Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

Dieses Experiment nutzt die selektive Modulation der Proteinkinase C ISO xms, um ihre mitochondrialen und zellulären Funktionen in proximalen tubulären Zellen der Niere unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen zu bestimmen. Isolieren Sie zunächst die primären proximalen tubulären Zellen der Niere aus der Nierenrinde oder den RPCs, die einen oxidativen Stoffwechsel aufweisen. Ähnlich wie bei proximalen Nierentubuli.

Vivo infiziert die RPCs mit adenoviralen Vektoren, die aktive und inaktive Formen von isys des Proteins exprimieren. Kinase C testet dann die verschiedenen mitochondrialen Funktionen und die Zellviabilität, um die Wirkung des is zyms auf die mitochondriale Fähigkeit zur Synthese von A TP und zur Verhinderung des Zelltods zu bestimmen. Führen Sie auch eine Immun-Blot-Analyse von phosphorylierten und Proteinkinase C epsilon in zellulären Lysaten durch, die zusammen eingenommen werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung der Proteinkinase Epsilon die mitochondriale Fähigkeit zur Erzeugung von A TP negativ reguliert, die zellulären Spiegel eines TP und die Lebensfähigkeit der proximalen tubulären Zellen der Niere verringert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Techniken, wie z.B. Zelllinien, besteht darin, dass Primärkulturen von renalen proximalen tubulären Zellen die Differenzierungsfunktionen beibehalten und me von proximalen Nierenzellen oxidieren. Da Proteinkinasen als Ziele und potenzielle Therapeutika verwendet werden können, erstrecken sich die Auswirkungen dieser Technik auf die Therapie, die Verhinderung von Nierenschäden oder die Beschleunigung der Nierengenesung nach einer Verletzung.

Diese Methode kann den Mechanismus, die Verletzung und die Genesung aufzeigen. Es kann auch auf wie z.B. die frisch isolierte Kaninchenniere nacheinander mit 50 Millilitern aufgetragen werden. Jeweils sterile D-M-E-M-F 12 mittelsterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4 und PBS-Eisenoxidlösung zur Entnahme der Rinde jeder Niere.

Homogenisieren Sie zunächst das Gewebe mit einem 15-Milliliter-Down-Homogenisator. Anschließend wird das Homogenat durch zwei sterile Maschensieb in ein steriles Ein-Liter-Becherglas gegeben. Spülen Sie die auf den Sieben verbleibenden Zellen mit deferoxaminhaltigem Puffer aus.

Übertragen Sie das am Boden verbliebene Gewebe auf 40 Milliliter Deferoxamin enthaltenden Puffer und geben Sie ihn in ein konisches Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit dem starken Magneten.

Fangen Sie die eisengefüllten Glomeruli ein und saugen Sie das am Magneten befestigte Eisen an. Stellen Sie das Volumen der Zellsuspension auf 40 Milliliter ein und fügen Sie einen Milliliter Verdauungsmedium hinzu, das Kollagenase enthält. 17 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Mischen Sie die Suspension vorsichtig. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 50 mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius nach mehreren Wäschen. Suspendieren Sie das Zellpellet in 46 Millilitern Medium, das keinen Glukosekeim enthält.

Die primäre RT wird bei einer Dichte von einem Milligramm Protein pro Schale in zwei Millilitern glukosefreiem D-M-E-M-F 12-Medium auf einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultiviert. Nach dem Auffüllen des Mediums fahren Sie fort, konfluente RPT-Zellen mit Adenoviren zu infizieren, die CD NA tragen, um entweder konstitutiv aktive Proteinkinase, C epsilon oder dominante negative Proteinkinase C epsilon zu inkubieren, 24 Stunden lang zu inkubieren, das Medium aufzufüllen und die transfizierten primären RPCs für weitere 24 Stunden zu kultivieren. Um die mitochondriale Morphologie der primären Zellmonoschicht zu visualisieren, füllen Sie das Medium auf, fügen Sie MIT tracker red five 80 hinzu und stellen Sie die Schalen für 30 Minuten in den Inkubator zurück.

Untersuchen Sie dann die lebenden Monoschichten unter einem Fluoreszenzmikroskop unter Wasserimmersion. Ziel zwei. Um die mitochondriale Funktion zu beurteilen, bewerten Sie den Atmungszustand 3 der RPTC-Suspension in einer Sauerstoffverbrauchskammer, die mit einer Clark-Elektrode ausgestattet ist.

Erste Messung Zustand zwei Atmung in Abwesenheit eines DP. Geben Sie dann einen DP bis zu einer Endkonzentration von 0,4 Millimolar hinzu. Um die Atmung des dritten Zustands für die Atmung des vierten Zustands zu initiieren. Oligomycin bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter zugeben.

Fügen Sie auch eine Messung für die ungekoppelte Atmung hinzu, indem 0,5 mikromolare FCCP zu Zellen hinzugefügt werden, die im dritten Zustand atmen. Geben Sie langsam 20 Mikroliter 0,5 Millimolar JC, eine Lösung, in jede RPTC-Kulturschale und schwenken Sie, um den Farbstoff gründlich zu mischen. Stellen Sie die Schalen für 30 Minuten wieder in den Inkubator.

Legen Sie dann die Kulturen auf Eis und führen Sie zwei eiskalte PBS-Waschgänge durch. Ernten Sie dann die Zellen. Übertragen Sie RPT-Zellen in ein Einor-Röhrchen und brechen Sie die Monoschichten durch Pipettieren in Einzelzellsuspension auf.

Analysieren Sie die Fluoreszenz durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der Anregung durch einen 488-Nanometer-Argon-Ionenlaser. Berechnen Sie dann die mitochondrialen Membranpotential-isolierten Mitochondrien. Erleichtern Sie die Beurteilung der Integrität der Atmungskette.

Nach zwei Wäschen der RPTC-Monoschichten mit eiskaltem PBS-Puffer werden die Zellen geerntet und durch Zentrifugation pelletiert. Waschen Sie das Pellet einmal in einem Milliliter Puffer A und homogenisieren Sie dann die Zellen in einem Homogenisator eines Daunen, bis die meisten Zellen im Homogenat bei der Inspektion unter einem Mikroskop zerbrochen sind. Entfernen Sie anschließend die Zelltrümmer durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit.

Pelletieren Sie die rohen Mitochondrien aus dem Überstand bei 15.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und führen Sie drei Wäschen der pelletierten Mitochondrien in Puffer c durch, resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet in 50 bis 100 Mikrolitern des Assay-Puffers und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein, um die NADH-Ubichinonoxid-Reduktase-Aktivität zu bestimmen. Fügen Sie 500 Mikroliter des Assay-Puffers mit Zusätzen hinzu, und die Mitochondrien enthalten auch eine leere Probe, die alle Zusätze, aber keine Mitochondrien enthält. Äquilibrieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius und mischen Sie sie fünf Minuten lang.

Legen Sie als Nächstes die Platte in die Spezifikation und fügen Sie 10 Mikroliter 3,25 millimolare Ubichinon hinzu, um die Reaktion in jedem zu starten. Nehmen Sie die Extinktion bei 340 Nanometern drei Minuten lang in 22. Intervallen auf. Messen Sie in einem ähnlichen Assay die Aktivität der Cytochrom-C-Oxidase unter Verwendung von reduziertem Cytochrom C als Substrat für die A-TP-Synthase-Reaktion.

Bereiten Sie Mischungen für die Bestimmung der Gesamt-APAs-Aktivität und der Oligo-Mycin-unempfindlichen APA-Aktivität jeder Behandlungsgruppe vor. Inkubieren Sie die Proben in einer Reaktionsmischung bei 31 Grad Celsius für 10 Minuten. Starten Sie die Reaktion, indem Sie ein TP-Substrat hinzufügen und fünf Minuten lang bei 31 Grad Celsius inkubieren.

200 Mikroliter der Inkubationsmischung werden in ein Röhrchen mit 50 Mikrolitern dreimolaren TCA überführt und die Proteine 10 Minuten lang auf Eis gefällt. Anschließend durch Zentrifugation pelletieren. Laden Sie anschließend eine 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern jedes Phosphatstandards und 50 Mikrolitern jedes Probenüberstands in doppelter Ausführung.

Geben Sie dann 250 Mikroliter Sumner-Reagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Erfassen Sie dann die Absorption bei 595 Nanometern. Waschen Sie die RPTC-Monolayer zweimal mit eiskaltem PBS-Puffer.

Ernten Sie die Zellen in einem Milliliter PBS und überführen Sie die Zellsuspension in ein Einor-Röhrchen. Pelletieren Sie die RPTC-Proben durch Zentrifugation und bestimmen Sie den TP-Gehalt mit der Luciferase-Methode eines A-TP-Biolumineszenz-Assay-Kits. Für die Analyse der Zellviabilität in 35-Millimeter-Schalen verwenden Sie fünf RPTC-Monoschichten für drei Kontrollbehandlungsgruppen von Zellen, die positiv für On-Osis-Zellen sind, positiv für die Apoptose und eine Null-Flecken-Kontrolle für zwei Schalen.

Geben Sie zwei Mikroliter 50 millimolare Cisplatin in den zweiten Satz. Fügen Sie zwei Mikroliter 500 Millimolar Turt-Butylhydroperoxid hinzu. Nachdem Sie die Zellen mit Propidiumiodid gefärbt haben, wie im Begleittext beschrieben, waschen Sie die Monoschichten mit dem Bindungspuffer.

Als nächstes färben Sie die Zellen mit ANNEXIN five, konjugiert mit ZI, wie im Textprotokoll beschrieben. Ernten Sie dann die Zellen schonend und suspendieren Sie sie in 500 Mikrolitern Bindungspuffer. Mit einem Gummipolizisten.

Verwenden Sie eine Pipette, um die Zellen in eine Einzelzellsuspension zu dispergieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in Durchflusszytometrieröhrchen. Dispergieren Sie die Zellen in eine Einzelzellsuspension. Fahren Sie sofort mit der Quantifizierung der Fluoreszenz für PI und FE durch Durchflusszytometrie fort: Die adenovirale Verabreichung von CD NA, die Beschichtung der KONSTITUENTLY active und der inaktiven Mutanten von Proteinkinase C Epsilon führt zu signifikant erhöhten Proteinspiegeln von Proteinkinase C epsilon in RPTC und in Mitochondrien.

Erwartungsgemäß ist die konstitutiv aktive Form des Enzyms in RP tcs phosphoryliert und das dominante negative Enzym ist nicht phosphoryliert. Das Vorhandensein von aktiver Proteinkinase C Epsilon verringert die mitochondriale Atmung in RPTC, unabhängig vom Substrat, das zur Energetisierung der Mitochondrien verwendet wird. Die inaktive Proteinkinase C Epsilon hat jedoch keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung.

Interessanterweise reduziert die Aktivierung der Proteinkinase C epsilon in RP TCS die Aktivität von Komplexen eins zu vier. Diese Abnahme der RPTC-Atmung ist mit einer Erhöhung des mitochondrialen Membranpotentials verbunden. Die dominante negative Mutante hat keinen solchen Effekt.

Diese Veränderungen gehen auch mit einer Abnahme der Aktivität einer TP-Synthase in Mitochondrien einher, die aus RPTC isoliert wurde, über die Expression der aktiven Proteinkinase C epsilon. Infolgedessen wird der A-TP-Gehalt von RPTC über die Expression der aktiven Proteinkinase C Epsilon verringert und die anhaltende Aktivierung der Proteinkinase verringert. C epsilon hat tiefgreifende Auswirkungen auf die mitochondriale Morphologie, was durch die mitochondriale Fragmentierung belegt wird.

Proteinkinase C-Aktivierung, aber keine Hemmung. Führt auch zu Veränderungen in der RPTC-Morphologie, die zu einer Zellschrumpfung und -verlängerung der überlebenden Zellen führen. Diese mitochondrialen Effekte der Überexpression der aktiven Proteinkinase C epsilon in RPCs korrelierten auch mit dem Zelltod sowohl durch ONS als auch durch Apoptose.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine in Primärkulturen mit adenoviraler Technik überexprimiert werden können und wie Sie die mitochondriale Kapazität für eine TP-Synthese beurteilen können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Und mangelhaft, Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Adenovirus-Zugang, also treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, wie angemessen.