</td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG-BAX (50 nM)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS (0,5 %)</td>
			<td>90 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. Ein Kontrolltestbeispiel, um den Effekt von OG-BAX auf die LUV-Permeabilisierung zu bestimmen.

<ol><li>Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCL-2+family+reunion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The BCL-2 family reunion.</a> Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+ten+minutes+to+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: ten minutes to dead.</a> Cell. 121, 671-674 (2005).</li>
<li>Gavathiotis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAX+activation+is+initiated+at+a+novel+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAX activation is initiated at a novel interaction site.</a> Nature. 455, 1076-1081 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+trigger+apoptosis%2C+Bak+exposes+its+BH3+domain+and+homodimerizes+via+BH3%3Agroove+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions.</a> Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bak+activation+for+apoptosis+involves+oligomerization+of+dimers+via+their+alpha6+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices.</a> Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).</li>
<li>Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-triggered+structural+reorganization+drives+the+activation+of+proapoptotic+BAX%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX.</a> Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+apoptosis+induction+by+inhibition+of+the+anti-apoptotic+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).</li>
<li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+BH3+domains+either+sensitize+or+activate+mitochondrial+apoptosis%2C+serving+as+prototype+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipids+cooperate+to+form+supramolecular+openings+in+the+outer+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane.</a> Cell. 111, 331-342 (2002).</li>
<li>Lovell, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+by+tBid+initiates+an+ordered+series+of+events+culminating+in+membrane+permeabilization+by+Bax%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax.</a> Cell. 135, 1074-1084 (2008).</li>
<li>Hsu, Y. T., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonionic+detergents+induce+dimerization+among+members+of+the+Bcl-2+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family.</a> J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Bax%3A+coregulation+of+dimer+formation+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization.</a> Cell. 103, 645-654 (2000).</li>
<li>Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+other+than+Bim+and+Bid+can+directly+activate+Bax%2FBak%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak.</a> J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Die beschriebene Methode zur Herstellung von LUVs ermöglicht eine schnelle und effiziente Untersuchung der Funktion verschiedener BCL-2-Familienproteine, Peptide und verwandter Reagenzien in einem biochemisch definierten Membranmilieu, das der äußeren mitochondrialen Membran (OMM) ähnelt. Wenn Endpunktwerte zur Bestimmung der LUV-Permeabilisierung verwendet werden, können mehrere Platten eingerichtet werden, um innerhalb eines einzigen Tages Hunderte von Bedingungen zu analysieren. Wir stellen fest, dass die limitierende...

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph&amp;#8211;thanolamine &quot;PE&quot;</td><td>Avanti</td><td>850725C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholin (Ei, Huhn) &quot;PC&quot;</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylinositol (Leber, Rind) &quot;PI&quot;</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylserin (Gehirn, Schwein) &quot;PS&quot;</td><td>Avanti</td><td>8400320</td><td></td></tr><tr><td>Cardiolipin (Herz, Rind – Natriumsalz) &quot;CL&quot;</td><td>Avanti</td><td>840012C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder-Set</td><td>Avanti</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>PC-Membran 0,2 mM</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Costar Schwarz 96-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-8, gespaltener menschlicher BID</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>882-B8-050</td><td></td></tr><tr><td>Menschlicher BCL-xL (ohne C-Terminus)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>894-BX-050</td><td></td></tr><tr><td>BH3-Domänen-Peptide von BID/PUMA</td><td>Anaspec</td><td>61711/62404</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Hybrid-Multi-Mode-Mikroplattenreader</td><td>BioTek</td><td>Keine</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchen bcl-2 family funktion mit großen unilamellaren vesikeln

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Die BCL-2-(B-Zell-CLL/Lymphom-)Familie besteht aus etwa zwanzig Proteinen, die zusammenwirken, um entweder das Zellüberleben aufrechtzuerhalten oder die Apoptose einzuleiten1. Nach zellulärem Stress (z. B. DNA-Schäden) werden die proapoptotischen Effektoren der BCL-2-Familie, BAK (BCL-2-antagonistisches Killerprotein 1) und/oder BAX (BCL-2-assoziiertes X-Protein), aktiviert und beeinträchtigen die Integrität der äußeren mitochondrialen Membran (OMM) durch den als mitochondriale äußere Membranpermeabilisierung (MOMP) bezeichneten Prozess1. Nachdem MOMP eingetreten ist, gelangen proapoptotische Proteine (z. B. Cytochrom c) in das Cytoplasma, fördern die Aktivierung von Caspasen, und die Apoptose setzt rasch ein2.
Damit BAK/BAX die MOMP auslösen können, benötigen sie vorübergehende Wechselwirkungen mit Mitgliedern einer anderen pro-apoptotischen Untergruppe der BCL-2-Familie, den sogenannten BH3-only-Proteinen (Proteine mit BCL-2-Homologie-Domäne 3), wie beispielsweise BID (BH3-interagierende Domäne-Agonist)3–6. Anti-apoptotische Proteine der BCL-2-Familie (z. B. BCL-2-verwandtes Gen, langes Isoformprodukt, BCL-xL; myeloide Zellleukämie 1, MCL-1) regulieren das zelluläre Überleben, indem sie die Wechselwirkungen zwischen BAK/BAX und den BH3-only-Proteinen, die BAK/BAX direkt aktivieren können, streng kontrollieren7,8. Außerdem wird die Verfügbarkeit anti-apoptotischer BCL-2-Proteine auch durch Sensibilisator-/Derepressor-BH3-only-Proteine wie BAD (BCL-2-Antagonist des Zelltods) oder PUMA (p53-überregulierter Apoptosemodulator) bestimmt, die an anti-apoptotische Mitglieder binden und diese inhibieren7,9. Da der Großteil des anti-apoptotischen BCL-2-Repertoires an der äußeren mitochondrialen Membran (OMM) lokalisiert ist, wird die zelluläre Entscheidung zwischen Überleben und Induktion der MOMP durch zahlreiche Wechselwirkungen der BCL-2-Familie an dieser Membran gesteuert.
Große unilamellare Vesikel (LUVs) sind ein biochemisches Modell, um die Beziehungen zwischen den Wechselwirkungen der BCL-2-Proteinfamilie und der Membranpermeabilisierung zu untersuchen10. LUVs bestehen aus definierten Lipiden, die in Verhältnissen zusammengesetzt sind, die in Lipidzusammensetzungsstudien von mit Lösungsmittel extrahierten Xenopus-Mitochondrien identifiziert wurden (46,5 % Phosphatidylcholin, 28,5 % Phosphatidylethanolamin, 9 % Phosphatidylinositol, 9 % Phosphatidylserin und 7 % Kardiolipin)10. Dieses Modell ist ein geeignetes System, um die Funktion der BCL-2-Proteinfamilie direkt zu untersuchen, da die Protein- und Lipidbestandteile vollständig definiert und handhabbar sind, was bei primären Mitochondrien nicht immer der Fall ist. Obwohl Kardiolipin im äußeren mitochondrialen Membran (OMM) normalerweise nicht in solch hohen Konzentrationen vorkommt, bildet dieses Modell das OMM dennoch zuverlässig nach, um die Funktion der BCL-2-Proteinfamilie zu fördern. Darüber hinaus ermöglicht eine neuere Modifikation des oben beschriebenen Protokolls kinetische Analysen von Proteinwechselwirkungen und Echtzeitmessungen der Membranpermeabilisierung, basierend auf LUVs, die einen polyanionischen Farbstoff (ANTS: 8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonsäure) und einen kationischen Quencher (DPX: p-Xylol-bis-pyridiniumbromid)11 enthalten. Wenn die LUVs permeabil werden, diffundieren ANTS und DPX voneinander weg, und ein Anstieg der Fluoreszenz wird detektiert. Im Folgenden werden üblicherweise verwendete rekombinante Kombinationen von BCL-2-Familienproteinen sowie Kontrollen unter Verwendung von LUVs mit ANTS/DPX beschrieben.

Biochemisch definierte große unilamellare Vesikel (LUVs) stellen ein geeignetes Modellsystem dar, um Wechselwirkungen der BCL-2-Familie zu analysieren, was direkte Auswirkungen auf das bessere Verständnis des mitochondrialen Signalwegs der Apoptose hat. Eine Methode zur Herstellung von LUVs sowie standardmäßige Kombinationen von BCL-2-Familienproteinen und Kontrollen zur Untersuchung der Permeabilisierung von LUVs werden vorgestellt.

Untersuchen BCL-2 Family Funktion mit großen unilamellaren Vesikeln

Die BCL-2-Familie (B-Zell-CLL/Lymphom) besteht aus etwa zwanzig Proteinen, die zusammenwirken, um entweder das Überleben der Zelle aufrechtzuerhalten oder ...

Dieses biochemisch definierte Modellsystem aus großen Ella-Vesikeln ahmt die äußere mitochondriale Membran nach, um die Funktion von BCL-two-Proteinen in vitro zu beobachten. Mischen Sie zunächst die Lipide und erzeugen Sie einen Lipidfilm in einem verschlossenen Röhrchen. Bereiten Sie danach eine frische LUV-Lösung vor und lösen Sie den Lipidfilm darin auf.Anschließend wird die Lipidlösung extrudiert und die großen Ella-Liposomen mittels Gelfiltration gereinigt. Im letzten Schritt erfolgt die Analyse der LUVs auf eine detergentinduzierte Zunahme der Fluoreszenz. Letztendlich kommt das LUV-Modellsystem zum Einsatz, um die Funktion und Regulation membranpermeabler Proteine wie rekombinanter BCL-2-Proteine zu bewerten.Dieser Ansatz unter Verwendung großer unilameller Vesikel bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Systemen wie Mitochondrien. Sie werden mit gereinigten Lipiden in Abwesenheit von Proteinen erzeugt. Sie sind biochemisch sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer Größe definiert.Dies ermöglicht eine klare Interpretation der Ergebnisse, da die einzigen untersuchten Proteine diejenigen sind, die Sie hinzufügen. Diese Methode kann Einblicke in die Mechanismen liefern, wie die BCL-2-Familie die Integrität der äußeren mitochondrialen Membran reguliert. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewendet werden, die Membranumgestaltung und Permeabilitätsaktivität untersuchen.Dazu gehören mitochondriale Dynamik-Maschinerie oder bakterielle Toxine. Arbeiten Sie in einer Abzugshaube mit minimaler Beleuchtung. Spülen Sie eine Hamilton-Gast-Glaskolben-Spritze mit Chloroform. Dann in einem 1,5-Milliliter-GL-Glasküvetten die vier Milligramm chloroformlöslicher Lipide kombinieren. Anschließend den Chloroform durch Anlegen eines sanften Stroms eines Inertgases wie Stickstoff oder Argon entfernen. Nach zwei bis drei Stunden überprüfen, ob ein trockener Lipidfilm auf dem Boden und an den Wänden der Küvette im LUV-Puffer vorliegt.Stellen Sie 500-Mikroliter-Lösungen des Polyanionfarbstoffs und des CAS-ionischen Quenchers her und wirbeln Sie diese. Mischen Sie anschließend die A-NTS- und DPX-Lösungen, wirbeln Sie eine Minute lang und geben Sie sie in ein Ultraschallbad, um sicherzustellen, dass die Lösungen vollständig gelöst und homogen sind.Geben Sie nun die A-N-T-S-D-P-X-Lösung zum Lipidfilm hinzu, verschließen Sie das Gefäß mit Parafilm und sonifizieren Sie den Lipidfilm fünf Minuten lang. Nach der Sonifikation erscheint die Lösung milchig. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig solubilisiert ist, da kleine Lipidaggregate die nachfolgenden Schritte negativ beeinflussen würden. Überprüfen Sie außerdem den Boden und die Wände des Gefäßes, um sicherzustellen, dass kein Lipidfilm mehr zurückgeblieben ist.Bauen Sie den Extruder gemäß den Herstelleranweisungen zusammen, wobei Sie den LUV-Puffer verwenden, um die Filterträger und die Polycarbonatmembran anzufeuchten. Ziehen Sie das Gehäuse des Geräts so fest, dass während der Extrusion kein Volumenverlust auftritt, jedoch nicht übermäßig fest, um die Membran nicht zu beschädigen. Prüfen Sie den Extruder zunächst mit LUV-Puffer, um sicherzustellen, dass keine Leckagen oder Probleme auftreten. Füllen Sie nun die rechte Spritze mit der Lipidlösung und extrudieren Sie 31-mal, damit die großen ELLA-Vesikel mindestens einmal durch die Membran treten und sich in der linken Spritze sammeln. Bei den ersten paar Extrusionsschritten kann etwas mehr Druck erforderlich sein, falls die Lösung plötzlich schnell durch die Membran fließt.Überprüfen Sie die Membran auf Risse und ersetzen Sie sie bei Bedarf. Fügen Sie die Substanz in einem Schritt zur Säule hinzu. Vermeiden Sie es, die Bead-Grenzfläche zu stören.Lassen Sie die Pufferlösung aus der Säule laufen. Wenn der Durchfluss stoppt, verschließen Sie die Säule und füllen sie vorsichtig mit LUV-Puffer auf, wobei darauf zu achten ist, dass die Perlen nicht gestört werden. Entfernen Sie anschließend den Verschluss und sammeln Sie sechs Fraktionen zu je einem Milliliter.Die AUVs eluieren normalerweise in den Fraktionen drei und vier und können anhand eines trüben Aussehens identifiziert werden, um die Säulnwäsche zurückzugewinnen und bei vier Grad Celsius aufzubewahren. Die UUVs in der Säulenfraktion werden durch eine Zunahme der Fluoreszenz infolge der Anwesenheit von CHAPS nachgewiesen. Denken Sie daran, für alle LUV-Untersuchungen schwarze undurchsichtige 96-Loch-Platten zu verwenden.Pipettieren Sie 100 Mikroliter LUV-Puffer oder LUV plus 0,5 % CHAPS in sechs Vertiefungen. Geben Sie jeweils fünf Mikroliter der entsprechenden Fraktion hinzu und mischen Sie für die Biotech H one Synergy. Öffnen Sie die Gen5 2.0-Software, eingestellt auf eine Anregungs-Wellenlänge von 355 Nanometern und eine Emissions-Wellenlänge von 520 Nanometern.Verstärkungsspannung bei 125 Optikposition an der Oberseite und Ablesungshöhe auf 5,5 Millimeter einstellen. Nun die Platte bei 37 Grad Celsius ablesen und die LUV enthaltenden Fraktionen identifizieren. Die Fraktionen der gereinigten LUV abtrennen.Diese Assays wurden entwickelt, um die Fähigkeit von BCL-zwei-Proteinen zu messen, die Permeabilisierung von LUV direkt zu induzieren, sowie deren Regulierung. Kombinieren Sie die Bestandteile des Assays in der angegebenen Reihenfolge der Zugabe. Detaillierte Angaben zu den Titrationen von BS- und Bid-Proteinen sind in der begleitenden Veröffentlichung verfügbar.Die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für die jeweiligen Messzeitpunkte inkubieren. Das Mikrotiterplättchen in das Mikroplattenlesegerät einlegen, welches das Plättchen schüttelt und die Fluoreszenz wie zuvor gezeigt misst. In diesem Experiment werden mit OG-Detergens aktivierte Backs verwendet, um eine positive Kontrolle für die LUV-Permeabilisierung zu erzeugen.Beachten Sie, dass OG-Konzentrationen unter 0,025 % hier keine direkte Wirkung auf die LUV-Permeation haben. Eine Behandlung mit 0,5 % CHAPS dient ebenfalls dazu, die maximale Menge an LUV-Fluoreszenz pro Assay zu bestimmen. Ein notwendiger Ausgangspunkt für die Untersuchung der LUV-Permeation mit BCL-2-Familienproteinen ist die Ermittlung der Konzentrationen von Bax und Bid, um eine optimale Freisetzung zu ermöglichen.Diese Titrationskurven von Backs und Bid zeigen die minimale Hintergrundfreisetzung und optimale Synergie. Alternativ kann die LUV-Permeation kinetisch gemessen werden. Diese Messungen wurden alle zwei Minuten über einen Zeitraum von 30 Minuten durchgeführt, wobei vor jeder Messung zwei Sekunden lang leicht geschüttelt wurde.Dieses Experiment bestimmt den Einfluss eines anti-apoptotischen Proteins auf die BAK- und BID-abhängige LUV-Permeabilisierung. BCL-XL hemmt die Aktivität von BAK und BID in dosisabhängiger Weise. In einem BH3-only-Protein-Repressions-Assay kann die hemmende Wirkung durch die Zugabe nachfolgender BH3-only-Proteine aufgehoben werden.Beispielsweise bindet Puma-Beta an BCL-xL, wodurch Bax und Bid synergistisch wirken und die Membran durchlässiger werden können. Die großen ELLA-Vesikel: Nachdem diese Technik zur Erzeugung großer zellulärer Vesikel beherrscht ist, ermöglicht sie die effiziente und schnelle Analyse von BCL-2-Familienproteinen, Peptiden und kleinen Molekülen in einer biochemisch definierten Umgebung, die der äußeren mitochondrialen Membran ähnelt. Wichtig ist, dass dieser Test die schnelle Analyse von Hunderten von Bedingungen unter Verwendung sowohl von Endpunkten als auch kinetischer Parameter erlaubt.Vergessen Sie nicht, dass sowohl UUVs als auch das BCL zwei Proteine äußerst anfällig für durch Detergenzien verursachte Artefakte sind. Verwenden Sie saubere, detergentienfreie Geräte, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

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