Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren C. elegans Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine In-vivo-Technik zur Abbildung subzellulärer Dynamiken in C. elegans-Embryonen unter Anoxie-Bedingungen mithilfe einer Gasdurchflussanordnung an einem leistungsstarken Mikroskop zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe junger transgener Adulttiere vorbereitet wird, um eine geeignete Population junger Embryonen für die Bildgebung zu erhalten. Anschließend werden dünne Agaros-Pad-Objektträger für die Verwendung in der mikroskopischen Inkubationskammer vorbereitet.

Dann werden die See-Aelchen ordnungsgemäß anästhesiert und mit Halocarbon-Öl bedeckt, um Austrocknung bei Exposition gegenüber dem Gasstrom zu vermeiden. Schließlich wird das runde Deckglas mit den anästhesierten Tieren in die mikroskopische Inkubationskammer eingebracht. Die Kammer wird anschließend auf den Mikroskopständer platziert und mit Stickstoffgas gefüllt, um während der Bildgebung eine anoxische Umgebung zu erzeugen, letztlich unter Verwendung eines Gasstroms durch die mikroskopische Inkubationskammer.

In Verbindung mit In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es hochauflösende, detaillierte Videos und Bilder der Zellzyklusarrestierung als Reaktion auf Anoxie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie indirekter Immunfluoreszenz besteht darin, dass subzelluläre Veränderungen in vivo dokumentiert werden können, während die Tiere bestimmten Bedingungen ausgesetzt sind. Obwohl diese Methode Einblicke in die durch Anoxie induzierte Schwebeanimation in elegans-Embryonen liefern kann.

Es kann auch auf andere Systeme wie Hefe, Zellkulturen oder andere kleine wirbellose oder wirbellose Embryonen angewendet werden. Zusätzliche Bedingungen wie Hyperoxie, Temperatur, Stress oder die Behandlung mit kleinen Molekülen können ebenfalls angewendet werden. Anastacia Garcia und Mary Latt, zwei Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstrieren dieses Verfahren. Beginnen Sie mit einem geeigneten transgenen C. elegans-Stamm der gewünschten Art; in dieser Studie wird der transgene Stamm TH32 verwendet, um Chromosomen und Zentrosomen als Marker für die Zellteilung sichtbar zu machen.

Erzeugen Sie eine synchronisierte Population, indem Sie erwachsene Exemplare unter Einwirkung von Schwerkraft in einer Hypochloritlösung aufbrechen, und verwenden Sie die verbleibenden Embryonen, indem Sie erwachsene Individuen unter Schwerkrafteinfluss auf eine beimpfte Platte übertragen und Eier für eine bis zwei Stunden ablegen lassen, oder indem Sie L4-Larven aus einer gemischten Population auf eine neue beimpfte Platte übertragen. Kultivieren Sie die Nematoden bei 20 °C bis zum jungen Erwachsenenstadium (GR), was ungefähr 96 Stunden nach dem Schlüpfen, 72 Stunden nach dem L1-Stadium oder 24 Stunden nach der Häutung zum L4-Stadium benötigt. Diese Methodik ermöglicht die Erzeugung einer Population junger erwachsener Individuen, die eine hohe Anzahl junger Embryonen enthalten, in denen sich große Blastomeren und Kerne befinden, die optimal für die Abbildung subzellulärer und subnukleärer Veränderungen sind.

Um eine feuchte Kammer für die vorbereiteten Objektträger einzurichten, legen Sie ein feuchtes Papiertuch in eine große Petrischale oder einen Behälter, der mit einem Deckel ausreichender Größe abgedeckt ist. Bereiten Sie geschmolzenes 2% Aros in entionisiertem Wasser vor, indem Sie die Mischung in Glaswaren im Mikrowellenofen oder in einem Wasserbad erhitzen. Geben Sie anschließend ein bis drei Tropfen warmes Aros auf einen sauberen Glas-Objektträger, setzen Sie sofort einen zweiten Objektträger umgekehrt senkrecht auf die Aros-Tropfen und drücken Sie leicht darauf, sodass das resultierende Polster dünn und frei von Luftblasen wird.

Nachdem sich das Aros langsam abgekühlt hat, nehmen Sie die beiden Objektträger auseinander, wobei das Aros-Polster auf einem der Objektträger intakt bleibt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Aros-Polster dünn genug ist, um die Fokussierung des Mikroskops nicht zu beeinträchtigen. Verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um das Aros-Polster zu einem kleinen quadratischen Vorrat zurechtzuschneiden.

Die Objektträger in der vorbereiteten feuchten Kammer aufbewahren, bis sie verwendet werden. Mit demselben sauberen Rasierklingenblatt vorsichtig die Kante des Aros-Pads greifen und es vom Objektträger auf ein rundes 25-Millimeter-Mikrodeckglas übertragen. Dabei sollte vermieden werden, dass Luftblasen unter dem runden Deckglas entstehen; es muss passend in den Mikroinkubator passen.

Geben Sie einen Tropfen Anästhetikum auf das Aros-Pad. Wählen Sie fünf bis zehn Würmer aus und legen Sie sie in den Tropfen mit Anästhetikum. Warten Sie ein bis drei Minuten, bis die Würmer ihre Bewegung eingestellt haben.

Mit einer Pipettenspitze einen Tropfen Hohlkohlenstofföl auf die Würmer geben, um eine Austrocknung der Würmer zu verhindern, während Gas durch die Kammer strömt. Anschließend ein Ende des flexiblen Kunststoffschlauchs an die Kammer anschließen. Die beiden Hälften des geschlossenen Perfusions-Mikroinkubators trennen und die Deckglasplatte vorsichtig aufrecht auf den unteren Ring setzen.

Schließen Sie die beiden Seiten der Kammer fest zusammen. Verbinden Sie anschließend die Kammer über den flexiblen Kunststoffschlauch mit dem Stickstoffgasbehälter und platzieren Sie sie auf dem Mikroskoptisch. Überprüfen Sie auf mögliche Lecks, indem Sie sicherstellen, dass der Schlauch und die Anschlussstopfen an der Seite der Kammer fest verbunden sind, um Embryonen abzubilden.

Zuerst die Tiere bei niedrigerer Vergrößerung lokalisieren. Danach zur geeigneten höheren Vergrößerung wechseln. Um embryonale Blasphemer in erwachsenen Organismen abzubilden, den 488 Nanometer Laser verwenden, um das GFP-Fusionsprotein in den Zellen von Interesse zu lokalisieren.

Um einen bestimmten Stadium des Zellzyklusarrests, beispielsweise die späte Prophase, zu visualisieren, identifizieren Sie einen Blasphemer in einem vorherigen Stadium der Zellteilung, wie der späten Interphase oder der frühen Prophase. Spülen Sie die Kammer mit Stickstoffgas durch und überwachen Sie weiterhin die Blasphemeren, während der Stickstoff die Kammer füllt, wobei Sie gegebenenfalls die Fokusebene anpassen. Führen Sie eine Zeitrafferaufnahme durch, um das gewünschte Phänomen von Interesse in diesem Fall zu erfassen.

Prophase-Arrest und Andocken der Chromosomen an die innere nukleare Membran. Nehmen Sie alle 10 Sekunden ein Bild auf, bis zu 30 Minuten lang. Typischerweise tritt ein durch Anoxie induzierter Prophase-Arrest innerhalb von 20 bis 30 Minuten nach Beginn des Stickstoffgasstroms auf.

Um die Erholung aus dem durch Anoxie induzierten Arrestzustand zu dokumentieren, schalten Sie das Gas aus und lassen Sie die Kammer unter Aufzeichnung einer Zeitrafferserie auf Normoxie zurückkehren. Die Wiederaufnahme des Zellzyklus und die Rückbildung der Chromosomen erfolgt typischerweise innerhalb von fünf bis 20 Minuten. Verwenden Sie ImageJ oder Photoshop, um Bilder und Videos zu bearbeiten, und importieren Sie diese in QuickTime zur Darstellung.

Innerhalb des Embryos, der Anoxie ausgesetzt war, kondensieren die Chromosomen der Prophase. Blasphämer lagern sich an die innere nukleare Peripherie an. Ein Phänomen, das als Chromosomen-Docking bezeichnet wird. Nach der Reoxygenierung setzt die Zellzyklusprogression erneut ein und die Chromosomen der Prophase.

Blasphemie bewegt sich vom nuklearen Peripheriebereich zur äquatorialen Platte, was einen Fortschritt in die Metaphase anzeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei bis vier Stunden mit geeignet gestadierten Tieren durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, ausschließlich gesunde, junge adulte Tiere zu verwenden, ausreichend Zeit einzuplanen, um das Experiment abzuschließen, und Geduld zu zeigen, wenn man lernt, geeignet gestadierte Blasphemierer auszuwählen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man anoxieinduzierte subzelluläre Ereignisse in vivo unter Verwendung von GaN-Embryonen und einer Gasdurchflusskammer an einem leistungsstarken Mikroskop aufzeichnen kann.