Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung Plasmodium falciparum-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung

Dieses Verfahren bietet einige standardisierte Richtlinien für die Durchführung von Thrombozyten-vermittelten Verklumpungsassays von klinischen oder Labor-Plasmodium-Falschparem-Isolaten. Zuerst wird Blut von einem infizierten Patienten entnommen und parasitierte Erythrozyten durch Zentrifugation entnommen, dann werden die asexuellen Reifestadien kultiviert und gereinigt. Als nächstes entnehmen Sie Blut von einem gesunden Spender, um das plättchenreiche Plasma durch Zentrifugation vorzubereiten und zu standardisieren.

Kombinieren Sie sowohl die Blutplättchen als auch die parasitierten Erythrozyten für den Klumpen-Assay. Angenommen, die Ergebnisse der Immunfluoreszenzmikroskopie können P Fal sperum-Klumpen zeigen, die durch Blutplättchen vermittelt werden. Diese Technik wurde speziell entwickelt, um den verklumpenden Phänotyp von Plasmodium sra.Klinischen

Isolaten in einer ressourcenarmen Umgebung zu messen. Berichten zufolge haben minimale Variationen in den Verfahren den Einfluss auf das Ergebnis der Verklumpung von Säure im Feld erhöht. Daher war ein klares und leicht zu befolgendes Protokoll erforderlich, das an ressourcenarme Umgebungen angepasst war, um die Malaria-Endemiegebiete zu standardisieren. In einem Natriumcitrat sammelte Vacutainer etwa fünf Milliliter Vollblut von einem Malaria-naiven Wirt oder 2,5 Milliliter Blut von CM- oder SM-Malariapatienten.

Zentrifugieren Sie das Vollblut bei 250 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Füllen Sie dann den trüben Überstand vorsichtig in ein sauberes 15-Milliliter-Röhrchen um. Denken Sie daran, dass Blutplättchen leicht durch Temperaturschwankungen, Schwankungen und physikalische Stöße aktiviert werden können.

Zählen Sie die PRP-Suspension mit einem Hämozytometer auf und stellen Sie sie mit PBS auf die gewünschte Konzentration ein, um ein plättchenarmes Plasmapellet zu erhalten, die Mehrheit der Blutplättchen aus einem Teil der PRP-Fraktion durch Zentrifugation bei 1500 GS für 10 Minuten. Lagern Sie PRP- und PPP-Fraktionen bis zu acht bis 10 Tage bei vier Grad Celsius. Idealerweise mit frischen Blutplättchen für den Klumpen-Assay.

Waschen Sie die pelletierten peripheren roten Blutkörperchen dreimal mit fünf bis 10 Millilitern RPMI 1640 in einem Kulturkolben. Ergänzen Sie PRBC mit Standard-Malariakultur, Medium und frischen, nicht infizierten roten Blutkörperchen, um einen Hämatokrit von 5 % zu erreichen. Die Kulturkolben mit einer Mischung aus 92,5 % Stickstoff, 2,5 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchdringen. Dann versiegeln und auf reife Parasiten von Patienten-PBC kultivieren.

Inkubieren Sie den Kulturkolben 24 bis 36 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie etwa 10 bis 15 Mikroliter Blut auf ein Ende eines Milchglasobjektträgers, der auf einer ebenen Fläche ruht. Berühren Sie den Blutstropfen mit dem Rand eines zweiten Objektträgers, bis das Blut gleichmäßig über den Rand des zweiten Objektträgers verteilt ist, während Sie den zweiten Objektträger in einem Winkel von 45 Grad halten.

Schnell, aber sanft, ohne zu viel Druck auf den ersten Objektträger auszuüben, verteilen Sie das Blut gleichmäßig auf dem ersten Objektträger. Trocknen Sie dann den dünnen Blutfilm an der Luft und dehydrieren Sie den Probenbereich 10 Sekunden lang mit Methanol. Dann an der Luft trocknen und die Probe mit 2%Keem eintauchen.

Halten Sie mindestens 10 Minuten lang durch. Ausgiebig ausspülen, bis das Wasser klar und an der Luft trocken ist. Untersuchen Sie die Proben unter einer 100-fachen Ölemulsionslinse an einem Lichtmikroskop.

Als nächstes reinigen und synchronisieren Sie das ausgereifte PFS-Parum PRBC, wie im Textprotokoll beschrieben. Alle überführen die Kultur in ein sauberes, steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 370 GS für fünf Minuten.

Saugen Sie nun den Überstand vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören. Dann resuspendieren Sie die Zellen so, dass die Hälfte des Gesamtvolumens zu Wackelpudding wird. Ein Drittel der zweiten Hälfte besteht aus proteinfreiem Medium und zwei Drittel der zweiten Hälfte aus PBCS.

Die Suspension wird in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und 15 bis 20 Minuten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator inkubiert, bis sich eine klare Abgrenzung zwischen oberer und unterer Ebene bildet. Übertragen Sie die obere Schicht vorsichtig in ein frisches steriles 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 10 Milliliter frische RPMI-Zentrifuge bei 370 bis 430 GS für fünf Minuten hinzu. Entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand.

Beurteilen Sie nun den Parsit und das Entwicklungsstadium durch einen dünnen Blutausstrich und untersuchen Sie ihn unter einem Lichtmikroskop, wie zuvor beschrieben. Die nach der Plasma-Gel-Flotation erhaltene P-Erythrozyten-Suspension wird auf eins mal 10 bis acht P-Erythrozyten pro Mikroliter in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen eingestellt. Wir suspendieren PBCS bei 5 % Hämatokrit, Ainorange oder Atheriumbromid bei 20 Mikrogramm pro Milliliter, Endkonzentration und PRP bei 10 % des Gesamtvolumens.

Bereiten Sie in ähnlicher Weise die folgenden Kontrollen vor: nicht infizierte rote Blutkörperchen sowie PRP und PRBC mit PPP, um die Rolle der Blutplättchen bei der Verklumpung des PBC zu bestimmen. Übertragen Sie nun die Suspension in ein Fläschchen mit zwei Millilitern Schraubverschluss. Stellen Sie das Fläschchen unter leichtes Rühren, indem Sie bei 10 bis 12 UVP bei Raumtemperatur in Abständen von 15 bis 20 Minuten insgesamt 120 Minuten lang rollen, um auf Verklumpenbildung zu prüfen.

Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Probe auf einen Glasobjektträger und bedecken Sie sie mit einem Glasträger, um sie unter Fluoreszenz zu untersuchen. Ein Klumpen wird als Aggregat von drei oder mehr infizierten Erythrozyten betrachtet. In diesem Experiment wurden etwa 70 % der reifen Stadien von p FALs parem nach der Anreicherung durch Plasma-Gel-Flotation untersucht, die unter dem Mikroskop wie unter normalem Licht leicht zu erkennen sind. Sie erscheinen als Zellaggregate und unter Fluoreszenz als grüne oder rote Flecken.

Bei Färbung mit Acro und Orange bzw. Aheriumbromid stirbt es ab. Die Klumpengröße steigt nach einer Inkubation von 120 Minuten signifikant auf durchschnittlich mehr als 15 pbcs pro Klumpen an, wobei einige Klumpen zahlreiche pbcs pro Klumpen enthielten, die nicht visuell gezählt werden konnten. Die Häufigkeit des Verklumpen-Phänotyps wird berechnet als die Anzahl der infizierten Zellen, die in Klumpen pro 1000 infizierten Zellen vorhanden sind, die in doppelten Assays gezählt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein klares Verständnis davon haben, wie Sie einen Plasmodium falciparum, einen Thrombozyten-vermittelten Klumpen-Assay, durchführen. Achten Sie darauf, die Blutplättchen nicht durch ruckartige Bewegungen und Temperaturschwankungen zu aktivieren. Dieser Assay kann auch zur Messung des Thrombozyten-vermittelten Klumpen-Assays bei schwerer Malaria angewendet werden.