Name: Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren C. elegans Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Lernen Sie Zeitraffer-Mikroskopie zur Visualisierung subzellulärer Dynamiken in C. elegans Embryonen unter Anoxie-Bedingungen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbildgebung zellulärer Stressantworten.

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Wir möchten unsere Wertschätzung für die Eingabe und Kommentare von Mitgliedern des Padilla Lab vermitteln. Nematode Stämme in dieser Arbeit wurden von der Caenorhabditis Genetics Center, das von der NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert ist. Wir anerkennen und danken Dr. Lon Turnbull für technische Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (NSF-IOS, CAREER) an PAP unterstützt

Ein. Probenvorbereitung <ol><li> Produzieren oder zu erhalten entsprechenden transgenen C. elegans-Stamm von Interesse unter Verwendung transgener Methoden oder von Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) oder Kollegen. In diesem Fall sind wir mit dem Stamm TH32 (pie-1 :: tbg-1 :: GFP; pie-1 :: GFP :: H2B) 5 bis Chromosomen und Zentrosomen als Marker für die Zellteilung zu visualisieren. </li><li> Generieren Sie eine synchronisierte Bevölkerung mit einem der drei Methoden: 1) zerfallen gravid Erwachsenen in Hypochloritlösung und verwenden restlichen Embryonen 6, 2) holen gravid Erwachsenen auf eine gesetzte Platte und laß ihnen lag Embryonen für 1-2 Stunden, oder 3) Pick L4 Larven von einer gemischten Bevölkerung und Umzug in ein neues seeded Platte. </li><li> Wachsen Nematoden bei 20 ° C bis graviden jungen Erwachsenenalter, die in etwa 96 Stunden aus dem Schlüpfen dauert, 72 h von L1-Larven oder 24 h nach der Häutung L4. Embryonen (2-20 Zellen) in utero enthalten große Blastomeren und Kerne, die optimal für imag sindten sub-zellulären und sub-atomaren Veränderungen sind. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, eine Bevölkerung von jungen Erwachsenen, die eine reichliche Anzahl von frühen Embryonen enthalten generieren. </li></ol> 2. Slide Vorbereitung und Anoxia Chamber Set Up <ol><li> Machen Sie eine feuchte Kammer, vorbereitete Folien, indem Sie ein feuchtes Papiertuch in einem großen Petrischale oder bin mit einem Deckel von ausreichender Größe bedeckt halten. </li><li> Planen geschmolzene 2% Agarose in entionisiertem H 2 O durch Erhitzen Mischung in Glaswaren über Mikrowelle oder Wasserbad. </li><li> Platz 1-3 Tropfen warmen Agarose auf einer sauberen Glasobjektträger. Sofort einen zweiten Schieber senkrecht auf der Agarose Drop (s) invertiert, leicht drücken, so dass die resultierende Pad dünn sein und frei von Luftblasen. </li><li> Nehmen Sie sich Zeit zu kühlen und langsam auseinander nehmen die beiden Objektträger Verlassen der Agarose Pad intakt auf einer der Folien. Es ist wichtig sicherzustellen, die Agarose-Pad ist dünn genug, um nicht Störe mit der Fähigkeit, das Mikroskop später konzentrieren. Fähigkeit zur Probe visualisieren ist auch abhängig von der spezifischen optischen Abstand des Objektivs im Gebrauch die zwischen Mikroskopen variieren kann. </li><li> Mit einem sauberen Rasierklinge eine Agarose-Pad in ein kleines Quadrat formen. Bewahren Sie in der vorbereiteten feuchten Kammer bis zum Gebrauch. </li><li> Sorgfältig unter Verwendung der gleichen sauberen Rasierklinge, nehmen die Kante der Agarose Pad und sie von der Folie auf eine runde 25 mm Mikro Abdeckglases, die Vermeidung der Ansammlung von Luftblasen unter dem Pad. Der runde Deckgläser gewählt zu bedienen passt entsprechend in der microincubator. </li><li> Einen Tropfen Anästhetikum (0,5% Tricain, 0,05% Tetramisol in M9-Puffer) auf die Agarose Pad zur Verwendung als Anästhetikum. Wählen 5-10 Würmer und Stelle in den Tropfen Anästhetikum. Lassen Sie 1-3 min für Würmer, um die Bewegung zu beenden. </li><li> Die Begründung für die Beobachtung Embryonen im Uterus erwachsenen, anstatt zerschnitten Embryonen, ist das Potenzial der Embryo desicca minimierention und Bewegung durch die Strömung von Stickstoffgas über den Embryo. </li><li> Sofort einen Tropfen Halocarbonöl auf der Würmer, die Würmer vor Austrocknung zu verhindern, wie Gas durch die Kammer durchströmt wird. Da die Halocarbonöl ist zähflüssig kann man wählen Sie eine Pipettenspitze oder der Spitze eines Wurms nutzen, um Öl-und Drop auf die Würmer zu sammeln. </li><li> Sobald der kreisförmigen Deckglas mit den Würmern wartet schlossen die beiden Hälften des Leiden Perfusion microincubator werden getrennt und die Deckgläser wird dann vorsichtig auf die aufrechte Bodenrings angeordnet. Die beiden Seiten der Kammer werden dann geschlossen fest zusammen. </li><li> Die Kammer wird dann mit dem Stickstoff Gastank über flexible Kunststoffschlauch verbunden und in die entsprechende Stelle auf dem Mikroskoptisch (Abbildung 1C). Zu diesem Zeitpunkt wird der Schlauch und microincubator sollte sorgfältig auf eventuelle Leckagen werden durch eine sichere Befestigung der Schläuche und der Anschluss-Stecker entlang der Seite der Kammer kontrolliert. Eines kann ALso leicht eine geringe Menge Seife Wasser über die Rohrleitung für Luftblasen, die sich bilden, wenn ein Leck vorhanden ist aussehen ausbreiten. </li></ol> 3. Mikroskopie in Anoxia <ol><li> Suchen Tieren bei niedriger Vergrößerung, dann in den entsprechenden höherer Vergrößerung (64x für diese Anwendung) zu Bild Gewebe oder Zellen von Interesse wie embryonale Blastomeren oder Oozyten bei Erwachsenen bewegen. Einschalten des Lasers, um 488 nm GFP-Signal anzuzeigen und zu lokalisieren GFP-Fusionsprotein in der Zelle (n) von Interesse. </li><li> Um der Verhaftung zu bestimmten Stadium des Zellzyklus visualisieren (zB späten Prophase) identifizieren Blastomeren in früheren Phasen der Zellteilung (zB verspätete Interphase oder frühen Prophase). Zellulären Marker wie Centriol Position Einleitung Chromosomenkondensation, Chromosom Lage und Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Kernhülle wird zur Ermittlung Zellzyklusstadium (Abbildung 2A). </li><li> Die Kammer wird dann mit Stickstoffgas (99,999% perfundiertN 2; &lt;2 ppm O 2). In diesem Fall haben wir einen Druck von 6 bar zu verwenden, jedoch Druck eventuell angepasst und optimiert werden je nach Größe der einzelnen microincubator und Durchmesser der Schlauch in Gebrauch ist. Weiterhin die Blastomere (en) als der Stickstoff füllt die Kammer, Einstellen der Brennebene nach Bedarf überwachen. </li><li> An diesem Punkt hat Zeitraffer-Aufnahmen begonnen. Abbildungssystem wird so lange wie notwendig durchgeführt, um interessierende Phänomen erfassen, in diesem Fall Prophase Verhaftung und Andocken von Chromosomen auf der inneren Kernmembran. Die Bilder werden einmal alle 10 sec nicht länger als 30 min genommen. Frequenzen der Bilderfassung und Einstellungen wie Gain und Laserleistung sollte nach Bedarf eingestellt werden. </li><li> Die Zeit, in welcher die Embryonen zu der anoxischen Umgebung reagieren kann je nach Zellzyklusstadium auf Anoxie Belichtung. Typischerweise Anoxie-induzierten Prophase Festnahme erfolgt innerhalb von 20-30 min zu beginnen Stickstoffgasstrom. Wir haben Anoxie-induzierten Zellzyklusarrest Berufs beobachtetrring in &lt;20 min. Bilder können in diesem Zeitraum erhalten werden, oder bestimmte Bilder können später von einem Zeitraffer-Serie werden. Eine weitere Option ist es, Video-Mikroskopie verwenden, um sub-zellulären Strukturen in Embryonen zu visualisieren. </li><li> Um eine Wiederherstellung aus der Anoxie-induzierten arretierten Zustand zu dokumentieren, wird das Gas abgeschaltet und die Kammer erlaubt ist, zu Normoxie durch Diffusion wieder während der Aufzeichnung eines Zeitraffer-Serie. Wiederaufnahme der Zellzyklusprogression und Undocking von Chromosomen tritt normalerweise innerhalb von 5-20 min Drehen des Stickstoffgases aus. </li><li> Beachten Sie, dass in getrennten Experimenten ein Indikator Anoxie, Resazurin, in der Durchflusskammer Mikrokammer platziert wurde, es wurde ermittelt, dass die Kammer anoxischen auf durchschnittlich ca. 19 min wird nach Stickstoffgasstrom wurde gestartet. </li><li> Bilder und Videos werden unter Verwendung Imaris, Image J oder Photoshop importiert und in QuickTime für die Anzeige. </li></ol>

<ol><li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li>
<li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation%2C+diapause+and+quiescence%3A+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
<li>Hu, P. J. Dauer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+PJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-19 (2007).</li>
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<li>Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+cytoplasmic+dynein+heavy+chain+in+Caenorhabditis+elegans+with+fast-acting+temperature-sensitive+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22The+Nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li>
<li>Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief%2C+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li>
<li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPadilla%2C+PA+%22Anoxia%22">Anoxia</a>. Padilla, P. A. , InTech. (2012).</li>
<li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPP-16%2FNup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li>
<li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation+in+C.+elegans+requires+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li>
<li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sauerstoffmangel und Suspended Animation Obgleich das Engagement in schweren Sauerstoffmangel kann tödlich sein für einige Organismen, sind einige Organismen, um die Exposition gegenüber Anoxie überleben. Im Falle von C. elegans, hängt Überleben von Anoxie Belichtung auf Entwicklungsstadium und ist ansprechend auf Anoxie Eintritt in einen Zustand der reversiblen suspendiert Animation in dem eine Anzahl von beobachtbaren biologische Prozesse werden verhaftet. Zellteilung, Entwicklung, B...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien / Equipment </td><td></td><td></td><td> Zusammensetzung </td></tr><tr><td> Hypochloritlösung </td><td></td><td></td><td> 0,7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, um 50 ml zu bringen mit ddH 2 0 </td></tr><tr><td> M9-Puffer </td><td></td><td></td><td> 3 g KH 2 PO 4, 11 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 pro 1 L ddH 2 O </td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;x1&quot; x1.0 mm </td></tr><tr><td> Round micro Deckglas </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72223-01 </td><td> 25 mm Durchmesser </td></tr><tr><td> Halocarbonöl 700 </td><td> Sigma </td><td> H8898-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Narkose </td><td></td><td></td><td> 0,5% tricaine, 0,05% Tetramisol </td></tr><tr><td> Leiden Closed Perfusion Microincubator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> UHP Stickstoff </td><td> Calgaz (Air Liquide) </td><td></td><td> &gt; 99,9990% N 2 &lt;2 ppm O 2 </td></tr><tr><td> Kunststoffschlauch </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0,062 &quot;ID x 0,125&quot; OD </td></tr><tr><td> Spinning-Disk-konfokale Mikroskop </td><td> McBain Systeme </td><td></td><td> Zeiss invertiert optischen Mikroskop, Epifluoreszenz Beleuchtungssystem, CSU-10 Yokogawa konfokalen Scanner, Hamamatsu-Elektronen-Vervielfacher CCD-Kamera. </td></tr></tbody></table>

verwendung von zeitraffer-mikroskopie zur anoxie-induzierten suspended animation in visualisieren<em&gt; c. elegans</em&gt; embryonen

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans wurde ausgiebig in der Studie der Stressresistenz, die durch die Transparenz des adulten Stadien und Embryo als auch durch die Verfügbarkeit von genetischen Mutanten und transgenen Linien Expression einer Vielzahl von Fusionsproteinen 1-4 erleichtert wird. Darüber hinaus können dynamische Prozesse wie Zellteilung Darstellung unter Verwendung von fluoreszierend markierten Reporter-Proteine ​​werden. Das Studium der Mitose kann durch den Einsatz von Zeitrafferexperimente in verschiedenen Systemen einschließlich intakten Organismen erleichtert; somit der frühen C. elegans Embryo wird auch für diese Studie geeignet. Präsentiert hier ist eine Technik, mit der in vivo Bildgebung von sub-zellulären Strukturen in Reaktion auf Sauerstoffmangel (99,999% N 2; &lt;2 ppm O 2) Stress ist möglich, mit einem einfachen Gasfluss durch Setup auf einem High-Power-Mikroskop. Ein microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop verwendetum eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden können. Verwendung GFP-markierten Gamma-Tubulin und Histon, kann die Dynamik und Verhaftung der Zellteilung kontrolliert werden, bevor, während und nach der Einwirkung von einer sauerstoffarmen Umgebung. Die Ergebnisse dieser Technik sind hochauflösende, detaillierte Videos und Bilder von zellulären Strukturen innerhalb Blastomeren von Embryonen ausgesetzt Sauerstoffmangel.

C. elegans Embryonen bei starken Sauerstoffmangel (Anoxie) können durch die Verhaftung biologische Prozesse einschließlich Entwicklung und Zellteilung 7 überleben. Die Anoxie induzierte Verhaftung der Zellteilung können überwacht werden, bei einem sub-zellulären Ebene durch Verwendung einer microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskops um eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden kann erstellen <...

Hier wird beschrieben ein<em&gt; In vivo</em&gt; Technik zur Bilder subzellulären Strukturen in Tieren, die mit Anoxie einen Gasstrom durch microincubation Kammer in Verbindung mit einer drehenden Scheibe Konfokalmikroskop. Dieses Verfahren ist einfach und flexibel genug, um eine Vielzahl von experimentellen Parameter und Modellsystemen anzupassen.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

*Caenorhabditis elegans* wurde extensiv bei der Untersuchung der Stressresistenz eingesetzt, was durch die Transparenz der adulten Stadien und der Embryonen erleichtert wird ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine In-vivo-Technik zur Abbildung subzellulärer Dynamiken in C. elegans-Embryonen, die unter Verwendung einer Gasdurchflussanordnung an einem leistungsstarken Mikroskop einer Anoxie ausgesetzt sind, zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe junger transgener Adulttiere vorbereitet wird, um eine geeignete Population junger Embryonen für die Bildgebung zu erhalten. Anschließend bereiten Sie dünne Agaros-Pad-Objektträger zur Verwendung in der mikroskopischen Inkubationskammer vor.Dann werden die Seeschwäne ordnungsgemäß anästhesiert und mit Halocarbon-Öl bedeckt, um Austrocknung während der Exposition gegenüber dem Gasstrom zu vermeiden. Schließlich wird das runde Deckglas mit den anästhesierten Tieren in die Mikro-Inkubationskammer eingebracht. Die Kammer wird anschließend auf den Mikroskopständer gestellt und mit Stickstoffgas gefüllt, um während der Bildgebung eine anoxische Umgebung zu erzeugen, wobei letztendlich ein Gasstrom durch die Mikro-Inkubationskammer geleitet wird.In Verbindung mit In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es hochauflösende, detaillierte Videos und Bilder der Zellzyklusarrestierung als Reaktion auf Anoxie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie indirekter Immunfluoreszenz besteht darin, dass subzelluläre Veränderungen in vivo dokumentiert werden können, während die Tiere bestimmten Bedingungen ausgesetzt sind. Obwohl diese Methode Einblicke in die durch Anoxie induzierte Suspended Animation in elegans-Embryonen liefern kann.Es kann auch auf andere Systeme wie Hefe, Zellkulturen oder andere kleine wirbellose oder wirbeltragende Embryonen angewendet werden. Zusätzliche Bedingungen wie Hyperoxie, Temperatur, Stress oder die Behandlung mit kleinen Molekülen können ebenfalls angewendet werden. Anastacia Garcia und Mary Latt, zwei Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstrieren dieses Verfahren. Beginnen Sie mit einem geeigneten transgenen C. elegans-Stamm der gewünschten Art; in dieser Studie wird der transgene Stamm TH32 verwendet, um Chromosomen und Zentrosomen als Marker für die Zellteilung sichtbar zu machen.Erzeugen Sie eine synchronisierte Population, indem Sie erwachsene Exemplare durch Behandlung mit einer Hypochloritlösung aufbrechen, und verwenden Sie die verbleibenden Embryonen, indem Sie erwachsene Tiere auf eine beimpfte Platte überführen und Eier für eine bis zwei Stunden ablegen lassen, oder indem Sie L4-Larven aus einer gemischten Population auf eine neue beimpfte Platte übertragen. Kultivieren Sie die Nematoden bei 20 °C bis zum jungen Erwachsenenstadium (GR), was ungefähr 96 Stunden nach dem Schlüpfen, 72 Stunden nach dem L1-Stadium oder 24 Stunden nach der Häutung zum L4-Stadium benötigt. Diese Methodik ermöglicht die Erzeugung einer Population junger erwachsener Tiere, die eine hohe Anzahl junger Embryonen enthalten, in denen sich große Blastomeren und Kerne befinden, die sich optimal für die Abbildung subzellulärer und subnukleärer Veränderungen eignen.Um eine feuchte Kammer für die vorbereiteten Objektträger einzurichten, legen Sie ein feuchtes Papiertuch in eine große Petrischale oder einen Behälter, der mit einem Deckel ausreichender Größe abgedeckt ist. Bereiten Sie geschmolzenes 2% Aros in entionisiertem Wasser vor, indem Sie die Mischung in Glaswaren mithilfe einer Mikrowelle oder eines Wasserbades erhitzen. Geben Sie anschließend ein bis drei Tropfen warmes Aros auf einen sauberen Glas-Objektträger, setzen Sie sofort einen zweiten Objektträger umgekehrt senkrecht auf die Aros-Tropfen und drücken Sie leicht darauf, sodass das resultierende Polster dünn und frei von Luftblasen wird.Nachdem sich das Aros langsam abgekühlt hat, nehmen Sie die beiden Objektträger auseinander, wobei das Aros-Pad auf einem der Objektträger intakt bleibt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Aros-Pad dünn genug ist, um die Fokussierung des Mikroskops nicht zu beeinträchtigen. Verwenden Sie anschließend eine saubere Rasierklinge, um das Aros-Pad zu einem kleinen quadratischen Vorrat zuzuschneiden.Die Objektträger bis zur Verwendung in der vorbereiteten feuchten Kammer aufbewahren. Mit demselben sauberen Rasierklingenblatt vorsichtig die Kante des Aros-Pads ergreifen und es vom Objektträger auf ein rundes 25-Millimeter-Mikrodeckglas übertragen. Dabei sollte vermieden werden, dass Luftblasen unter dem runden Deckglas entstehen; es muss passend in den Mikroinkubator passen.Geben Sie einen Tropfen Anästhetikum auf das Aros-Pad. Wählen Sie fünf bis zehn Würmer aus und legen Sie sie in den Tropfen mit Anästhetikum. Warten Sie ein bis drei Minuten, bis die Würmer ihre Bewegung eingestellt haben.Mit einer Pipettenspitze einen Tropfen Hohlkohlenstofföl auf die Würmer geben, um eine Austrocknung der Würmer zu verhindern, während Gas durch die Kammer strömt. Anschließend ein Ende des flexiblen Kunststoffschlauchs mit der Kammer verbinden. Die beiden Hälften des geschlossenen Perfusions-Mikroinkubators trennen und die Deckglasplatte vorsichtig senkrecht auf den unteren Ring setzen.Schließen Sie die beiden Seiten der Kammer fest zusammen. Verbinden Sie anschließend die Kammer über den flexiblen Kunststoffschlauch mit dem Stickstoffgasbehälter und platzieren Sie sie auf dem Mikroskoptisch. Überprüfen Sie auf eventuelle Lecks, indem Sie sicherstellen, dass der Schlauch und die Verschlussstopfen an der Seite der Kammer fest angebracht sind, um Embryonen abzubilden.Zuerst die Tiere bei niedrigerer Vergr&ouml;&szlig;erung lokalisieren. Danach zur geeigneten h&ouml;heren Vergr&ouml;&szlig;erung wechseln. Um embryonale Blasphemer in erwachsenen Organismen abzubilden, den 488 Nanometer Laser verwenden, um das GFP-Fusionsprotein in den Zellen von Interesse zu lokalisieren.Um einen bestimmten Stadium des Zellzyklusarrests, beispielsweise die späte Prophase, zu visualisieren, identifizieren Sie einen Blasphemier in einem vorherigen Stadium der Zellteilung, wie der späten Interphase oder der frühen Prophase. Spülen Sie die Kammer mit Stickstoffgas und überwachen Sie weiterhin die Blasphemier, während die Kammer mit Stickstoff gefüllt wird, wobei Sie die Fokusebene bei Bedarf anpassen. Führen Sie eine Zeitrafferaufnahme durch, um das gewünschte Phänomen von Interesse in diesem Fall zu erfassen.Prophase-Arrest und Andocken der Chromosomen an die innere nukleare Membran. Nehmen Sie alle 10 Sekunden ein Bild auf, bis zu 30 Minuten lang. Typischerweise tritt ein durch Anoxie induzierter Prophase-Arrest innerhalb von 20 bis 30 Minuten nach Beginn des Stickstoffgasflusses auf.Um die Erholung aus dem durch Anoxie induzierten Arrestzustand zu dokumentieren, schalten Sie das Gas aus und lassen Sie die Kammer unter Aufzeichnung einer Zeitrafferserie in den Normoxiezustand zurückkehren. Die Wiederaufnahme des Zellzyklus und die Rückbildung der Chromosomen erfolgt typischerweise innerhalb von fünf bis zwanzig Minuten. Verwenden Sie ImageJ oder Photoshop, um Bilder und Videos zu bearbeiten, und importieren Sie diese in QuickTime zur Darstellung. Innerhalb des Embryos, der Anoxie ausgesetzt war, kondensieren die Chromosomen der Prophase. Blasphemers und lagern sich an der inneren nuklearen Peripherie an. Ein Phänomen, das als Chromosomen-Docking bezeichnet wird. Nach der Reoxygenierung setzt die Zellzyklusprogression erneut ein und die Chromosomen der Prophase.Blasphemie wird sich von der nuklearen Peripherie zur äquatorialen Platte bewegen, was einen Fortschritt in die Metaphase anzeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei bis vier Stunden mit geeignet gestadierten Tieren durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, ausschließlich gesunde, junge erwachsene Tiere zu verwenden, ausreichend Zeit einzuplanen, um das Experiment abzuschließen, und geduldig zu sein, wenn man lernt, geeignet gestadierte Blasphemierer auszuwählen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man anoxieinduzierte subzelluläre Ereignisse in vivo unter Verwendung von GaN-Embryonen und einer Gasdurchflusskammer an einem leistungsstarken Mikroskop aufzeichnen kann.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Hier wird gezeigt, wie Entwicklungsprozesse in C. elegans verfolgt und quantifiziert werden können. Die vorgestellten Methoden basieren auf Open-Source-Tools, die einfach implementiert werden können. Es wird gezeigt, wie man 3D-Zellformmodelle rekonstruiert, wie man subzelluläre Strukturen manuell verfolgt und wie man die kortikale kontraktile Strömung analysiert.

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Hier beschreiben wir Protokolle, die speziell zur Überwachung morphogener Defekte entwickelt wurden, die während der frühen und späten Phasen der embryonalen Elongation des Fadenwurms Caenorhabditis elegans auftreten. Letztendlich sind diese Protokolle darauf ausgelegt, Gene zu identifizieren, die diese Phasen regulieren, und ihre unterschiedlichen Anforderungen entlang der antero-posterioren Achse des Embryos zu charakterisieren.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Befestigung von Caenorhabditis elegans-Embryonen , zur Aufzeichnung der Entwicklung unter einem 4D-Mikroskop und zur Verfolgung der Zelllinie vor.

4D-Mikroskopie: Entschlüsselung der Caenorhabditis elegans Embryonalentwicklung mittels Nomarski-Mikroskopie

Das Protokoll beschreibt ein einfaches mikrofluidisches Chipdesign und eine Mikrofabrikationsmethodik, die verwendet wird, um C. elegans in Gegenwart einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr für bis zu 36 h zu züchten. Das Wachstums- und Bildgebungsgerät ermöglicht auch eine intermittierende langfristige hochauflösende Bildgebung von zellulären und subzellulären Prozessen während der Entwicklung für mehrere Tage.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir Protokolle und Werkzeuge zur Visualisierung von Kalzium während der Befruchtung und der frühen Embryogenese unter Verwendung eines genetisch kodierten Kalziumreporters vor, der in der Keimbahn des Modellfadenwurms C . elegans exprimiert wird.

In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans

Lernen Sie Zeitraffer-Mikroskopie zur Visualisierung subzellulärer Dynamiken in C. elegans Embryonen unter Anoxie-Bedingungen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbildgebung zellulärer Stressantworten.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren

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