Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren C. elegans Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine in vivo Technik zur Abbildung der subzellulären Dynamik in Sea Elegance Embryonen zu beschreiben, die Anoxie ausgesetzt sind, unter Verwendung eines Gasfluss-Through-Setups an einem Hochleistungsmikroskop. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe junger erwachsener transgener Tiere vorbereitet wird, um eine geeignete Population junger Embryonen für die Bildgebung zu erzeugen. Bereiten Sie anschließend dünne Agros-Pad-Objektträger für die Verwendung in der Mikroinkubationskammer vor.

Dann werden die Sea Elegance ordnungsgemäß betäubt und mit Halo-Kohlenstofföl bedeckt, um ein Austrocknen zu vermeiden, wenn sie dem Gasstrom ausgesetzt sind. Zum Schluss wird das runde Deckglas mit den anästhesierten Tieren in die Mikroinkubationskammer gelegt. Die Kammer wird dann auf den Mikroskoptisch gestellt und mit Stickstoffgas gefüllt, um eine anoxische Umgebung zu erzeugen, während schließlich die Verwendung eines Gasstroms durch die Mikroinkubationskammer abgebildet wird.

In Verbindung mit der in vivo Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die hochauflösende detaillierte Videos und Bilder des Zellzyklusstillstands als Reaktion auf Anoxie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der indirekten Immunfluoreszenz besteht darin, dass subzelluläre Veränderungen in vivo dokumentiert werden können, während die Tiere bestimmten Bedingungen ausgesetzt sind. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die durch Anoxie induzierte schwebende Animation in Elegans-Embryonen geben.

Es kann auch auf andere Systeme wie Hefe, Zellkulturen oder andere kleine Wirbellosen- oder Wirbeltierembryonen angewendet werden. Zusätzliche Bedingungen wie Hyperoxie, Temperatur, Stress oder Behandlung mit kleinen Molekülen können ebenfalls angewendet werden. Anastacia Garcia und Mary Latt, zwei Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstrieren dieses Verfahren. Beginnen Sie mit einem geeigneten transgenen C-Elgan-Stamm, der in dieser Studie von Interesse ist, wird der transgene Stamm TH 32 verwendet, um Chromosomen und Zentrosomen als Marker für die Zellteilung sichtbar zu machen.

Erzeugen Sie eine synchronisierte Population, indem adulte Schwerkrafttiere in Hypochloritlösung zerfallen und verbleibende Embryonen verwendet werden, indem adulte Schwerkrafttiere auf eine ausgesäte Platte und ein Ei gepflückt werden, ein bis zwei Stunden legen oder L 4-Larven aus einer gemischten Population auf eine neue ausgesäte Platte gepflückt werden. Züchten Sie Nematoden bei 20 Grad Celsius bis zum GR-Jungerwachsenenalter, was etwa 96 Stunden nach dem Schlüpfen, 72 Stunden ab der ersten Larve oder 24 Stunden nach der Häutung von L vier dauert. Diese Methode bietet die Möglichkeit, eine Population junger Erwachsener zu erzeugen, die eine große Anzahl junger Embryonen enthält, die große Blasphemieren und Zellkerne enthalten, die optimal für die Abbildung subzellulärer und subnukleärer Veränderungen sind.

Um eine feuchte Kammer für vorbereitete Objektträger einzurichten, legen Sie ein feuchtes Papiertuch in eine große Petrischale oder einen Behälter, der mit einem ausreichend großen Deckel bedeckt ist. Bereiten Sie geschmolzene 2%aros in deionisiertem Wasser vor, indem Sie die Mischung in Glaswaren über eine Mikrowelle oder ein Wasserbad erhitzen. Legen Sie dann ein bis drei Tropfen warmen Aros auf ein sauberes Glasmikroskop Objektträger. Platzieren Sie sofort einen zweiten Objektträger senkrecht auf den Aros-Tropfen und drücken Sie leicht an, so dass das resultierende Pad dünn und frei von Luftblasen ist.

Nachdem der Aros abgekühlt ist, nehmen Sie die beiden Objektträger langsam auseinander, wobei das Aros-Pad auf einem der Objektträger intakt bleibt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das aros pad dünn genug ist, um die Fokussierung des Mikroskops nicht zu beeinträchtigen. Später. Forme das Aros Pad mit einer sauberen Rasierklinge zu einem kleinen quadratischen Behälter.

Schiebt sich in die vorbereitete Feuchtkammer, bis sie einsatzbereit ist. Nehmen Sie mit der gleichen sauberen Rasierklinge vorsichtig die Kante des aros Pads und übertragen Sie sie vom Objektträger auf ein rundes 25 Millimeter großes Mikro-Deckglas. Um die Ansammlung von Luftblasen unter der runden Abdeckung zu vermeiden, sollte das Glas angemessen in den Mikroinkubator passen.

Geben Sie einen Tropfen Betäubungsmittel auf das aros Pad. Wählen Sie fünf bis 10 Würmer aus und geben Sie sie in den Tropfen Narkosemittel. Warten Sie ein bis drei Minuten, bis sich die Würmer nicht mehr bewegen.

Geben Sie mit einer Pipettenspitze einen Tropfen heiliges Kohlenöl auf die Würmer, um zu verhindern, dass die Würmer austrocknen, wenn Gas durch die Kammer strömt. Verbinden Sie als Nächstes ein Ende des flexiblen Kunststoffschlauchs mit der Kammer. Trennen Sie die beiden Hälften des geschlossenen Perfusions-Mikroinkubators und stellen Sie das Deckglas vorsichtig aufrecht auf den unteren Ring.

Schließen Sie die beiden Seiten der Kammer fest zusammen. Verbinden Sie dann die Kammer über den flexiblen Kunststoffschlauch mit dem Stickstoffgastank und platzieren Sie sie auf dem Mikroskoptisch. Überprüfen Sie, ob es Lecks gibt, indem Sie sicherstellen, dass die Schläuche und Portstopfen an der Seite der Kammer sicher befestigt sind, um die Embryonen abzubilden.

Lokalisieren Sie zunächst Tiere bei geringerer Vergrößerung. Wechseln Sie dann zur entsprechenden höheren Vergrößerung. Um embryonale Blasphemieren bei Erwachsenen abzubilden, verwenden Sie den 488-Nanometer-Laser, um das GFP-Fusionsprotein in den interessierenden Zellen zu lokalisieren.

Um ein spezifisches Stadium des Zellzyklusarrests, z. B. eine späte Prophase, zu visualisieren, identifizieren Sie einen Blasphemier in einem früheren Stadium der Zellteilung, wie z. B. der späten Interphase oder der frühen Prophase. Die Kammer mit Stickstoffgas durchbluten und die Gotteslästerer weiter überwachen, während der Stickstoff die Kammer füllt, wobei die Fokusebene nach Bedarf angepasst wird. Führen Sie eine Zeitrafferaufnahme durch, um das gewünschte Phänomen von Interesse in diesem Fall zu erfassen.

Prophasenarrest und Andocken von Chromosomen an die innere Kernmembran. Nehmen Sie Bilder bis zu 30 Minuten lang alle 10 Sekunden auf. Typischerweise tritt ein anoxieinduzierter Prophasenarrest innerhalb von 20 bis 30 Minuten nach Beginn des Stickstoffgasflusses auf.

Um die Wiederherstellung aus dem durch Anoxie induzierten Stillstand zu dokumentieren, schalten Sie das Gas aus und lassen Sie die Kammer zur Normoxie zurückkehren, während Sie eine Zeitrafferreihe aufnehmen. Die Wiederaufnahme des Zellzyklus und die Auflösung der Chromosomen erfolgt in der Regel innerhalb von fünf bis 20 Minuten. Verwenden Sie erris image J oder Photoshop, um Bilder und Videos zu verarbeiten und sie zur Anzeige in QuickTime zu importieren.

Innerhalb des Embryos, der Anoxie ausgesetzt ist, die Chromosomen der Prophase. Gotteslästerer werden sich verdichten und sich mit der inneren nuklearen Peripherie ausrichten. Ein Phänomen, das als Chromosomenandocken bei Reoxygenierung bezeichnet wird, wird das Fortschreiten des Zellzyklus wieder aufnehmen und die Chromosomen der Prophase werden wieder gebildet.

Die Blasphemie wird sich von der nuklearen Peripherie auf die Äquatorplatte verlagern, was auf ein Fortschreiten in die Metaphase hinweist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden mit entsprechend inszenierten Tieren durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, nur gesunde junge erwachsene Tiere zu verwenden, um genügend Zeit für das Experiment zu haben und geduldig zu sein, wenn Sie lernen, angemessen inszenierte Gotteslästerer auszuwählen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man anoxieinduzierte subzelluläre Ereignisse in vivo mit GaN-Embryonen und einem Gasfluss durch die Kammer auf einem Hochleistungsmikroskop erfassen kann.