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Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die elektrische Aktivität von Nerven, Muskeln und Neuronen sowie die entsprechenden Bewegungen der Fressorgane während fressbezogener motorischer Programme zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst die bukkale Masse aus einer anesthetisierten Plegia entfernt und Hakenelektroden an wichtige Nerven und Muskeln angebracht werden. Der zweite Schritt besteht darin, die bukkale Masse in eine Ableitungsschale zu legen und die Ganglien für die extrazelluläre Ableitung vorzubereiten.

Anschließend werden die Zielneuronen mithilfe extrazellulärer Elektroden lokalisiert. Der letzte Schritt besteht darin, fressassoziierte motorische Programme wie Beißen, Schlucken und Ablehnen auszulösen und aufzuzeichnen. Letztendlich dient die suspendierte bukkale Masse-Präparation dazu, die Aktivität von Nerven, Muskeln und einzelnen Neuronen während unterschiedlicher, dem Fressverhalten ähnlicher Bewegungen der bukkalen Masse darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie isolierten Ganglien-Studien liegt darin, dass Aufzeichnungen von Nerven, Muskeln und einzelnen Neuronen direkt mit den Bewegungen des Fressapparats verknüpft werden können. Bei der Demonstration des Verfahrens wird huu, ein Doktorand aus unserem Labor, assistieren. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine gesunde Plegia mit einem Gewicht von 200 bis 300 Gramm in einem Präparationsbehälter anästhesieren, wozu etwa 50 % des Körpergewichts an isotonischer Magnesiumchloridlösung injiziert werden. Nach der ersten Injektion in der Nähe des Schwanzes des Tieres sollte die Oberfläche des Tieres sanft massiert werden, um das Magnesiumchlorid zu verteilen.

Geben Sie bei Bedarf zusätzliche Injektionen in der Nähe des Kopfes des Tieres vor. Sobald das Tier nicht mehr auf leichte taktile Reize reagiert, befestigen Sie es mit der dorsalen Seite nach oben auf dem Tablett. Stecken Sie eine Nadel in den Schwanz und jeweils eine Nadel in jeden vorderen Tentakel.

Verwenden Sie dann die Pinzette, um die Haut des Tieres in der Kopfmitte zu greifen und anzuheben. Hinter den Rhino-Fours eine koronare Inzision quer über den Kopf des Tieres direkt hinter der gehaltenen Stelle durchführen. Danach eine mittlere sagittale Inzision zwischen den Rhino-Fours in Richtung Mund vornehmen, um die bukkale Muskulatur freizulegen.

Ziehen Sie anschließend die Hautlasche vom Buccalamass ab und schneiden Sie durch die Nerven und das Bindegewebe, die mit der Körperwand verbunden sind. Um diese Hautlasche vollständig von der Buccalamass zu trennen, achten Sie darauf, keine Nerven oder Gewebe zu durchtrennen, die der Buccalamass selbst angehören. Danach greifen und halten Sie die Speiseröhre.

Schneiden Sie durch die Speiseröhre hinter dem gehaltenen Punkt. Heben Sie die Speiseröhre an und ziehen Sie die bukkale Masse hinter der bukkalen Masse nach oben. Die Cerebralganglien, Plural- und Pedalganglien bilden einen Ring, wobei das Cerebralganglion über die cerebrobukkalen Verbindungsstränge mit den bukkalen Ganglien verbunden ist.

Lassen Sie diese Ringganglien am Buccal-Mass angeheftet und durchtrennen Sie alle Nerven, die von diesen Ganglien zu anderen Körperteilen abzweigen. Durchtrennen Sie dann das Bindegewebe um die Buccal-Mass herum und heben Sie die Buccal-Mass weiter an, während sie zunehmend vom Körper gelöst wird. Sobald die Buccal-Mass nur noch am Mund befestigt ist, halten Sie die Speiseröhre und die Buccal-Mass fest.

Geradeaus. Führen Sie einen letzten Schnitt unmittelbar vor den Kiefern durch, um den bukkalen Muskelkomplex vom Körper zu lösen. Legen Sie den bukkalen Muskelkomplex in eine Lösung aus 50 % isotonischer Magnesiumchloridlösung und 50 % SIA-Salzlösung, um eine teilweise Anästhesie aufrechtzuerhalten, während die Elektroden angebracht werden.

Platzieren Sie anschließend die Buccalmasse mit der Lösung in eine Petrischale mit Zigarrenboden, wobei der Buccalarterie an der ventralen Oberfläche der Buccalmasse durchtrennt wird. Entfernen Sie dann die pleuralen und pedalen Ganglien, indem Sie deren Verbindungen zum zerebralen Ganglion durchtrennen. Lassen Sie das zerebrale Ganglion über die CBCs mit den Buccalganglien und der Buccalmasse verbunden und durchtrennen Sie alle anderen Verbindungen zwischen dem zerebralen Ganglion und der Buccalmasse.

Kürzen Sie die Speiseröhre und die Speicheldrüsen auf eine geringe Länge. Befestigen Sie in diesem Schritt die Hakenelektroden am Ular-Nerv des Auges, an den beiden bukkalen Muskelnerven zwei und drei sowie am Ast A des bukkalen Nervs zwei. Verwenden Sie dazu ein Verfahren, das dem in der JoVE-Publikation von Collins und Shield gezeigten ähnelt und hier kurz zusammengefasst wird.

Positionieren Sie für jede Elektrodenablösung die Elektrode nahe dem Nerv oder Muskel, platzieren Sie den Zielnerv in den Haken und heben Sie ihn vorsichtig mithilfe eines Manipulators an. Trocknen Sie anschließend den Nervenabschnitt mit einem Kim-Tuch ab. Geben Sie eine Portion Schnellkleber-Gel auf den befestigten Nerv und stellen Sie sicher, dass der Haken vollständig mit Kleber bedeckt ist, während die Spitze des Referenzdrahts nicht mit Kleber bedeckt ist.

Als Nächstes wird eine Spritze mit einem Polyethylen-Schlauchaufsatz verwendet, um die Lösung aus der Schale auf den Kleber aufzutragen, wodurch die Oberfläche des Klebers aushärtet. Im nächsten Schritt wird eine runde Pyrex-Aufzeichnungsschale mit den Maßen 100 mal 50 Millimeter als Aufzeichnungskammer vorbereitet. Dazu wird mit einer Pipettenspitze eine dünne Schicht Vakuumfett in die Nut zwischen der Gehirn- und der Buckelkammer aufgetragen, um Leckagen zu minimieren. Anschließend wird die vordere Kammer mit einer Plescia-Salzlösung gefüllt.

Übertragen Sie die Buccalmasse vorsichtig von der Petrischale in die vordere Kammer der runden Pyrex-Schale und achten Sie darauf, dass keine der Elektroden straff gezogen werden, was die Nerven beschädigen könnte. Seien Sie besonders vorsichtig mit den Hakenelektroden, falls die Schale unter ein anderes binokulares Zerlege­mikroskop verbracht werden muss. Zum Ausdünnen der Hülle.

Gruppieren Sie die Elektroden auf jeder Seite des Buccalmasses zusammen. Halten Sie die Elektroden vorsichtig, indem Sie das Labortape anfassen, das die Anschlussstifte bedeckt, und stellen Sie erneut sicher, dass keine der Elektroden straff gezogen wird. Wenn die Petrischale unter dem Mikroskop positioniert ist, sollten die Elektroden sanft über die Ränder der Schale gelegt werden und während Pausen und zwischen den einzelnen Phasen des Experiments auf der Plattform aufliegen. Belüften Sie die Salzlösung in der Buccalmassenkammer mit einem Aquarienluftstein.

Als Nächstes das Cerebralganglion in der hinteren Kammer fixieren, wobei die CBCs durch die Kerbe verlaufen. Tragen Sie zusätzliches Vakuumfett über den CBCs auf. Geben Sie anschließend mehr SIA-Salzlösung in beide Teile der Schale, sodass die Ganglien vollständig bedeckt sind.

Stellen Sie sicher, dass der Salzspiegel niedriger ist als die Höhe der Vakuumfettabdichtung zwischen den zerebralen und bukkalen Kammern, damit kein Austreten zwischen den Kammern auftritt. Zu diesem Zeitpunkt sollte der bukkale Muskelkomplex auf dem Boden der vorderen Kammer liegen. Danach werden die bukkalen Ganglien auf der mittleren Plattform fixiert, um eine Beschädigung der Nerven zu vermeiden, die noch mit dem bukkalen Muskelkomplex verbunden sind.

Platzieren Sie die Nadeln nur auf der Hülle zwischen zwei Nerven. Fügen Sie dann zwei weitere Nadeln an der Seite der CBCs hinzu, um sie zu dehnen und zu befestigen. Halten Sie die bukkalen Ganglien flach oder drehen Sie sie, abhängig von der Lage der interessierenden Neuronen.

Um das bukkale Ganglion zu drehen, verwenden Sie ein feines Pinzettenpaar, um etwas überschüssige Hülle des CBC zu erfassen, und heften Sie sie zwischen dem zweiten und dritten bukkalen Nerv fest. Anschließend sind die meisten Zellkörper, die nahe der hinteren Kammer liegen und normalerweise nicht leicht von der Oberseite des bukkalen Ganglions aus zugänglich sind, nun sichtbar. Zuletzt befestigen Sie zwei Nadeln an der Hülle des bukkalen Ganglions in der Nähe der Seite der bukkalen Muskulatur.

Um die Bewegung des Buccalganglions zu minimieren, halten Sie die Hülle des Buccalganglions nahe der hinteren Kammer fest und schneiden Sie die überschüssige Hülle mit einer feinen Schere ab, ohne die Zellkörper freizulegen. Um Schäden zu minimieren, entfernen Sie nur die Menge an Hülle, die notwendig ist, um die Zellkörper sichtbar zu machen, nachdem die Hülle ausgedünnt wurde. Befestigen Sie alle Elektrodenstifte in ihren Buchsen an den Kabeln, die mit den Verstärkern verbunden sind.

Stellen Sie sicher, dass die Elektroden nicht straff gezogen sind und korrekt mit den entsprechenden Kabeln verbunden sind, und dass die Polaritäten richtig sind, um restliches Magnesiumchlorid auszuspülen. Ersetzen Sie das SIA-Salzlösung im Buccalamassengehäuse durch frische SIA-Salzlösung. Fädelen Sie anschließend einen Seidenfaden durch das Weichgewebe vorne an der Buccalamasse und dorsal zum Kieferknorpel.

Verwenden Sie zwei Stücke Modelliermasse, um die Naht am Rand der Schale zu befestigen, wodurch die bukkale Masse an ihrer vorderen Endposition aufgehängt wird. Ein Manipulator hält eine gläserne extrazelluläre Elektrode so, dass die Elektrodenspitze in der Nähe des bukkalen Ganglions liegt. Um ein Neuron zu lokalisieren und zu identifizieren, senken Sie die Spitze der extrazellulären Elektrode vorsichtig auf die Hülle ab.

Über dem Neuronensoma. Geben Sie einen stimulierenden Strom an und schalten Sie dann den Kanal, der zur Reizung des Somas verwendet wird, in den Aufnahmemodus um, um die Aktivität an der extrazellulären Elektrode und die entsprechende Aktivität an den Nerven zur Induktion einer Abstoßung aufzuzeichnen. Wie motorische Programme stimulieren Sie den Buccalnerv zwei A mit einer langen Serie von zwei Hertz, ein Millisekunde dauernden Impulsen, um EES-Muster zu erzeugen.

Die Muster setzen sich während der gesamten Stimulationsdauer fort und können bis kurz nach Beendigung der Stimulation anhalten. Um beißenähnliche motorische Programme auszulösen, bringen Sie einige Kristalle festen Caracol direkt auf das zerebrale Ganglion auf.

Wiederholte Muster beginnen im Allgemeinen innerhalb von fünf Minuten und dauern ungefähr 10 bis 15 Minuten an, bevor sie allmählich abnehmen, um das Schlucken auszulösen. Wie bei motorischen Programmen wird Caracol appliziert und abgewartet, bis die bukkale Masse starke Bissbewegungen erzeugt. Dann während einer Bissphase wird ein Streifen Alge in den Mund des Tieres gelegt, sodass es die Alge ergreift.

Hier erfolgen die Stimulation und Ableitung des identifizierten Motoneurons B9 sowie die Ableitung von demselben Neuron, dem Muskel I2 und mehreren Nerven während fressbedingter motorischer Programme. Hier sind die Videobilder aus derselben Serie motorischer Programme. Schluckmuster wurden durch die Applikation von Carbachol auf das zerebrale Ganglion und die anschließende Platzierung eines Seetangstreifens in die Greifzange während des carbacholinduzierten Beißen ausgelöst.

In diesem Bild ist die Radula vorgestreckt, um die Alge zu erfassen, und in diesem Bild hat sich die Radula zurückgezogen und zieht die Alge in den Mund. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die suspendierte bukkale Präparation aufgebaut wird und wie Aufzeichnungen der in-vitro-Fressmotorprogramme erhalten werden können.