Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, reine und lebensfähige primäre Typ-II-Alveolarepithelzellen für anschließende funktionelle und molekulare Analysen zu isolieren. Zunächst werden die Lunge und die Luftröhre einer getöteten Maus mit einer Lösung von DYS displays und anschließend mit Agarose gefüllt. Danach wird die Lunge entfernt, nachdem die dispa Zeit hatte, die Lunge aufzulösen.

Das Gewebe wird manuell disintegriert. Die resultierende Suspension wird durch eine Reihe von Sieben mit abnehmender Porengröße filtriert. Anschließend werden Typ-II-Alveolarepithelzellen durch negativen Flusszytometrie-basierten Selektion isoliert.

Schließlich können die isolierten alveolären Epithelzellen vom Typ II verwendet werden, um funktionelle und molekulare Assays durchzuführen, um ihre Rolle bei Atemwegsinfektionen und bei Autoimmunerkrankungen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der pulmonalen Immunregulation zu beantworten, insbesondere im Kontext autoimmunvermittelter Lungenerkrankungen und viraler Infektionen. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Vorbereitung des Organs und der Zellsuspension schwer zu erlernen ist.

Der Gesamterfolg dieses Protokolls hängt von mehreren wichtigen Details während dieser Schritte ab. Für jede Maus im Experiment einen 15-Milliliter-Probengefäß mit vier Milliliter DYS-Bäder in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad vorwärmen. Kleine Aliquots von 1 % Low-Melting-Agarose in Wasser in einem 95-Grad-Celsius-Heizblock erhitzen, bis sie verflüssigt sind. Anschließend auf 45 Grad Celsius abkühlen und bis zur nächsten Verwendung bei dieser Temperatur halten.

Um die Mauslunge vorzubereiten, sprühen Sie eine durch CO2-Vergiftung getötete Maus mit Ethanol ein. Führen Sie einen langen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie des Körpers aus.

Danach die ventrale äußere Haut ziehen und vorsichtig das Peritoneum schneiden und entfernen. Nach der Exsanguination der Maus das Zwerchfell vorsichtig perforieren und entfernen und anschließend die Rippen abschneiden. Um Herz und Lunge freizulegen, besonders darauf achten, die Lunge nicht mit einer 26-Gauge-Kanüle und einer mit Kaltem gefüllten 10-Milliliter-Spritze zu verletzen.

PBS durchsticht die rechte Herzkammer und spült die Lunge mit PBS, bis sie blutfrei ist. Schneiden und entfernen Sie die Speicheldrüsen, um die Luftröhre freizulegen. Schneiden Sie außerdem vorsichtig die Muskulatur um die Luftröhre herum durch.

Als Nächstes wird eine indwelle Kanüle mit 22 Gauge in die Trachea eingeführt. Die Nadel wird entfernt und der Kunststoffkatheter in Richtung Lunge vorgeschoben. Der Katheter wird durch Anbringen einer kleinen Schnur um Trachea und Katheter fixiert.

Falls gewünscht, bereiten Sie eine Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeitsprobe vor, indem Sie die Lunge über den in die Trachea eingeführten Katheter mit PBS oder Medium spülen. Bewahren Sie die Lavageflüssigkeit bis zur weiteren Analyse auf Eis auf. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Verdauung und Gewebeaufspaltung.

Um den Erfolg dieses Protokolls sicherzustellen, müssen Sie darauf achten, dass die komplette Dispa in allen Lungenlappen und nach der Gewebeverdauung vollständig aufgefüllt ist. Sie müssen das Gewebe unter vorsichtiger Verwendung einer Zwei-Milliliter-Spritze vollständig zerkleinern, wobei ein maximales Volumen von zwei Millilitern der zuvor hergestellten Dispa über den Katheter in die Lunge injiziert wird, sodass alle Lappen vollständig expandiert sind. Wechseln Sie die Spritze gegen eine Ein-Milliliter-Spritze, die 0,5 Milliliter der verflüssigten Aros enthält, und geben Sie den Inhalt in die Lunge ein.

Lassen Sie die Spritze am Katheter, um einen Rückfluss der Aros zu verhindern, und bedecken Sie die Lunge sofort mit Laborpapier, Papier und Eis. Lassen Sie das Aero-Gel einige Minuten lang stehen. Entfernen Sie das Papier, das Eis und die Spritze sowie den Katheter.

Danach die Luftröhre durchtrennen und die Lunge, das Herz und den Thymus aus dem Brustkorb entfernen. Die präparierten Organe in einer Schale mit PBS spülen. Anschließend das Herz, den Thymus und die restliche Luftröhre von der Lunge ablösen und entsorgen.

Geben Sie die Lunge in das Röhrchen mit den verbleibenden zwei Millilitern Displays und inkubieren Sie sie 45 Minuten bei Raumtemperatur. Ändern Sie die Inkubation, um eine effiziente Blockade der FC-Rezeptoren phagozytierender Zellen vor dem Färbeprozess sicherzustellen. Überführen Sie die Lunge aus den Displays in eine Schale, die sieben Milliliter einer Lösung mit einem Mikrogramm pro Milliliter Anti-CD1632-Antikörper und 100 Mikroliter DNA in DMEM enthält, und zerkleinern Sie das Lungengewebe mithilfe von zwei Pinzetten vollständig, indem Sie es auseinanderziehen.

Anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler mit 200 U/min inkubieren, falls gewünscht. Die Zellsuspension kann dann bei vier Grad Celsius bis zum nächsten Schritt aufbewahrt werden. Pipettieren Sie die Zellsuspension durch eine Reihe von Nylonnetzen.

Geben Sie die Suspension zunächst durch einen 100-Mikron-Filter, der auf einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist. Wenn Proben zusammengeführt werden, leiten Sie die Zellsuspensionen von Mäusen derselben Gruppe durch denselben Filter. Sollte der Filter verstopfen, tauschen Sie ihn gegen einen neuen aus.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem 70-Mikron-Mesh-Filter. Achten Sie darauf, jeden Mesh sowie die Röhrchen und Schalen gründlich mit DMEM auszuspülen, um Zellverluste zu minimieren und die Ausbeute zu maximieren. Ziehen Sie anschließend die Suspension durch einen 48-Mikron-Mesh-Filter, der auf einem Kunststoff- oder Glasring befestigt ist, wie hier gezeigt.

Sammeln Sie das Durchflussvolumen in einer Petrischale. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend mit einem 30-Mikron-Sieb. Überführen Sie je nach Volumen das Filtrat in ein oder mehrere 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 160 × g und 4 °C.

Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in zwei Milliliter Erythrozytenlysepuffer. Beenden Sie die Lyse dann schnell durch Zugabe von 13 Milliliter DMEM-Medium. Überführen Sie die Lösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie 12 Minuten bei 160 × g und vier Grad Celsius.

Die Zellen wurden in drei Milliliter einer Primärantikörper-Lösung inkubiert, die Antikörper gegen CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD1632 und CD45 enthielt. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius oder auf Eis. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen mit DMEM auffüllen, und zentrifugieren Sie 12 Minuten lang bei 160 × g und vier Grad Celsius.

Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter DMEM und vorfiltern Sie sie durch einen 50-Mikron-Filter in ein Gefäß zur Zellsortierung. Zählen Sie die Zellen, um die Gesamtzahl der Zellen in der Lungensuspension zu ermitteln. Verwenden Sie unmittelbar vor der Probennahme eine 100-Mikron-Düse für die Zellquelle eines EC2.

Vortexen Sie die Zellsuspension, um sie zu mischen. Der Flüssigkeitsdruck sowie die Wellenlängen für Laseremission und -detektion hängen vom verwendeten Instrument für die Durchflusszytometrie-Zellsortierung und von den im Antikörpermarkierungsverfahren verwendeten Fluorochromen ab. Erstellen Sie zunächst ein Diagramm der seitlichen Streufläche gegen Fluoreszenz und setzen Sie das Tor auf alle Zellen mit hoher seitlicher Streufläche, die negativ für die zur Färbung verwendeten Fluorochrome sind.

Erzeugen Sie anschließend Streulicht-Streubereich (Seitenstreulichtfläche gegen Vorwärtsstreulichtfläche), Vorwärtsstreuhöhe gegen Vorwärtsstreulichtfläche sowie Seitenstreuhöhe gegen Seitenstreulichtfläche und setzen Sie ein Tor, um Doppelzellen oder Zellaggregate auszuschließen, und überführen Sie die Zellen in ein Reagenzglas mit DMEM. Bei der Verwendung von Lungenzellsuspensionen, die aus gesunden Mäusen isoliert wurden, macht das EC2-Tor typischerweise etwa 42 ± 10 % aller Ereignisse aus. Um die sortierten Zellen zu sammeln, zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 280 × g und 4 °C.

Suspendieren Sie die alveolären Epithelzellen vom Typ II oder aEC2 je nach Anforderung für die anschließende Analyse in Kultur, Medium oder Puffer. Primäre murine alveoläre Epithelzellen vom Typ II wurden durch negativen Flusszytometrie-basierten Selektion wie in diesem Video beschrieben isoliert; die Analyse der sortierten Zellen ist hier dargestellt. Wie angegeben.

Die Reinheit der isolierten Zellen beträgt ungefähr 92 ± 5 %. Die sortierten AEC2 wurden für das Tensidprotein C gefärbt; ein Phasenkontrastbild ist links und die Immunfluoreszenz ist rechts dargestellt. Nahezu 100 % der Zellen erwiesen sich als positiv für das Tensidprotein C, was die erfolgreiche Isolierung einer reinen Population bestätigt. Um die Auswirkungen einer In-vivo-Infektion mit Influenza-A-Virus zu untersuchen, wurden AEC2 aus C57BL/6-Mäusen isoliert, denen entweder phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder Influenza-A-Virus PR8 A/34 intranasal ein, zwei oder drei Tage zuvor verabreicht worden war.

Diese Diagramme zeigen Lungenzellsuspensionen von nicht infizierten sowie drei Tage infizierten C57BL/6-Männchen, die aufgrund der Rekrutierung von Immunzellen in die infizierte Lunge für die Sortierung gefärbt wurden. Der Anteil fluoreszenznegativer Seitenstreuungsfläche-hoher Zellen ist in der aus den drei Tage infizierten Mäusen gewonnenen Zellsuspension im Vergleich zu den nicht infizierten Mäusen deutlich vermindert. Die Expression des nukleären Proteins des Influenza-A-Virus in sortierten C2-Zellen wurde durch intrazelluläre Färbung mit einem gegen das nukleäre Protein spezifischen Antikörper analysiert.

Das Histogramm zeigt, dass eine aus in vivo infizierten Mäusen isolierte C2 eine spezifische Fluoreszenzsignal nach intrazellulärer Färbung für das Nukleoprotein des Influenza-A-Virus ergibt. Die Tabelle zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität der Nukleoproteinfärbung; die Intensität des Signals, das durch die intrazelluläre Nukleoproteinfärbung einer aus Influenza-A-Virus-infizierten Mäusen isolierten EC2 erzeugt wird, nimmt mit der Dauer der Virusinfektion zu, um die Lebensfähigkeit einer aus gesunden Mäusen isolierten EC2 zu demonstrieren und deren Anfälligkeit für eine Influenza-A-Virus-Infektion zu testen.

Influenza, die Expression eines viralen Kernproteins wurde ebenfalls in isolierten Zellen analysiert, die hier gezeigt infiziert wurden X ex vivo. Sechs Stunden nach der Infektion exprimiert ein erheblicher Anteil der EC2-Zellen das virale Kernprotein. Diese Daten sind hier zusammengefasst.

Der Prozentsatz einer EC2, die für die intrazelluläre Färbung des viralen Kernproteins positiv ist, hängt von der für das ex vivo-Infektionsexperiment verwendeten Virusdosis ab. Diese Ergebnisse zeigen, dass die isolierten primären Neuronen, eine EC2, lebensfähig sind und für eine virale Infektion und Replikation empfänglich sind, wie durch den Nachweis der Expression viraler Proteine belegt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es äußerst wichtig, daran zu denken, alle Schritte zur Gewebedigestion und -dissoziation sorgfältig durchzuführen.

Außerdem ist es sehr wichtig, strikt auf die fluoreszenznegativen und Seitenstreubereich-hohen Zellen zu achten. Beim Sortieren nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie molekulare und funktionelle Untersuchungen durchgeführt werden, um die Rolle des Typ-zwei-der-dritte-Zelltyps der Lunge im Kontext von Virusinfektionen und autoimmunvermittelten Lungenerkrankungen auszuschließen.