Untersuchen BCL-2 Family Funktion mit großen unilamellaren Vesikeln

Dieses biochemisch definierte Modellsystem aus großen Ella-Vesikeln ahmt die äußere mitochondriale Membran nach, um die Funktion von BCL-two-Proteinen in vitro zu beobachten. Mischen Sie zunächst die Lipide und erzeugen Sie einen Lipidfilm in einem verschlossenen Röhrchen. Bereiten Sie danach eine frische LUV-Lösung vor und lösen Sie den Lipidfilm darin auf.

Anschließend wird die Lipidlösung extrudiert und die großen Ella-Liposomen mittels Gelfiltration gereinigt. Im letzten Schritt erfolgt die Analyse der LUVs auf eine detergentinduzierte Zunahme der Fluoreszenz. Letztendlich kommt das LUV-Modellsystem zum Einsatz, um die Funktion und Regulation membranpermeabler Proteine wie rekombinanter BCL-2-Proteine zu bewerten.

Dieser Ansatz unter Verwendung großer unilameller Vesikel bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Systemen wie Mitochondrien. Sie werden mit gereinigten Lipiden in Abwesenheit von Proteinen erzeugt. Sie sind biochemisch sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer Größe definiert.

Dies ermöglicht eine klare Interpretation der Ergebnisse, da die einzigen untersuchten Proteine diejenigen sind, die Sie hinzufügen. Diese Methode kann Einblicke in die Mechanismen liefern, wie die BCL-2-Familie die Integrität der äußeren mitochondrialen Membran reguliert. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewendet werden, die Membranumgestaltung und Permeabilitätsaktivität untersuchen.

Dazu gehören mitochondriale Dynamik-Maschinerie oder bakterielle Toxine. Arbeiten Sie in einer Abzugshaube mit minimaler Beleuchtung. Spülen Sie eine Hamilton-Gast-Glaskolben-Spritze mit Chloroform.

Dann in einem 1,5-Milliliter-GL-Glasküvetten die vier Milligramm chloroformlöslicher Lipide kombinieren. Anschließend den Chloroform durch Anlegen eines sanften Stroms eines Inertgases wie Stickstoff oder Argon entfernen. Nach zwei bis drei Stunden überprüfen, ob ein trockener Lipidfilm auf dem Boden und an den Wänden der Küvette im LUV-Puffer vorliegt.

Stellen Sie 500-Mikroliter-Lösungen des Polyanionfarbstoffs und des CAS-ionischen Quenchers her und wirbeln Sie diese. Mischen Sie anschließend die A-NTS- und DPX-Lösungen, wirbeln Sie eine Minute lang und geben Sie sie in ein Ultraschallbad, um sicherzustellen, dass die Lösungen vollständig gelöst und homogen sind.

Geben Sie nun die A-N-T-S-D-P-X-Lösung zum Lipidfilm hinzu, verschließen Sie das Gefäß mit Parafilm und sonifizieren Sie den Lipidfilm fünf Minuten lang. Nach der Sonifikation erscheint die Lösung milchig. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig solubilisiert ist, da kleine Lipidaggregate die nachfolgenden Schritte negativ beeinflussen würden. Überprüfen Sie außerdem den Boden und die Wände des Gefäßes, um sicherzustellen, dass kein Lipidfilm mehr zurückgeblieben ist.

Bauen Sie den Extruder gemäß den Herstelleranweisungen zusammen, wobei Sie den LUV-Puffer verwenden, um die Filterträger und die Polycarbonatmembran anzufeuchten. Ziehen Sie das Gehäuse des Geräts so fest, dass während der Extrusion kein Volumenverlust auftritt, jedoch nicht übermäßig fest, um die Membran nicht zu beschädigen. Prüfen Sie den Extruder zunächst mit LUV-Puffer, um sicherzustellen, dass keine Leckagen oder Probleme auftreten. Füllen Sie nun die rechte Spritze mit der Lipidlösung und extrudieren Sie 31-mal, damit die großen ELLA-Vesikel mindestens einmal durch die Membran treten und sich in der linken Spritze sammeln. Bei den ersten paar Extrusionsschritten kann etwas mehr Druck erforderlich sein, falls die Lösung plötzlich schnell durch die Membran fließt.

Überprüfen Sie die Membran auf Risse und ersetzen Sie sie bei Bedarf. Fügen Sie die Substanz in einem Schritt zur Säule hinzu. Vermeiden Sie es, die Bead-Grenzfläche zu stören.

Lassen Sie die Pufferlösung aus der Säule laufen. Wenn der Durchfluss stoppt, verschließen Sie die Säule und füllen sie vorsichtig mit LUV-Puffer auf, wobei darauf zu achten ist, dass die Perlen nicht gestört werden. Entfernen Sie anschließend den Verschluss und sammeln Sie sechs Fraktionen zu je einem Milliliter.

Die AUVs eluieren normalerweise in den Fraktionen drei und vier und können anhand eines trüben Aussehens identifiziert werden, um die Säulnwäsche zurückzugewinnen und bei vier Grad Celsius aufzubewahren. Die UUVs in der Säulenfraktion werden durch eine Zunahme der Fluoreszenz infolge der Anwesenheit von CHAPS nachgewiesen. Denken Sie daran, für alle LUV-Untersuchungen schwarze undurchsichtige 96-Loch-Platten zu verwenden.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter LUV-Puffer oder LUV plus 0,5 % CHAPS in sechs Vertiefungen. Geben Sie jeweils fünf Mikroliter der entsprechenden Fraktion hinzu und mischen Sie für die Biotech H one Synergy. Öffnen Sie die Gen5 2.0-Software, eingestellt auf eine Anregungs-Wellenlänge von 355 Nanometern und eine Emissions-Wellenlänge von 520 Nanometern.

Verstärkungsspannung bei 125 Optikposition an der Oberseite und Ablesungshöhe auf 5,5 Millimeter einstellen. Nun die Platte bei 37 Grad Celsius ablesen und die LUV enthaltenden Fraktionen identifizieren. Die Fraktionen der gereinigten LUV abtrennen.

Diese Assays wurden entwickelt, um die Fähigkeit von BCL-zwei-Proteinen zu messen, die Permeabilisierung von LUV direkt zu induzieren, sowie deren Regulierung. Kombinieren Sie die Bestandteile des Assays in der angegebenen Reihenfolge der Zugabe. Detaillierte Angaben zu den Titrationen von BS- und Bid-Proteinen sind in der begleitenden Veröffentlichung verfügbar.

Die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für die jeweiligen Messzeitpunkte inkubieren. Das Mikrotiterplättchen in das Mikroplattenlesegerät einlegen, welches das Plättchen schüttelt und die Fluoreszenz wie zuvor gezeigt misst. In diesem Experiment werden mit OG-Detergens aktivierte Backs verwendet, um eine positive Kontrolle für die LUV-Permeabilisierung zu erzeugen.

Beachten Sie, dass OG-Konzentrationen unter 0,025 % hier keine direkte Wirkung auf die LUV-Permeation haben. Eine Behandlung mit 0,5 % CHAPS dient ebenfalls dazu, die maximale Menge an LUV-Fluoreszenz pro Assay zu bestimmen. Ein notwendiger Ausgangspunkt für die Untersuchung der LUV-Permeation mit BCL-2-Familienproteinen ist die Ermittlung der Konzentrationen von Bax und Bid, um eine optimale Freisetzung zu ermöglichen.

Diese Titrationskurven von Backs und Bid zeigen die minimale Hintergrundfreisetzung und optimale Synergie. Alternativ kann die LUV-Permeation kinetisch gemessen werden. Diese Messungen wurden alle zwei Minuten über einen Zeitraum von 30 Minuten durchgeführt, wobei vor jeder Messung zwei Sekunden lang leicht geschüttelt wurde.

Dieses Experiment bestimmt den Einfluss eines anti-apoptotischen Proteins auf die BAK- und BID-abhängige LUV-Permeabilisierung. BCL-XL hemmt die Aktivität von BAK und BID in dosisabhängiger Weise. In einem BH3-only-Protein-Repressions-Assay kann die hemmende Wirkung durch die Zugabe nachfolgender BH3-only-Proteine aufgehoben werden.

Beispielsweise bindet Puma-Beta an BCL-xL, wodurch Bax und Bid synergistisch wirken und die Membran durchlässiger werden können. Die großen ELLA-Vesikel: Nachdem diese Technik zur Erzeugung großer zellulärer Vesikel beherrscht ist, ermöglicht sie die effiziente und schnelle Analyse von BCL-2-Familienproteinen, Peptiden und kleinen Molekülen in einer biochemisch definierten Umgebung, die der äußeren mitochondrialen Membran ähnelt. Wichtig ist, dass dieser Test die schnelle Analyse von Hunderten von Bedingungen unter Verwendung sowohl von Endpunkten als auch kinetischer Parameter erlaubt.

Vergessen Sie nicht, dass sowohl UUVs als auch das BCL zwei Proteine äußerst anfällig für durch Detergenzien verursachte Artefakte sind. Verwenden Sie saubere, detergentienfreie Geräte, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen.