Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

Dieses Experiment nutzt die gezielte Modulation der Proteinkinase-C-ISO-Xms, um deren mitochondriale und zelluläre Funktionen in primären proximalen tubulären Nierenzellen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen zu bestimmen. Zunächst werden primäre proximale tubuläre Nierenzellen aus der Nierenrinde oder RPCs, die einen oxidativen Metabolismus aufweisen, isoliert. Dieser ähnelt dem der proximalen Nierentubuli.

Infizieren Sie die RPCs in vivo mit adenoviralen Vektoren, die aktive und inaktive Formen der Proteinkinase C exprimieren. Untersuchen Sie anschließend verschiedene mitochondriale Funktionen und die Zellviabilität, um den Einfluss des Enzyms auf die mitochondriale Fähigkeit zur ATP-Synthese und zur Verhinderung des Zelltods zu bestimmen. Führen Sie außerdem eine Immunoblot-Analyse von phosphoryliertem Proteinkinase-C-epsilon in zellulären Lysaten gemeinsam durch.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung der Proteinkinase Epsilon die mitochondriale Fähigkeit zur Erzeugung von ATP negativ reguliert, die zellulären ATP-Spiegel sowie die Vitalität von primären proximalen tubulären Nierenzellen verringert. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie Zelllinien, liegt darin, dass primäre Kulturen proximaler tubulärer Nierenzellen die differenzierten Funktionen und den oxidativen Metabolismus der proximalen Niere bewahren. Da Proteinkinasen als Zielstrukturen und potenzielle therapeutische Wirkstoffe eingesetzt werden können, ergeben sich für diese Technik Implikationen für die Therapie, insbesondere zur Verhinderung von Nierenschäden oder zur Beschleunigung der Nierenregeneration nach einer Verletzung.

Diese Methode kann Einblicke in die Mechanismen von Verletzungen und der Regeneration geben. Sie kann auch beispielsweise auf die Perfusion frisch isolierter Kaninchenniere angewendet werden, wobei nacheinander 50 Milliliter steriles D-M-E-M-F-12-Medium, sterile phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4, und PBS-Eisenoxid-Lösung verwendet werden, um die Rinde jeder Niere zu gewinnen.

Homogenisieren Sie das Gewebe zunächst mit einem 15-Milliliter-Down-Homogenisator. Anschließend wird das Homogenat durch zwei sterile Maschensiebe in einen einliterigen sterilen Becher filtriert. Spülen Sie die auf den Sieben verbliebenen Zellen mit einem Puffer, der Deferoxamin enthält, ab.

Überführen Sie das verbliebene Gewebe am Boden durch ein 85-Mikron-Sieb in 40 Milliliter Pufferlösung, die Deferoxamin enthält und in einem kegelförmigen Zentrifagenröhrchen aufbewahrt wird. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit dem starken Magneten.

Fangen Sie die eisenhaltigen Glomeruli ein und saugen Sie das am Magneten haftende Eisen ab. Stellen Sie das Volumen der Zellsuspension auf 40 Milliliter ein und geben Sie ein Milliliter Digestionsmedium mit Kollagenase hinzu. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 17 Minuten.

Vorsichtig die Suspension mischen. Die Zellen nach mehreren Waschschritten durch Zentrifugation bei 50 × g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius gewinnen. Den Zellenpellet in 46 Milliliter Medium ohne Glucose-Zusatz resuspendieren.

Die primären RT-Zellen bei einer Dichte von einem Milligramm Protein pro Schale in zwei Milliliter glucosefreiem D-M-E-M-F12-Medium auf einem Rotationskorb bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid kultivieren. Nach Auffüllen des Mediums die konfluenten RPT-Zellen mit einem Adenovirus infizieren, das die cDNA für entweder konstitutiv aktives Proteinkinase Cε oder dominant-negatives Proteinkinase Cε trägt, 24 Stunden inkubieren, das Medium erneuern und die transfizierten primären RPCs weitere 24 Stunden kultivieren. Um die mitochondriale Morphologie der primären Zellmonoschicht sichtbar zu machen, das Medium auffüllen, MitoTracker Red 580 zugeben und die Schalen 30 Minuten in den Inkubator zurückstellen.

Danach untersuchen Sie die lebenden Zellschichten unter einem Fluoreszenzmikroskop mit Wassereintauchung. Objektiv zwei. Um die mitochondriale Funktion zu beurteilen, bewerten Sie die Atmung im Zustand drei der RPTC-Suspension in einer Sauerstoffverbrauchskammer, die mit einer Clark-Elektrode ausgestattet ist.

Messen Sie zuerst die Atmung im Zustand zwei in Abwesenheit eines DP. Dann fügen Sie ein DP bis zu einer Endkonzentration von 0,4 Millimolar hinzu. Um die Atmung im Zustand drei für die Atmung im Zustand vier einzuleiten, geben Sie Oligomycin bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.

Schließen Sie auch eine Messung der entkoppelten Atmung ein, indem Sie 0,5 Mikromolar FCCP zu den Zellen in Zustand drei hinzufügen. Geben Sie langsam 20 Mikroliter einer 0,5 Millimolar JC-1-Lösung zu jeder RPTC-Kulturschale hinzu und schwenken Sie, um den Farbstoff gründlich zu vermischen. Stellen Sie die Schalen für 30 Minuten zurück in den Inkubator.

Als Nächstes stellen Sie die Kulturen auf Eis und führen zwei Waschungen mit eiskaltem PBS durch. Danach gewinnen Sie die Zellen. Überführen Sie die RPT-Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen und lösen Sie die Monoschichten durch Pipettieren in eine Einzelzell-Suspension auf.

Analysieren Sie die Fluoreszenz per Durchflusszytometrie unter Verwendung einer Anregung durch einen 488 Nanometer Argon-Ionen-Laser. Berechnen Sie anschließend das mitochondriale Membranpotential isolierter Mitochondrien. Ermöglichen Sie die Beurteilung der Integrität der Atmungskette.

Nach zwei Waschungen der RPTC-Monolayer mit eiskaltem PBS-Puffer die Zellen gewinnen und durch Zentrifugation pelletieren. Das Pellet einmal mit einem Milliliter Puffer A waschen, dann die Zellen in einem Dounce-Homogenisator homogenisieren, bis die meisten Zellen im Homogenat unter dem Mikroskop als aufgebrochen erscheinen. Anschließend zelluläre Trümmer durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit entfernen.

Pelletieren Sie die rohen Mitochondrien aus dem Überstand bei 15.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und waschen Sie die pelletierten Mitochondrien dreimal in Puffer C. Resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet in 50 bis 100 Mikrolitern des Testpuffers und gefrieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein, um die NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase-Aktivität zu bestimmen. Geben Sie 500 Mikroliter des Testpuffers mit Zusätzen und Mitochondrien hinzu; fügen Sie außerdem eine Blindprobe hinzu, die alle Zusätze enthält, jedoch keine Mitochondrien. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius mit Rühren für fünf Minuten.

Als Nächstes stellen Sie die Platte in das Spektralphotometer und geben 10 Mikroliter einer 3,25 Millimolar-Lösung von Ubichinon hinzu, um die Reaktion in jedem Küvette zu starten. Erfassen Sie die Extinktion bei 340 Nanometern über einen Zeitraum von drei Minuten in Abständen von jeweils 22 Sekunden. In einem ähnlichen Test messen Sie die Aktivität der Cytochrom-c-Oxidase unter Verwendung von reduziertem Cytochrom c als Substrat für die ATP-Synthase-Reaktion.

Bereiten Sie die Ansätze zur Bestimmung der gesamten APAs-Aktivität und der Oligomycin-unempfindlichen APAs-Aktivität jeder Behandlungsgruppe vor. Inkubieren Sie die Proben in der Reaktionsmischung bei 31 Grad Celsius für 10 Minuten. Starten Sie die Reaktion durch Zugabe eines TP-Substrats und inkubieren Sie bei 31 Grad Celsius für fünf Minuten.

Übertragen Sie 200 Mikroliter der Inkubationsmischung in ein Reagenzröhrchen, das 50 Mikroliter dreimolares TCA enthält, und fallen Sie die Proteine 10 Minuten auf Eis aus. Anschließend pelletieren Sie durch Zentrifugation. Danach geben Sie in eine 96-Well-Platte jeweils 50 Mikroliter der Phosphatstandards und 50 Mikroliter des Überstandes jeder Probe in Duplikat hinein.

Dann 250 Mikroliter Sumner-Reagenz zu jedem Well geben und 15 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Extinktion bei 595 Nanometern messen. Die RPTC-Monolayer zweimal mit eiskaltem PBS-Puffer waschen.

Die Zellen in einem Milliliter PBS gewinnen und die Zellsuspension in ein Eppendorfrohr überführen. Die RPTC-Proben durch Zentrifugation pelletieren und den Gesamtproteingehalt mit der Luciferase-Methode eines ATP-Biolumineszenz-Assay-Kits bestimmen. Zur Analyse der Zellviabilität in 35-Millimeter-Dishs fünf RPTC-Monolagen für drei Kontrollbehandlungsgruppen verwenden: Zellen positiv für Onose, Zellen positiv für Apoptose und eine unbehandelte Kontrolle ohne Färbung, jeweils auf zwei Dishes.

Geben Sie zwei Mikroliter einer 50 Millimolar-Lösung von Cisplatin zur zweiten Probe hinzu. Fügen Sie zwei Mikroliter einer 500 Millimolar-Lösung von tert-Butylhydroperoxid hinzu. Nach der Färbung der Zellen mit Propidiumiodid gemäß dem begleitenden Text waschen Sie die Zellschichten mit dem Bindungspuffer.

Färben Sie anschließend die Zellen mit ANNEXIN fünf, konjugiert mit ZI, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach heben Sie die Zellen vorsichtig ab und suspendieren sie in 500 Mikrolitern Bindungspuffer. Unter Verwendung eines Gummispatels.

Verwenden Sie eine Pipette, um die Zellen in eine Einzelzell-Suspension zu dispergieren, und überführen Sie die Zellsuspension in Durchflusszytometrie-Röhrchen. Dispergieren Sie die Zellen in eine Einzelzell-Suspension. Fahren Sie unverzüglich mit der Quantifizierung der Fluoreszenz für PI und FE mittels Durchflusszytometrie fort. Die adenovirale Expression von CD NA, die die konstitutiv aktiven und inaktiven Mutanten der Proteinkinase C Epsilon umfasst, führt zu signifikant erhöhten Proteinspiegeln der Proteinkinase C Epsilon in RPTC und in den Mitochondrien.

Wie erwartet ist die konstitutiv aktive Form des Enzyms in RP-TCS phosphoryliert, während das dominant negative Enzym nicht phosphoryliert ist. Die Präsenz aktiver Proteinkinase C-Epsilon verringert die mitochondriale Atmung in RPTC, unabhängig vom verwendeten Substrat zur Energetisierung der Mitochondrien. Die inaktive Proteinkinase C-Epsilon hat jedoch keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung.

Interessanterweise führt die Aktivierung der Proteinkinase C-Epsilon in RP-TCS zur Verringerung der Aktivität der Komplexe I und IV. Diese Abnahme der Atmung in RP-TCS ist mit einem Anstieg des mitochondrialen Membranpotentials assoziiert. Der dominant negative Mutant zeigt keine derartige Wirkung.

Diese Veränderungen gehen ebenfalls mit einer Verringerung der Aktivität einer TP-Synthase in aus RPTC isolierten Mitochondrien einher, die die aktive Proteinkinase C epsilon überexprimieren. Infolgedessen ist der ATP-Gehalt von RPTC, die die aktive Proteinkinase C epsilon überexprimieren, verringert. Eine anhaltende Aktivierung der Proteinkinase C epsilon hat tiefgreifende Auswirkungen auf die mitochondriale Morphologie, wie durch mitochondriale Fragmentierung belegt wird.

Aktivierung, jedoch nicht Hemmung der Proteinkinase C führt ebenfalls zu Veränderungen der RPTC-Morphologie, die mit Zellschrumpfung und Verlängerung der überlebenden Zellen einhergehen. Diese mitochondrialen Effekte der Überexpression der aktiven Proteinkinase C Epsilon in RPCs korrelierten zudem mit Zelltod durch Nekrose und Apoptose.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine in primären Kulturen mittels adenoviraler Technik überexprimiert und die mitochondriale Kapazität für die TP-Synthese bewertet werden kann. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Und nicht zuletzt: Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Adenoviren Risiken birgt, daher sind Vorsichtsmaßnahmen wie angemessene Schutzvorkehrungen erforderlich.