Name: Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung Plasmodium falciparum-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Lernen Sie ein standardisiertes Protokoll zur Untersuchung thrombozytenvermittelter Verklumpung von Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten in klinischen Isolaten. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in ressourcenarmen Umgebungen.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Wellcome Trust. JM (080964) und SCW (080948) wurden von Wellcome Trust Stipendien und DT von einem Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Stipendium unterstützt.

1. Probenentnahme Thrombozyten kann leicht durch Temperatur, Bewegung oder Lagerung aktiviert werden und sollten daher mit Vorsicht behandelt werden. Die Verwendung von Vacutainern Blut für Blutplättchenzubereitung sammeln unvermeidbar ist in den meisten klinischen Situationen, sollte aber sorgfältig geprüft werden als Saug potenziell verursachen können Thrombozyten-Aktivierung. Aufgrund der klinischen Protokoll bei unserer Forschung Krankenhaus verwendet werden, sind unsere Proben vorsichtig in Natriumcitrat Vacutainern gesammelt. Wir haben keine Probleme mit der vorzeitigen Thrombozytenaktivierung in dieser oder unserer früheren Studie 12 erlebt. Wir sammeln Blut für Blutplättchen-Zubereitung von Blutgruppe O + Einzelpersonen unspezifische Blutgruppenantigen Aggregation zu minimieren. Die Geber haben auch keine Medikamente in den letzten 7-10 Tage, da einige Medikamente bekannt sind die Thrombozytenfunktion beeinflussen gemacht. 1.1 Herstellung von Plättchen-reichem Plasma (PRP) <ol><li> Sammeln Sie ca. 5 mlVollblut aus einem Malaria naive Host oder 2,5 ml Blut aus CM oder schwerer Malaria (SM) der Patienten in einem Natrium-Citrat vacutainer (BD Produkt-Nummer 36276). </li><li> Zentrifugieren des Vollbluts bei 250 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Nicht bei 4 ° C zentrifugiert, da niedrige Temperaturen können die Thrombozyten zu aggregieren verursachen. </li><li> Sorgfältig übertragen die trübe Überstand in ein sauberes 15 ml Tube. Thrombozyten werden leicht durch Temperaturschwankungen und Erschütterungen aktiviert und sollten daher mit Vorsicht behandelt werden. Vermeiden Sie Schütteln oder keine ruckartigen Bewegungen des Rohres. </li><li> Verwenden Sie einen Neubauer haematocytometer zu zählen und stellen Sie die Plättchensuspension bis&gt; 300 x 10 3 Blutplättchen / ul für gesunde Spender und &lt;150 x 10 3 Blutplättchen / ul von CM und SM Patienten mit 1X Phosphat-Puffer (pH 7,2-7,4; PBS). Achten Sie auf eine hohe Verdünnung Faktor wählen, um die Thrombozyten zu erleichtern und sicherzustellen, deren Richtigkeit. </li></ol> Hinweis: Malaria patients eine reduzierte Thrombozytenzahl im Vergleich zu den gesunden Personen 16,17,18. Daher Thrombozytenkonzentrationen für CM und UM sind nach dem Durchschnitt der Thrombozyten für die Patienten in jeder Gruppe Diagnose Malaria angepasst. Die P. falciparum Verklumpung Phänotyp ist üblich in CM Isolate und zeigt eine starke Affinität daher die reduzierte Thrombozyten-Konzentrationen nicht beeinflusst Klumpen Größe oder Frequenz seit Thrombozytenkonzentration ist standardisiert für alle CM Fällen. 1.2 Herstellung von Plättchen-armes Plasma (PPP) <ol><li> Um PPP erhalten, Zentrifuge einen Teil des PRP oben bei 1.500 xg für 10 min erhalten. Die Mehrheit der Thrombozyten sind an der Unterseite des Rohres pelletiert. </li><li> Sowohl PRP und PPP kann bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen gelagert werden. Idealerweise verwenden frische Blutplättchen für die Verklumpung Assay. Nach 8-10 Tagen die meisten der Plättchen sind wahrscheinlich inaktiv und wahrscheinlich aggregiert. </li></ol> 2. Parasite Kultur <ol><li> Waschen Sie die pelletierten pRBC dreimal mit 5-10 ml RPMI 1640 durch Zentrifugation bei 370 xg für 5 min. Hinweis: In diesem Protokoll alle Kulturen von etwa 1 ml gepackten Zellvolumens (PCV) gestartet und bei 5% Hämatokrit. Kulturen können mit jedem von PCV pRBC gestartet werden und dementsprechend mit nicht infizierten RBC und Medien angepasst, um gewünschte Hämatokrit erreichen. </li><li> Legen Sie die pRBC in einer Kulturflasche und Ergänzung mit Standard Malaria Kulturmedium RPMI 1640 mit 25 mM HEPES, 5% Albumax II oder 10% Serum und 40 ug / ml Gentamycin um eine 5% Hämatokrit erreichen ergänzt. </li><li> Permeat Kulturflaschen mit einer Mischung aus 92,5% Stickstoff, 2,5% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid vor dem Verschließen und Inkubieren. Alternativ kann die luftdichte Kerze Glas Verfahren Trager-Jensen verwendet werden. </li><li> Für pRBC direkt von Patienten erhalten, brüten ihre Kultur Flasche für 24-36 h in einem 37 ° C Inkubator in 5% CO 2, um zu reifen Parasiten bekommen. HINWEIS: Most Labor-und Kultur-Linien angepasst sind sehr einfach in der Kultur unter Standard-Bedingungen gewährleisten. Es gibt einfache Techniken beschrieben, die verwendet werden, um verschiedene Parasitenstadien synchronisieren Wachstumsrate beibehalten werden kann. </li><li> Bereiten Sie einen dünnen Blutausstrich wie unten beschrieben und untersuchen Parasiten Reifung unter einem Lichtmikroskop. </li></ol> 3. Thin Film Blut Slide Vorbereitung <ol><li> Zeigen ca. 10-15 ul Blut an einem Ende einer Milchglas-Folie, die auf einer ebenen Fläche. </li><li> Berühren Sie den Blutstropfen mit dem Rand einer zweiten Folie, bis das Blut gleichmäßig über den Rand der zweiten Objektträger ausgestrichen. </li><li> Halten Sie die zweite Folie in einem 45 °-Winkel, schnell, aber sanft, ohne großen Druck auf der ersten Folie, schieben das Blut über die erste Folie, um einen dünnen Film von Blut, die gleichmäßig verteilt machen. Air trocken. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger in Methanol für 10 sec. Air trocken. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger in 2% Giemsa stain für mindestens 10 min. Spülen Sie ausgiebig, bis das Wasser klar bleibt. Air trocken. </li><li> Untersuchen Folie mit einem 90-100x-Öl-Emulsion Linse auf einem Lichtmikroskop </li></ol> 4. Reinigung und Synchronisation von Asexual Stages Die Reinigung der reifen P. falciparum pRBC ist ein erforderlicher Schritt für die Verklumpung Assay. Tatsächlich sind nur reife Parasiten fähig zur Bindung an Blutplättchen-Rezeptoren, wie er in diesem Lebenszyklusstufe ist, dass die entsprechenden Liganden exprimiert und ragen aus der Oberfläche der infizierten Erythrozyten. Es gibt mehrere Methoden, um zu reinigen und zu synchronisieren asexuellen Stadien von P. falciparum: Late asexuellen Stadien kann durch Percollgradienten 19 angereichert werden; magnetische Zellsortierung 20 oder mit der Gelatine Sedimentation 21 hier beschriebene Protokoll.. Sorbit-Synchronisation wählt für Ring 22 Stufen, nach denen die Ringe für 24-26 h kultiviert werden, um zu reifen Stufen erhalten (ohne nEED Gelatine Börsengang durchführen). 4.1 Plasmagel Flotation Plasmagel Flotation verwendet Gelatine-ähnliche Lösung zu wählen für geringeres Gewicht knorrig Erythrozyten in Lösung bleiben, während die dichten Ring Formen und Rosetten auf den Boden sinken. Diese Technik gibt bis zu 90% Reinheit der reifen Stadium-infizierten Erythrozyten und kann sowohl für Feld und Labor Isolate verwendet werden. Wie jedoch zuvor erwähnt, entfernt Plasmagel Flotation rosettenbildendem pRBC sowie unreifen Stufen, die zu einer verringerten Frequenz Verklumpung in den Proben mit einer hohen Frequenz Rosetting führen kann. Jedoch würde die Abwesenheit des rosettenbildendem pRBC nach Plasmagel Flotation nicht die Verklumpung Assay weil Rosetting eine Wechselwirkung von pRBC und nicht infizierten Erythrozyten während Verklumpung ist prbcS Bindung vermittelt durch Blutplättchen. Der Ligand in diesen beiden Züge beteiligt ist anders, mit allem ergänzen Rezeptor CR-1 infizierten Erythrozyten vermittelnde Rosetting.<ol><li> Vorwärmen Gelofusine Lösung und Serum / Albumax II-freiem Medium bis 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Übertragen Kultur auf eine saubere sterile 15 ml Röhrchen und Pellets Zellen durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 370 × g für 5 min. </li><li> Saugen Sie vorsichtig den Überstand, so nicht, um das Pellet und Zellen in einem gleichen Volumen Gelofusine und Protein-freiem Medium zu stören. </li><li> Übertragen Mischung in ein steriles 15 ml-Tube und lassen Sie sie für 15-20 Minuten in einem 37 ° C Inkubator oder stehen, bis eine klare Abgrenzung zwischen einer oberen und unteren Ebene gesehen werden kann. </li><li> Sorgfältig übertragen Sie die obere Schicht zu einem frischen sterilen 15-ml-Tube und 10 ml frisches RPMI. </li><li> Zentrifuge bei 370 xg für 5 min und sorgfältig Überstand verwerfen. </li><li> Bewerten Parasitämie und des Entwicklungsstadiums von dünnen Blutausstrich und untersuchen unter einem Lichtmikroskop, wie in Kapitel 4 beschrieben. </li></ol> HINWEIS: Ältere pRBC Bereich zwischen 60-90% der infizierten Erythrozyten depending auf dem ursprünglichen Parasitämie der Kultur. Für hohen Anteil an reifen Parasiten, verwenden Kulturen mit einer anfänglichen Parasitämie von ≥ 10%. 5. Klumpende Assay <ol><li> Verwenden Sie einen Neubauer haematocytometer zu zählen und stellen Sie die pRBC Suspension nach Plasmagel Flotation erhaltenen 1 x 10 8 pRBC / ul. </li><li> In einem frischen 1,5 ml-Tube, resuspendieren pRBC bei 5% Hämatokrit, Acridinorange bei 20 ug / ml Endkonzentration und PRP bei 10% des Gesamtvolumens. Statt Acridinorange können Parasiten Kulturen mit 25 ug / ml Ethidiumbromid für 5 min vor Gebrauch gefärbt werden. ZB für eine 200 ul Reaktionsansatz, fügen Sie 10 ul reifen pRBC, 20 ul 300 x 10 3 Blutplättchen / ul für PRP von gesunden Spendern oder 150 x 10 3 Blutplättchen / ul von SM-Patienten und 170 ul Protein-freiem Medium. HINWEIS: Das Verhältnis von Thrombozyten: pRBC in den letzten Reaktionen 20:1. Dies ist wichtig, wie es ermöglicht die Maximeum Verklumpungen Frequenz einer zu bestimmenden Probe. Werden weniger Blutplättchen in Kontrollen zugegeben dann nicht alle Verklumpung PRBCs vielleicht die Chance haben, zu verklumpen. </li><li> In der gleichen Weise bereiten die folgenden Kontrollen; infizierten roten Blutkörperchen und PRP und pRBC mit PPP, die Rolle der Thrombozyten im PRBCs Verklumpung zu ermitteln. </li><li> Übertragen Sie die Suspension auf einen 1,5-2,0 ml konische Röhrchen mit Schraubverschluss. </li><li> Stellen Sie die Durchstechflasche unter leichtem Schütteln durch Walzen bei 10-12 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überprüfen Klumpenbildung durch eine Nass-Rutsche durch Pipettieren 10 ul pRBC vorbereitet ± Thrombozyten Mix auf einen Objektträger aus Glas, Deckel mit einem Glas gleiten und prüfen, unter Fluoreszenz. </li><li> Die Probenahme kann bei 15-20 Minuten-Intervallen für insgesamt 120 min durchgeführt werden. Ein Klumpen wird in einer Summe von drei oder mehr infizierten Erythrozyten betrachtet. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine Blutplättchen-vermittelten Verklumpung Assay zur Untersuchung pRBC in klinischen Isolaten direkt im Feld eingesetzt beschrieben. Thrombozyten-vermittelte Verklumpung, ein charakteristisches Verhalten in P. falciparum klinischen Isolaten, wurde als eigenständige Klebstoff Phänotyp, häufiger in CD36-bindenden Isolate 12,23-24 identifiziert worden. Wir haben diesen Test verwendet werden, um drei Punkte zu identifizieren: 1) eine starke in vitro Verklumpung Phänotyp von P. falciparum aus Malawi Kinder, die mit der Schwere der Erkrankung und Diagnose 2) neuen Rezeptor P-Selektin auf Thrombozyten mediaties Verklumpung zusammen mit CD36, 3) der Grad der Thrombozytopenie bei Patienten mit CM verbunden ist isoliert ist ausreichend, um die weitere Bildung von Klumpen in pRBC begrenzen vitro 12. Die Beteiligung von Blutplättchen in Klumpenbildung ist durch die Untersuchung einer Nass-slide Vorbereitung, wie in Kapitel 6 beschrieben, nachgewiesen. Thrombozyten aus PRP durch Zentrifugation bei hohen Geschwindigkeiten isoliert werdenZur Minimierung Blutgruppe Antigenreaktionen, jedoch haben wir ganze PRP, um eine vorzeitige Aktivierung von Thrombozyten durch übermäßige Handhabung und der Hochgeschwindigkeitszentrifugation minimieren. Thrombozyten-Aktivität kann durch Thrombozytenaggregation Test mit schwachen Thrombozytenagonisten, Adrenalin oder Adenosindiphosphat (ADP) 25, wie in 26 beschrieben gemessen werden. Es gibt mehrere Aspekte des Tests, die zuvor schlecht charakterisiert, eine davon ist die Bedeutung der Auswahl PRP Quellen und die Wirkung von Blut Antigen Gruppen über das Ergebnis des Tests. Wir bereiteten PRP von Personen, die Blutgruppe O + waren und hatte keine Medikamente in den letzten 7-10 Tagen eingenommen, bevor Blut abgenommen, da einige Arzneimittel Thrombozyten Verhalten beeinflussen können. Andere Faktoren, die beeinflussen Verklumpung Erfolg kann pRBC Hämatokrit, Parasitämie Ebenen und Länge der Verklumpung Assay. Mit hoher Hämatokrit und Thrombozyten count wäre es schwierig zu sagen, ob der Cluster ist wirklich ein Klumpen oder ob zu viele Zellen sind nur zusammen sitzen, weil sie dicht gepackt sind 15. Klumpende auch erhöht im Allgemeinen mit längeren Inkubationszeiten. Dies alles sind nützliche Hinweise, die bei der Gestaltung Verklumpung Studien werden sollte. Wir finden, dass Proben aus verschiedenen klinischen Gruppen parallel mit PRP vom gleichen Spender, wenn es möglich ist, dies zu tun kann analysiert werden, sondern in begrenzten Ressource Einstellungen wie Wiese die Transfusion Pool ist in der Regel begrenzt. Es ist daher schwierig, eine einzige O + Spender zum Assays standardisieren haben. Wir haben daher mehrere O + Spender identifiziert Blutgruppe Kompatibilität zu gewährleisten, wo immer möglich. Die Verwendung mehrerer Spender ist auch hilfreich in Fällen von großen Proben Größen, so dass Last der Blutspende nicht nur auf einem einzelnen fallen. Die Messstationen, 15-20 min sind viel mehr machbar, wenn eine einzelne person wird die Durchführung der Tests, so dass für Nass-Präparaten und die Durchführung des Tests Kinetik ohne Probenahme mal überlappen. Die meisten der mikroskopischen Daten visuell und etwas Ziel, daher ist es wichtig, dass Zellzählung von mehr als einer Person überprüft. In diesem Fall kann die Handhabung einer Probe in einer Zeit gestatten vollständige Analyse von drei bis vier Proben pro Tag je nach persönlichen Effizienz. Thrombozyten-vermittelte Verklumpung kann mit klinischen und Laborverfahren Isolate werden. Für Labor-Linien, ist es empfehlenswert, dass CD36 bindenden Parasiten verwendet werden, um Verklumpung Frequenzen zu maximieren. Der Assay kann mit anderen Agglutinierungsassays wie rosettenbildendem oder in Klumpen Inhibitionsassays dass das Studium der Rezeptoren auf den Blutplättchen die Bindung pRBC ein schlecht verstanden und untersucht Aspekt dieser Phänotyp vermitteln kann ermöglichen würde, gekoppelt sein.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870-092</td><td> </td></tr><tr><td>Acridinorange</td><td>Invitrogen</td><td>A3568</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelofusin</td><td>B Braun</td><td>Gelofusine</td><td> </td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td> </td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Invitrogen</td><td>15750045</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Albumax</td><td>GIBCO</td><td>1102-037</td><td> </td></tr><tr><td>Vakutainer mit Natriumcitrat</td><td>BD</td><td>362760</td><td>4 ml Fassungsvermögen</td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop</td><td>Leica</td><td>MD16000 B</td><td> </td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Enthält blaue und grüne Fluoreszenzfilter für Acridinorange und Ethidiumbromid</td></tr></tbody></table>

ein einfaches protokoll für thrombozyten-vermittelte verklumpung<em&gt; plasmodium falciparum</em&gt;-infizierten erythrozyten in einer ressource schlechte einstellung

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum verursacht die Mehrzahl der schweren Malaria-Infektionen. Die pathophysiologischen Mechanismen, die zerebrale Malaria (CM) sind noch nicht vollständig verstanden und mehrere Hypothesen wurden vorgeschlagen, einschließlich der mechanischen Obstruktion Mikrogefäßen von P. setzen falciparum-Parasiten befallenen roten Blutkörperchen (pRBC). In der Tat, während der intra-erythrozytären Stadium seines Lebenszyklus, P. falciparum hat die einzigartige Fähigkeit, um die Oberfläche der infizierten Erythrozyten durch den Export Oberflächenantigene mit unterschiedlichen Hafteigenschaften auf die RBC-Membran ändern. Dies ermöglicht die Sequestrierung von pRBC in verschiedenen Geweben und Organen durch Adhäsion an Endothelzellen der Mikrozirkulation der Post-Venolen 1. Auf diese Weise vermeiden, dass die reifen Formen des Parasiten Milz Clearance des verformten infizierten Erythrozyten 2 und beschränken ihre Umwelt zu einer günstigeren niedrigen Sauerstoffdruck 3. Als Folge dieser SEQUESTRation, ist es nur unreife asexuellen Parasiten und Gametozyten, die im peripheren Blut nachgewiesen werden kann. Cytoadherence und Sequestrierung von reifen pRBC den zahlreichen Host-Rezeptoren auf mikrovaskuläre Betten ausgedrückt tritt in schwerer Krankheit und unkompliziert. Allerdings deuten verschiedene Hinweise, dass nur bestimmte Klebstoff Phänotypen wahrscheinlich mit schweren pathologischen Ergebnisse der Malaria zugeordnet werden sollen. Ein Beispiel eines solchen spezifischen Wirt-Parasit-Interaktion in vitro, wobei die Fähigkeit des ICAM-1 zu unterstützen, die Bindung von pRBC besonders Hafteigenschaften Entwicklung von zerebraler Malaria 4,5 gebracht wurde nachgewiesen. Die Plazenta hat sich auch als Ort der bevorzugte pRBC Akkumulation in Malaria-infizierten schwangeren Frauen anerkannt, mit Chondroitin-Sulfat Ein Ausdruck auf Synzytiotrophoblasten die Linie der Plazenta intervillösen Raum als wichtigste Rezeptor 6. Rosettenbildung von pRBC to infizierten Erythrozyten über den Komplement-Rezeptor 1 (CD35) 7,8 wurde auch mit schwerer Krankheit 9 in Verbindung gebracht. Einer der zuletzt beschriebenen P. falciparum cytoadherence Phänotypen ist die Fähigkeit des pRBC gegen Thrombozyten vermittelte Klumpen in vitro zu bilden. Die Bildung solcher pRBC Klumpen erfordert CD36, ein Glykoprotein auf der Oberfläche von Blutplättchen exprimiert. Anderen menschlichen Rezeptor gC1qR/HABP1/p32, auf verschiedenen Zelltypen, einschließlich Endothelzellen und Blutplättchen exprimiert, wurde ebenfalls gezeigt, dass pRBC Haftung auf Blutplättchen verklumpen 10 zu erleichtern. Ob Verklumpung in vivo auftritt, bleibt unklar, aber es kann für die signifikante Häufung von Blutplättchen in Gehirn Mikrovaskulatur Malawi Kinder, die von CM 11 starb beschrieben ausmachen. Außerdem isolieren die Fähigkeit der klinischen Kulturen zum Verklumpen in vitro direkt mit der Schwere der Erkrankung in Malawian 12 verbunden </sup&gt; Und mosambikanischen Patienten 13, (wenn auch nicht in Mali 14). Mit verschiedenen Aspekten der pRBC Verklumpung Phänotyp schlecht charakterisiert, haben aktuelle Studien zu diesem Thema nicht ein standardisiertes Verfahren gefolgt. Dies ist ein wichtiges Thema, weil der bekannten hohen Variabilität inhärente im Test 15. Hier präsentieren wir eine Methode zur in vitro Blutplättchen-vermittelten Verklumpung von P. falciparum mit der Hoffnung, dass es eine Plattform für eine konsistente Methode für andere Gruppen und Sensibilisierung der Einschränkungen bei der Untersuchung dieser Phänotyp in zukünftigen Studien. Being in Malawi basiert, bieten wir ein Protokoll speziell für eine begrenzte Ressource Einstellung entwickelt, mit dem Vorteil, dass frisch gesammelten klinischen Isolaten für Phänotyp ohne die Notwendigkeit für die Kryokonservierung untersucht werden.

Ein Beispiel für einen Thrombozyten-vermittelten Klumpen unter Verwendung von etwa 70% reifen Stadien von P. falciparum nach Anreicherung durch Flotation Plasmagel ist in Abbildung 2 dargestellt. Ein Klumpen ein Aggregat aus drei oder mehr infizierten Erythrozyten. Färbung mit Acridinorange oder Ethidiumbromid kann durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Acridinorange spektral ähnlich Fluorescein, mit einem Anregungsmaximum bei 502 nm und ein Emissionsmaximum bei 525 nm (grün), Ethidiumbromid weist ein Anregungsmaximum bei 493 nm und ein Emissionsmaximum bei 620 nm (ähnlich Rhodamin-Farbstoffe, rote ). Klumpen sind leicht unter dem Mikroskop entdeckt als unter normalen Lichtbedingungen sie als Zellverbände und unter Fluoreszenz als Flecken erscheinen grün oder rot, wenn sie mit Acridinorange oder Ethidiumbromid Farbstoffe bzw. gefärbt, wie in Abbildung 2 gezeigt (30 min Zeitpunkt mit Acridinorange ). Je größer die Klumpen, je größer der Zellverband wird under normalen Licht und desto größer die Flecken grün oder rot fluoreszieren unter für die jeweiligen Farbstoffe. Da die Farbstoffe Ziel-DNA und somit Fleck Kerne, Blutplättchen und nicht infizierten RBC werden nicht unter Fluoreszenz-Mikroskopie aufgrund ihrer mangelnden Kerne erkannt. Zufällige Bildung von kleinen pRBC Klumpen von 4,7 ± 1,6 PRBCs / Klumpen auftreten, nachdem 30 min. Die Klumpen Größe erhöht sich auf durchschnittlich&gt; 15 pRBC / Klumpen nach Inkubation für 120 min mit einigen Klumpen mit zahlreichen pRBC / Büschel, die visuell nicht gezählt werden konnten. Die Frequenz der Verklumpung Phänotyp wird berechnet, wie die Zahl der infizierten Zellen in Klumpen / 1.000 infizierten Zellen präsentieren, gezählt in Duplikatprüfungen. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Abbildung 1. Der Ablauf für Verklumpung Experiment. Platelet rich und Plasma (A) und einem P. falciparum-infizierten Erythrozyten Kultur (B) hergestellt werden und dann kombiniert zur Verklumpung Assay (C). <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verklumpung der Erythrozyten von P. infiziert falciparum Labor zu isolieren. Büschel von HB3 zum Zeitpunkt 0 gebildet wird, 30 bis 120 min in Plättchen-reichem Plasma (A) und schlechte Klumpenbildung in Blutplättchen armes Plasma (B). Assay Einschränkungen Es gibt Grenzen, die speziell die Thrombozytenfunktion beeinflussen oder Einfluss auf die Prognose und die meisten von ihnen wurden bereits von Arman und Rowe 15 hervorgehoben worden. Hier erwähnen wir einige der möglichen Probleme, die bei differe begegnet werden könntent Stufen des Tests: <ol><li> Anpassung klinischen Isolaten in vitro-Kultur kann eine Herausforderung, da manchmal längere Zeiträume Kultur erforderlich sind, um ausreichend hohe Parasitämie erreichen, um die Bildung von Klumpen zu ermöglichen. Mit hochantigenen Veränderungsraten in P. falciparum, könnte der Klebstoff Phänotyp der Kultur angepasste Parasiten nicht unbedingt die ursprüngliche Infektion Parasiten Bevölkerung nach längerer Zeit in der Kultur. </li><li> Um unspezifische Agglutination durch Blutgruppen-Antigene zu vermeiden, sollte Plättchenspendern für Blutgruppenantigen mit klinischen Isolaten im gleichen Assay verwendet wird, oder die universelle Spenderblut Antigen O-Gruppe verwendet, abgestimmt werden. Jedoch sind die Personen mit der Blutgruppe O-sind in afrikanischen Websites wie Malawi selten und daher Blutplättchen häufig verwendet werden, von der Blutgruppe O + Spendern erhalten und müssen für Blutgruppe abgestimmt werden. </li><li> Zählen Klumpen auf einer nassen Folie Zubereitung ist aufwendig und anspruchsvoll für die Bilderfassung als cEllen sind in ständiger Bewegung. Normalerweise ansammeln pRBC an den Kanten des Deckglases oder sie neigen zum Verkleben Bildung &quot;falsch&quot; Klumpen, die leicht mit echten Klumpen verwechselt werden können. Um Zellbewegung zu reduzieren, damit die Zellen zu sedimentieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur vor der Analyse. </li><li> Die Verklumpung Assay ist zeitkritische und erlaubt daher nur eine Probe pro Person zu einem Zeitpunkt für eine optimale Genauigkeit analysiert werden. Probenahme Zeitpunkten für zwei verschiedene Proben können leicht überlappen, was mismatched Probenahme Zeitpunkten zwischen den Proben bei Verarbeitung mehr als eine Probe zur gleichen Zeit. In einem solchen Fall könnten komplexer quantitativer Software berechnet Klumpen Größen oder alternativ Zell-spezifische Antikörper verwendet werden, um die Zusammensetzung der Klumpen zu analysieren. Während diese Techniken erheblich verbessern könnte die Bedeutung der Daten in Ressourcen armen Einstellungen, wo dieser Test wird wahrscheinlich verwendet werden, sind solche Techniken und Geräte nicht ohne weiteres verfügbar. </li></ol>

Diese Methode untersucht die Blutplättchen-vermittelten Verklumpung Phänotyp<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten (pRBC) in klinischen Isolaten. Dies wird durch Isolieren und Co-Inkubation von Plättchen-reichem Plasma und eine Suspension von pRBC durchgeführt.

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung

P. falciparum verursacht die Mehrheit der schweren Malaria-Infektionen. Die pathophysiologischen Mechanismen, die der zerebralen Malaria (CM) zugrunde liegen, sind nicht vollständig ...

Dieses Verfahren bietet standardisierte Richtlinien zur Durchführung von Thrombozyten-vermittelten Agglutinationsassays klinischer oder laborbasierter Plasmodium falciparum-Isolate. Zunächst wird Blut von einem infizierten Patienten entnommen und die parasitierten Erythrozyten durch Zentrifugation gewonnen, anschließend werden die asexuellen reifen Stadien kultiviert und gereinigt. Danach wird Blut von einem gesunden Spender entnommen, um das thrombozytenreiche Plasma durch Zentrifugation herzustellen und zu standardisieren.Vereinigen Sie sowohl die Thrombozyten als auch die parasitierten Erythrozyten für den Agglutinationstest. Ergebnisse aus der Immunfluoreszenzmikroskopie können P. falciparum-Agglutinate zeigen, die durch Thrombozyten vermittelt werden. Diese Technik ist speziell dafür konzipiert, das Agglutinationsphänotyp von Plasmodium falciparum zu messen.Klinische Isolate unter ressourcenarmen Bedingungen. Es wurde berichtet, dass minimale Variationen in den Verfahren den Einfluss auf das Ergebnis der Agglutinationsreaktion im Feld erhöhen können. Daher war ein klares und leicht verständliches Protokoll, das an ressourcenarme Umgebungen angepasst ist und zur Standardisierung an malariagefährdeten Feldstandorten dient, erforderlich. Sammeln Sie in einem Vacutainer mit Natriumcitrat etwa fünf Milliliter Vollblut von einem malaria-naiven Wirt oder 2,5 Milliliter Blut von Patienten mit zerebraler Malaria (CM) oder schwerer Malaria (SM).Zentrifugieren Sie das Vollblut bei 250 Gs für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Überführen Sie anschließend vorsichtig das trübe Überstandsgemisch in ein sauberes 15-Milliliter-Gefäß. Beachten Sie, dass Thrombozyten leicht durch Temperaturschwankungen und mechanische Erschütterungen aktiviert werden können.Zählen Sie die PRP-Suspension mithilfe einer Neubauer-Zählkammer und eines Hämozytometers und stellen Sie die gewünschte Konzentration mit PBS ein, um ein plättchenarmes Plasma-Pellet zu erhalten, indem der Großteil der Plättchen aus einem Teil des PRP-Fraktionen durch Zentrifugation bei 1500 ×g für 10 Minuten abgetrennt wird. Lagern Sie die PRP- und PPP-Fraktionen bei vier Grad Celsius bis zu acht bis 10 Tage lang. Verwenden Sie idealerweise frische Plättchen für den Agglutinationsassay.Waschen Sie die pelletierten peripheren roten Blutkörperchen dreimal mit fünf bis 10 Milliliter RPMI 1640 in einem Kulturkolben. Ergänzen Sie die pelletierten roten Blutkörperchen mit standardmäßigem Malaria-Kulturmedium und frischen, nicht infizierten roten Blutkörperchen, um einen Hämatokrit von 5 % zu erreichen. Durchströmen Sie die Kulturkolben mit einer Mischung aus 92,5 % Stickstoff, 2,5 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Verschließen Sie anschließend die Kolben und kultivieren Sie die reifen Parasiten aus peripheren Blutkörperchen des Patienten.Inkubieren Sie die Kulturschale 24 bis 36 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie etwa 10 bis 15 Mikroliter Blut auf ein Ende eines beschlagenen Objektträgers, der auf einer flachen Oberfläche liegt. Berühren Sie den Blutstropfen mit der Kante eines zweiten Objektträgers, bis sich das Blut gleichmäßig über die Kante des zweiten Objektträgers verteilt, während Sie diesen unter einem Winkel von 45 Grad halten.Schnell, aber vorsichtig und ohne zu starken Druck auf dem ersten Objektträger auszuüben, das Blut gleichmäßig auf dem ersten Objektträger verteilen. Anschließend den dünnen Blutfilm an der Luft trocknen lassen, den Probeneinsatzbereich 10 Sekunden lang mit Methanol dehydrieren. Danach erneut an der Luft trocknen und die Probe anschließend mit 2% Keem benetzen.Mindestens 10 Minuten andauern lassen. Gründlich spülen, bis das Wasser klar abläuft, und an der Luft trocknen. Die Proben unter einem 100x-Öl-Immersionsoptikobjektiv am Lichtmikroskop untersuchen.Als Nächstes reinigen und synchronisieren Sie die reifen PFS parum, PRBC, wie im Textprotokoll beschrieben. Überführen Sie die gesamte Kultur in ein sauberes, steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 370 ×g für fünf Minuten.Aspirieren Sie nun vorsichtig den Überstand, ohne den Pellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen dann derart, dass eine Hälfte des Gesamtvolumens jello fusing ist. Ein Drittel der zweiten Hälfte ist proteinfreies Medium und zwei Drittel der zweiten Hälfte sind pbcs.Überführen Sie die Suspension in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie sie 15 bis 20 Minuten lang in einem 37 °C warmen Inkubator, bis sich eine deutliche Abgrenzung zwischen oberer und unterer Phase bildet. Überführen Sie vorsichtig die obere Schicht in ein frisches steriles 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 10 Milliliter frisches RPMI hinzu. Zentrifugieren Sie bei 370 bis 430 ×g für fünf Minuten. Entsorgen Sie anschließend vorsichtig den Überstand.Beurteilen Sie nun Parasit und Entwicklungsstadium durch Dünngestreif aus Blut und untersuchen Sie unter dem Lichtmikroskop, wie zuvor beschrieben. Stellen Sie die nach der Plasmagelflotation erhaltene P-RBC-Suspension auf eine Konzentration von einem Mal 10 hoch acht P-RBCs pro Mikroliter in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen ein. Wir suspendieren PBZ mit 5 % Hämatokrit in Aine Orange oder Athérium-Bromid bei einer Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter sowie PRP bei 10 % des Gesamtvolumens.Bereiten Sie in ähnlicher Weise die folgenden Kontrollen vor: uninfizierte rote Blutkörperchen sowie PRP und PRBC mit PPP, um die Rolle der Thrombozyten bei der Agglutination der PBC zu überprüfen. Überführen Sie nun die Suspension in ein 2-mL-Schraubverschlussfläschchen. Stellen Sie das Fläschchen unter leichter Agitation durch Rollen bei 10 bis 12 U/min bei Raumtemperatur und entnehmen Sie in Intervallen von 15 bis 20 Minuten Proben über insgesamt 120 Minuten, um die Bildung von Agglutinaten zu überprüfen.Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Probe auf einen Objektträger und bedecken Sie sie mit einem Deckglas, um sie unter Fluoreszenz zu untersuchen. Ein Zellhaufen gilt als ein Aggregat aus drei oder mehr infizierten Erythrozyten. Dieses Experiment analysierte etwa 70 % reife Stadien von p FALs parem nach Anreicherung durch Plasmagelschwimmen. Die Klumpen sind unter dem Mikroskop leicht zu erkennen, sowohl im normalen Licht als auch im Fluoreszenzlicht. Im normalen Licht erscheinen sie als Zellaggregate, im Fluoreszenzlicht als grüne oder rote Flecken.Wenn sie jeweils mit Acro und Orange oder Atheriumbromid angefärbt werden. Die Klumpengröße nimmt signifikant zu, wobei der Durchschnitt nach einer Inkubation von 120 Minuten über 15 PBZ pro Klumpen liegt, wobei einige Klumpen zahlreiche PBZ pro Klumpen enthalten, die visuell nicht gezählt werden konnten. Die Häufigkeit des Verklumpungsphänotyps wird als Anzahl infizierter Zellen in Klumpen pro 1000 infizierte Zellen berechnet, die in duplizierten Assays gezählt wurden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein klares Verständnis dafür haben, wie man einen Plasmodium falciparum-vermittelten Thrombozytenaggregationsassay durchführt. Achten Sie darauf, die Thrombozyten nicht durch ruckartige Bewegungen und Temperaturschwankungen zu aktivieren. Dieser Assay kann auch zur Messung der thrombozytenvermittelten Aggregation bei schwerer Malaria angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Lernen Sie ein standardisiertes Protokoll zur Untersuchung thrombozytenvermittelter Verklumpung von Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten in klinischen Isolaten. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in ressourcenarmen Umgebungen.

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung Plasmodium falciparum-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung (Video) | JoVE Journal

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung

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