Name: Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie Neo-Inselzellen in der Leber diabetischer Mäuse durch Gentransfer mit Hilfe-abhängigen Adenovirus-Vektoren induziert werden. Diese Methode normalisiert Blutzucker und Insulinspiegel.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH unterstützt: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), die Diabetes und Endokrinologie Research Center-(DERC - P30DK079638) am Baylor College of Medicine, ein Pilot &amp; Feasibility Zuschuss aus Die DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
<li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li>
<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

HDAds wurden entwickelt, um die Schwächen der ersten Generation Ads zu überwinden und für gentherapeutische Anwendung nutzbar zu machen. Allerdings bleiben technische Herausforderungen. Zum Beispiel erfordert HDAd HV für HDAd Verpackungs-und Vektor-Verstärkung ist nicht so effizient wie frühe Generation Ads. HV ist eine der ersten Generation Ad und jede Verunreinigung der HV Kompromiss die Wirksamkeit der HDAd. Daher sind hocheffiziente Transfektion und optimale Bedingungen für jede serielle Passage kritisch. Ein anderer kritischer Parameter für Vektorproduktion ist, welche Passage (P1-P4) sollte für nachfolgende Passage 5, die direkt als Inokulum für Suspensionskulturen verwendet werden. Unserer Erfahrung, werden die besten Ergebnisse durch den Durchgang durch die HDAd vector Anteil drastisch in der folgenden Passage (P3 in Abbildung 2) erhöht erhalten. Die Ausbeute an HDAd Vektoren hängt Transgen-Kassetten. Während vector Produktion, werden beide Transgene geäußert, da beide Gene unter sichubiquitäre Promotor. Ngn3 ist ein Transkriptionsfaktor und Btc ist ein Wachstumsfaktor, wonach die HDAd exprimierenden Vektor Transkriptionsfaktor, beeinflussen Zellstammbaums hemmt Vektor Amplifikation während diejenige exprimieren Wachstumshormon hilft in Vektor-Replikation und Verpackung können suggeriert. Mit Diabetes vorausgesetzt epidemische Ausmaße, sind neue Ansätze zur b-Zellmasse Wiederherstellung benötigt. In diesem Bericht wir Methoden, die Vorteile der HDAd Vektoren nutzen, um Gentransfer von Insel-definierenden Linie Transkriptionsfaktor, zusammen mit der für Ngn3 islet Wachstumsfaktor bewirken beschreiben, Betacellulin Inselneogenese in periportalen Regionen der Leber zu induzieren. Um die Wirksamkeit der dies zu bewerten, ist es wichtig zu Mäusen, die mit stabilen Hyperglykämie wählen und sicherzustellen, dass geeignete Kontrollen immer enthalten sind. Aus diesem Gentransfer Experimenten behandelt Leervektor diabetischen Mäusen sollte immer genutzt werden. Darüber hinaus verwenden HDAd-Ngn3 und HDAd-Btc individuell behandelten diabetischen mice dient dazu, den individuellen Beitrag dieser beiden Gene in Inselneogenese testen. Da unsere Daten zeigen, dass Ngn3 alleine ausreicht, um Inselneogenese induzieren, aber die Zugabe des Wachstumsfaktors, BTC, dient dazu, die Reaktion, die zu robusten Induktion Inselneogenese vermehren. Es ist auch wichtig, um zu testen, daß der Vektor Expression tatsächlich in das Zielgewebe, die Leber und auch erreicht, um zu demonstrieren, dass das Insulin im Plasma behandelten Mäusen getestet wird, die nicht aus Rest-Inseln in der Bauchspeicheldrüse, durch den Nachweis der Abwesenheit von pankreatischen Inseln in den diabetischen Mäusen. Zusammengefasst liegt der Vorteil des HDAd-Vektor-System für den Gentransfer in seiner hohen Klonierungskapazität, effiziente Transduktion und langanhaltende Genexpression in der Leber mit minimalen chronische Toxizität sowie seine Art nicht Integration von Vektor-Genom in den Wirt Chromosom. Die primären Einschränkungen sind die komplexen Schritte in seiner Generation und beteiligt ihrein vivo-Anwendung ist in erster Linie auf die Leber mit den beliebtesten Ad Serotyp 5 begrenzt. Inselneogenese können induziert vollständig wiederherzustellen Plasmainsulinspiegel und Glukosetoleranz bei diabetischen Mäusen durch Induzieren Inselneogenese in der Leber durch Gentransfer von Insel-definierenden Linie Transkriptionsfaktor, zusammen mit der für Ngn3 islet Wachstumsfaktor, Betacellulin werden. In diesem Bericht zeigen wir die optimale Protokoll zu hochwertigen HDAd-Ngn3 und HDAd-Btc erzeugen, und zeigen Techniken zu induzieren und zu beurteilen Inselneogenese in der Leber der diabetischen Mäuse Hyperglykämie umzukehren. Fußnote: Die virale Vektoren und die Zelllinien hier beschriebenen sind von der Vector Produktion Core Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Einige kommerzielle Kits sind auch zur Erzeugung HDAd Viren (zB Microbix biosyst verfügbarems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Mammalian Transfection Kit ProFectionR </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green SuperMix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM Pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, Klasse II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Glass Spinnerflaschen </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Glass Spinnerflaschen </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Schieben A-analysator casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Rohr OptiSeal Poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Cäsiumchlorid 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimale LE-80K Ultrazentrifuge </td></tr><tr><td> Filtern </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree Scientific, Inc </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> Insulin, Maus ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> Microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Maus-C-Peptid-ELISA-Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> Meerschweinchen Anti-Insulin-Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> Ziege-Anti-Pdx1 Antikörper </td><td> Geschenk von Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti Ngn3 Antikörper </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> Maus anti Nkx6.1 Antikörper </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. der Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> Anti-Betacellulin Antikörper </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Color Reagent SET. </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Farbe Endpoint Reagent Set </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spezifische Reagenzien und Ausrüstung.

neo-islet formation in leber der diabetischen mäuse von helper-abhängigen adenovirus-vektor-vermittelten gentransfer

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Typ 1-Diabetes wird durch T-Zellen vermittelten autoimmune Zerstörung von Insulin-produzierenden Zellen in der Bauchspeicheldrüse. Bisher Insulinersatzbehandlung ist immer noch die große Therapie, da Inseltransplantation wurde von Donor Verfügbarkeit und durch die Notwendigkeit für Langzeitimmunsuppression beschränkt. Induced Inselneogenese durch Gentransfer von Neuogenin3 (Ngn3), der Insel Linienhalter Definition spezifischer Transkriptionsfaktor und Betacellulin (BTC) hat eine kleine Insel Wachstumsfaktor das Potenzial, Typ 1 Diabetes zu heilen. Adenovirusvektoren (Anzeigen) sind hocheffiziente Gentransfervektor, allerdings muss frühen Generation Anzeigen mehrere Nachteile zur Verwendung in vivo. Helper-abhängige Anzeigen (HDAds) sind die am weitesten fortgeschrittenen Anzeigen, die entwickelt, um das Sicherheitsprofil von frühen Generation von Anzeigen zu verbessern und Transgenexpression 1 verlängert wurden. Es fehlt ihnen an chronischen Toxizität, weil sie viralen kodierenden Sequenzen 2-5 fehlt und behalten nur Ad cis elements notwendig Vektor Replikation und Verpackung. Dies ermöglicht Klonieren von bis zu 36 kb Gene. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode HDAd-Ngn3 und HDAd-Btc erzeugen und diese Vektoren in STZ-induzierte diabetische Mäuse liefern. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Co-Injektion von HDAd-Ngn3 und HDAd-Btc induziert &#39;neo Inseln&#39; in der Leber und kehrt Hyperglykämie bei diabetischen Mäusen.

Wir beschreiben hepatische neo-Inselzellen Formation in STZ (Streptozotocin)-induzierte diabetische Mäuse durch Gentransfer von Neurogenin3 (Ngn3) und Betacellulin (BTC) Verwendung von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor (HDAd) und der Umkehrung von Hyperglykämie. Unsere Methode nutzt die Vorteile von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren mit ihren hocheffizienten in vivo Transduktion und der lang anhaltende Genexpression.

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

Typ-1-Diabetes wird durch die T-Zell-vermittelte autoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden Zellen in der Bauchspeicheldrüse verursacht. Bisher ist der Ersatz von Insulin immer noch die ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe eines hilfsstoffabhängigen adenoviralen Vektors vermittelte Gentransfer neue Inselzellen im Lebergewebe von diabetischen Mäusen zu induzieren. Dies wird erreicht, indem hilfsstoffabhängige adenovirale Vektoren erzeugt werden, die den Inselzell-Transkriptionsfaktor Neurogenin 3 und den Inselzell-Wachstumsfaktor Betalin tragen, um die Bildung periportaler neuer Inselstrukturen in der Leber zu induzieren; die Vektoren werden anschließend in diabetische Mäuse injiziert. Die behandelten diabetischen Mäuse werden danach auf Normalisierung der Blutglukose, des Plasma-Insulinspiegels sowie auf das Vorhandensein insulinproduzierender Beta-Zellen in der Leber untersucht.Ergebnisse dieser Assays zeigen, dass die Hyperglykämie bei vektorbehandelten Mäusen infolge der Neubildung von Augenlidstrukturen in den periportalen Regionen der Leber umgekehrt wird. Der Vorteil des herpa-abhängigen avir-Vektors liegt in seiner breiten Tropismuspalette und hohen chronischen Kapazität. Der herpa-abhängige adenovirale Vektor enthält zudem keine avir-kodierende Region.Deshalb weist es keine chronische Toxizität auf. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Diabetes, da die Induktion neuer Inseln eine wirksame Alternative zur Inseltransplantation darstellt, die durch Spendermangel, Transplantatversagen und alloimmunologische Reaktionen begrenzt ist. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da der Transfektionsprozess aufgrund der großen Größe des Vektor-Klassenkameraden schwierig ist.Und um die Kontamination durch Hafen-Viren zu minimieren, müssen die Amplifikation und der Reinigungsprozess sorgfältig durchgeführt werden. Die Herstellung von hilfsabhängigen Adenovirusvektoren umfasst mehrere Schritte, die für optimale Ergebnisse sorgfältig befolgt werden müssen. Zum Vorbereiten des Transfektionsansatzes säen Sie 800.001 16-Zellen in jeweils zwei sechszölligen Petrischalen aus.Inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Nach zwei Tagen sind die Zellen zur Transfektion 70 bis 80 % konfluent. Am Tag der Transfektion.Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch fünf Milliliter frisches Medium und inkubieren Sie die Zellen für drei Stunden. Anschließend transduzieren Sie mit dem Pro Perfection Arm Säugertransfektionskit von Promega die Zellen vom Typ 16 mit 10 Mikrogramm DNA, die das Neurogen in drei kodiert, im Folgenden als drei bezeichnet, oder eine Beta-Zelle, im Folgenden als BTC bezeichnet. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen zweimal mit jeweils einem Milliliter Wachstumsmedium.Fügen Sie das Helfervirus bei 500 Vektorpartikeln pro Zelle in 0,1 Milliliter PBS mit Calcium und Magnesium hinzu. Stellen Sie dann die Zellen alle 10 Minuten in den Inkubator. Schwenken Sie die Schalen vorsichtig, um das Helfervirus gleichmäßig zu verteilen.Nach 60 Minuten 1,5 Milliliter Erhaltungsmedium hinzufügen und die Schalen für 24 Stunden in den Inkubator zurückstellen. Am nächsten Tag ein weiteres Milliliter Erhaltungsmedium hinzufügen. Anschließend die Zellen mithilfe eines Standard-Lichtmikroskops untersuchen, um zytopathische Effekte zu beurteilen.Infizierte Zellen werden rund und lösen sich ab. Fahren Sie mit der Inkubation der infizierten Zellen bis zum zweiten Tag fort. Zu diesem Zeitpunkt sollten mehr als 80 % der Zellen zytopathische Effekte zeigen.Sammeln Sie das rohe virale Lysat durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und überführen Sie es in ein Fünf-Milliliter-Gefäß für das rohe virale Lysat. Geben Sie 10 % des Volumens an 40 %iger Saccharose hinzu. Beschriften Sie dieses Gefäß als RVL für rohes virales Lysat Passage null bis zum Läuse.Um die Zellen zur Freisetzung viraler Partikel zu bringen, frieren Sie das Rohviruslysat dreimal im Wechsel in einem Minus-80-Grad-Gefrierschrank und einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad ein und tauen es wieder auf. Nach dem dritten Einfrier- und Auftauzyklus verwenden Sie das Medium, um den Vektor wie im begleitenden Text beschrieben weiter zu amplifizieren. Der Amplifikationsprozess des Vektors ergibt ein Rohviruslysat aus der fünften Passage oder P fünf des Vektors.Beginnen Sie für die großtechnische Produktion hilfsstoffabhängiger Adenoviren mit dem dreimaligen Einfrieren und Auftauen von P5 aus dem Vektorvermehrungsverfahren, wie zuvor während des Einfrier- und Auftauvorgangs beschrieben. Überführen Sie eine 16-Zellen-Kultur aus einem Dreiliter-Spinnerkolben in 500-Milliliter-Konischflaschen und zentrifugieren Sie sie bei 1000 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren alles bis auf 100 Milliliter des Überstandes.Resuspendieren Sie dann die Zellen und überführen Sie sie in einen 250-Milliliter-Spinnerkolben. Geben Sie das gesamte P5-rohe Viruslysat zu den resuspendierten Zellen hinzu. Fügen Sie anschließend das Helfervirus mit 200 Viruspartikeln pro Zelle hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius bei 60 U/min.Nach der Inkubation eine Milliliter der Zellsuspension in eine Vertiefung einer 12er-Vertiefungsplatte überführen. Die restliche Zellsuspension in einen neuen Dreiliter-Schüttelkolben überführen und zwei Liter Suspensionswachstumsmedium hinzufügen. Sowohl den Kolben als auch die Platte zwei Tage lang in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 60 U/min inkubieren. In den nächsten zwei Tagen die Zellen in der Platte auf zytopathische Effekte überwachen.Wenn die Zellen in der Platte zytopathische Effekte zeigen, weisen auch die Zellen im Rührkolben zytopathische Effekte auf. Nach der Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren sie mit 15 Milliliter 100 Millimolar Tris-HCl in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das mit P sechs beschriftet ist.Lagern Sie dieses Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius, bis die Reinigung erfolgt. Um den Vektor zu reinigen, geben Sie ein Milliliter 5 %iger Natriumdesoxycholatlösung zu dem aufgetauten Röhrchen mit dem P6-rohen Viruslysat hinzu. Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Gegeben Sie anschließend Magnesiumchlorid, RNA A und DNA 1 hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Gefäß bei 6.000 × g für 10 Minuten. Sammeln Sie nach dem Zentrifugieren das Überstandsvolumen in einem neuen 50-Milliliter-Gefäß und überführen Sie es in ein sterilisiertes NVT-65-Ultrazentrifugenröhrchen. Fügen Sie 2,8 Milliliter einer 1,25 Gramm pro Milliliter schweren Lösung aus Cäsiumchlorid mit geringer Dichte hinzu.Danach mit einer 2-mL-Pipette 2,8 mL einer 1,41 g/mL schweren CM-Chlorid-Lösung unterlaufen lassen, indem die Pipette bis auf den Boden des Reagenzglases geführt und die Lösung langsam freigesetzt wird. Anschließend mit einer 2-mL-Pipette fünf bis sechs Milliliter Überstand auf das Reagenzglas aufgetragen werden, wobei die Pipettenspitze an der Wand des Reagenzglases angesetzt und die Lösung langsam freigesetzt wird, bis das Reagenzglas bis zum Hals gefüllt ist.Andernfalls kann es während der Hochgeschwindigkeitszentrifugation kollabieren. Bei Bedarf den Rest des Rohrs mit 100 Millimolar Tris-HCl auffüllen. Anschließend bei 10 Grad Celsius für 30 Minuten bei 237.000 × g bei 10 Grad Celsius zentrifugieren.Nach der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ist ein einzelnes opaleszierendes Vektorband unterhalb des undurchsichtigen Zelltrümmers sichtbar. Gelegentlich kann unterhalb des deutlicher sichtbaren Vektorbands ein sehr schwaches Hilfsband beobachtet werden. Wischen Sie das Röhrchen am unteren opaleszierenden Band mit 70 %igem Ethanol ab.Dann mit einer Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattet ist, die Wand des Röhrchens an der Basis des Vektorbands durchstechen und das untere opaleszierende Band sammeln. Das gesammelte Vektormaterial in neue sterilisierte Ultrazentrifugenröhrchen überführen und anschließend eine Cäsiumchlorid-Dichtelösung mit 1,35 Gramm pro Milliliter so aufschichten, dass die Röhrchen bis zum Hals gefüllt sind.Zentrifugieren Sie über Nacht bei 10 Grad Celsius mit 237.000 × g. Nach dem zweiten Dichtegradienten sammeln Sie die opaleszierende Bande wie zuvor mittels Ultrazentrifugation. Überführen Sie die Bande in eine Dialyseskassette und dialysieren Sie über Nacht gegen drei Liter steriles T-Tris, HCl, das Magnesiumchlorid und Saccharose enthält, bei vier Grad Celsius; führen Sie dies am folgenden Tag durch.Um den hilfsabhängigen Adenovirusvektor aus der Dialysiskassette zu entfernen, injizieren Sie mit einer Drei-Milliliter-Spritze zwei Milliliter Luft in die obere Ecke der Kassette. Drehen Sie die Kassette um, sodass sich Spritze und Nadel in der unteren Ecke befinden, und ziehen Sie unter Beibehaltung der aufrechten Position der Kassette die Lösung in die Spritze zurück. Überführen Sie die Lösung, die nun das gereinigte Virus enthält, in beschriftete Kryoröhrchen.Geben Sie 20 Mikroliter für die physikalische Titerbestimmung und 50 Mikroliter zur DNA-Charakterisierung in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie ein. Die Kryoröhrchen enthalten das gereinigte Virus bei minus 80. Das gereinigte Virus sollte anschließend auf höhere Reinheit und Wirksamkeit in vitro überprüft werden.Wie im beigefügten Dokument beschrieben, wird Streptodin zur Induktion von Diabetes eingesetzt. In dieser Studie, wie im beigefügten Dokument beschrieben, überwachen Sie Streptozos- und behandelte Mäuse wöchentlich auf Hyperglykämie. Sobald der Blutzucker 48 Stunden lang zwischen 250 und 500 Milligramm pro Deziliter liegt, setzen Sie die Mäuse in die Schwanzvenenhalterung für eine Injektion in die Schwanzvene.Legen Sie den Schwanz in ein 50-Milliliter-Gefäß mit warmem Wasser, um die Schwanzvenen zu weiten. Wischen Sie anschließend den Schwanz mit einem in 70 % Ethanol getränkten Tuch ab. Befüllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer Nadel der Größe 30½ mit der geeigneten Vektor-Konzentration, und prüfen Sie, ob keine Bläschen in der Spritze vorhanden sind.Dann mit Daumen und Zeigefinger den Schwanz unterhalb der Injektionsstelle fassen und die Nadel in die Schwanzvene einführen. Befindet sich die Nadel in der Vene, kann ein Blutschoppen im Nadelaufsatz sichtbar werden. Den Vektor langsam injizieren.Wenn die Nadel korrekt platziert ist, tritt während der Injektion kein Widerstand auf. Entfernen Sie die Nadel und halten Sie die Injektionsstelle mit Mullbinde ab, um eine Blutung zu stoppen, bevor Sie die Maus in den Käfig zurückbringen. Nach der Vektorbehandlung überwachen Sie nüchternen Blutzucker nach sechsstündigem Fasten und den Körpergewicht wöchentlich sowie Insulin- und Leberenzymwerte alle zwei Wochen.Führen Sie sechs Wochen nach der Behandlung einen Glukosetoleranztest durch, um zu überprüfen, ob die Glukose-induzierte Insulinsekretion in vivo drei und sechs Wochen nach der Behandlung wiederhergestellt ist. Entnehmen Sie die Leber und die Bauchspeicheldrüse der Mäuse zur Analyse des Gewebe-MNA und zur immunhistochemischen Färbung, um zu beurteilen, ob Neogenese von Inselzellen in der Leber von diabetischen Mäusen mittels adenoviraler Vektor-vermittelter Genübertragung induziert werden kann. Hilfsabhängige Adenoviren oder H-D-A-D-N-G-N-drei- und BTC-Vektoren wurden wie in diesem Video beschrieben hergestellt und gereinigt; die Vektoren wurden diabetischen, durch Streptozotocin induzierten Mäusen über eine Schwanzveneninjektion verabreicht.Leere Vektoren und H-D-A-D-B-T-C-Vektoren allein dienten als negative Kontrollen. Der Blutzuckerspiegel wurde anschließend alle zwei Tage über einen Zeitraum von sieben bis zehn Tagen nach der Injektion überwacht. Die Hyperglykämie kehrte sich bei Mäusen, die sowohl HDAD und GN drei als auch H-D-A-D-B-T-C injiziert bekommen hatten, um, nicht jedoch bei den Kontrollmäusen.Die glucosestimulierte Insulinsekretion wurde ebenfalls mittels eines Glukosetoleranztests überwacht, der sechs Wochen nach der Behandlung wie hier gezeigt durchgeführt wurde. Die Insulinsekretion war bei den Mäusen, die mit HDAD und GN sowie H-D-A-D-B-T-C injiziert worden waren, wiederhergestellt, um zu überprüfen, ob das Insulin in der Leber synthetisiert wurde. C-Peptid- und Insulinhalt wurden in der Leber bestimmt.Die Konzentrationen von C-Peptid und der Gesamtgehalt an Insulin wurden mit einem kommerziellen ELISA-Kit gemessen. Das Vorhandensein von C-Peptid und Insulin in molaren Verhältnissen bestätigt, dass das im Lebergewebe nachgewiesene Insulin tatsächlich in der Leber synthetisiert wird. Die Immunhistochemie zeigte positive Zellen in der Leber von Mäusen, die mit HDAD, NGN drei und H-D-A-D-B-T-C behandelt wurden, nicht jedoch bei Mäusen, die mit Kontrollvektor behandelt wurden. Die Immunfärbung zeigte außerdem, dass keine verbliebenen Inselzellen im Pankreas der mit NGN drei BTC behandelten Mäuse vorhanden waren.Die expressionspezifische Linien-Transkriptionsfaktor-Expression in Augenlid wurde ebenfalls durch Immunfärbung der Leber bewertet. Wie hier gezeigt, wurde NGN drei in der Leber von NGN-drei-BTC-behandelten Mäusen exprimiert, jedoch nicht in der Leber von mit leerem Vektor behandelten Mäusen.Ebenso wurde BTC in der Leber von NGN3-BTC-behandelten Mäusen stärker exprimiert als nach Behandlung mit dem leeren Vektor, wie hier gezeigt. Die PDX1-Immunfärbung zeigte eine nukleäre Lokalisation in den Lebern der NGN3-BTC-behandelten Mäuse, nicht jedoch in den Lebern der mit leerem Vektor behandelten Mäuse. NKX6.1 wurde ebenfalls nur in den Lebern der NGN3-BTC-behandelten Mäuse nachgewiesen.Insbesondere deuten diese Ergebnisse auf eine erfolgreiche Induktion der Neubildung von Augenlidern in der Mausleber hin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hilfsabhängige adenovirale Vektoren erzeugt, um augenlidbestimmende Gene in die Leber einzuschleusen und so die Augenlid-Neubildung auszulösen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Wochen durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass das Helfervirus ein avirales Vektorvirus der ersten Generation ist, das uns unterstützt. Eine Kontamination sollte für die Anwendung in vivo auf ein Minimum beschränkt werden.

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Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Dieses Protokoll erlaubt es, Faktoren, die funktionelle Betazellmasse modulieren, um potentielle therapeutische Ziele für die Behandlung von Diabetes zu finden identifizieren. Das Protokoll besteht aus einem optimierten Verfahren zur Insel Replikation und Beta-Zellfunktion in isolierten Ratteninseln nach Manipulation der Genexpression mit Adenoviren zu beurteilen.

Die Beurteilung der Replikation und Beta-Zellfunktion in adenoviral-transduzierten Isoliert Nager Islets

Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Eine Methode für die omentalis Transplantation von Inseln in einer Maus wird eingeführt. Isolierte Inseln sind mit Hydrogel vermischt und das Gemisch wird in den omentalis Beutel einer diabetischen Maus gebracht. Dann, der Blutzucker wird überwacht, und Immuno-histochemische Analyse erfolgt.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Ein Protokoll zur Erstellung genmodifizierter menschlicher Pseudoislets aus dispergierten menschlichen Inselzellen, die durch Lentivirus mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA) transduziert werden, wird vorgestellt. Dieses Protokoll verwendet leicht verfügbare Enzym- und Kulturgefäße, kann leicht durchgeführt werden und produziert genetisch veränderte menschliche Pseudoislets, die für funktionelle und morphologische Studien geeignet sind.

Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet

Dieses Protokoll beschreibt eine unkomplizierte und minimalinvasive Methode zur Transplantation und Bildgebung von NIT-1-Zellen in nicht-adipösen diabetischen (NOD)-schweren kombinierten immundefizienten Mäusen, die mit Splenozyten konfrontiert wurden, die von spontan diabetischen NOD-Mäusen gereinigt wurden.

Biolumineszentes Monitoring des Transplantatüberlebens in einem adoptiven Transfermodell des Autoimmundiabetes bei Mäusen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Erfahren Sie, wie Neo-Inselzellen in der Leber diabetischer Mäuse durch Gentransfer mit Hilfe-abhängigen Adenovirus-Vektoren induziert werden. Diese Methode normalisiert Blutzucker und Insulinspiegel.

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

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