Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, CD1d-basierte künstliche antigenpräsentierende Zellen oder A APC zur Expansion von NK-T-Zellen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Proteine hinzugefügt werden, um die magnetischen Mikrokügelchen zu funktionalisieren. Im zweiten Schritt wird die initiale Population von NK-T-Zellen aus dem peripheren Blut angereichert.

Anschließend werden die angereicherten T-Zellen gemeinsam mit den A A PC kultiviert. Im letzten Schritt werden Phänotyp und Funktion der A A PC-Zellpopulation bewertet. Letztendlich kann die Reinheit der expandierten T-Zell-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden. Der Hauptvorteil von a APCs gegenüber aktuellen Methoden, die dendritische Zellen verwenden, liegt darin, dass dendritische Zellen eine hohe Spender-Variabilität aufweisen können.

APCs bieten eine reproduzierbare, standardisierte Methode zur Expansion von NK-T-Zellen, die sofort einsatzbereit ist. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als ich mit Dr. Schneck und Oaky an der Johns Hopkins arbeitete. Sie haben das Gebiet der Verwendung künstlicher antigenpräsentierender Komplexe zur Expansion klassischer CD8-T-Zell-Subsets maßgeblich vorangebracht.

Den Vorgang werden Dr. James East, ein Postdoktorand, und Dr. Wendys Sohn, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, ein Milliliter DynaBead M-450-Epoxyperlen in ein fünf Milliliter fassendes klares Borosilikatglasgefäß mit Gewinde zu überführen. Anschließend spülen Sie die Perlen mit drei Millilitern sterilen Puffer B8 in einem separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aus.

Fügen Sie 100 Mikrogramm humanen CD1D-Ig-Dimers und 20 Mikrogramm der gewünschten kostimulatorischen Moleküle zu einem Milliliter kalzium- und magnesiumfreier PBS hinzu. Stellen Sie anschließend das Glasröhrchen mit den Perlen auf einen Magneten und aspirieren Sie den Boratpuffer. Geben Sie dann die Proteinmischung zum Glasröhrchen hinzu und verschließen Sie es mit dem Deckel.

Mischen Sie die Lösung sofort durch Umstülpen des Fläschchens, decken Sie danach die Kappe mit Parafilm ab und stellen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. Stellen Sie das Glasfläschchen am nächsten Tag erneut auf den Magneten und entfernen Sie vorsichtig die Proteinmischung, wobei Sie die Kügelchen vermeiden. Waschen Sie die Kügelchen dreimal, indem Sie jeweils drei Milliliter Kügelchen-Waschpuffer hinzufügen und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius auf dem Rotator inkubieren.

Um zu bestätigen, dass die Proteine stabil auf die Kügelchen aufgebracht sind, färben Sie eine Aliquotprobe der Kügelchen mit Antikörpern und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie. Überführen Sie nun fünf mal 10 hoch sieben Kügelchen in ein kleines 1,5-Milliliter-Gläschen und waschen Sie die Kügelchen mit einem Milliliter steriler PBS. Danach 48 bis 72 Stunden vor der Verwendung.

Beladen Sie die gewaschenen Kügelchen mit Antigen in einem Milliliter steriler PBS, während die Kügelchen mit Antigen beladen werden. Sammeln Sie die PBMC, indem Sie zunächst das heparinisierte Spenderblut mit einem gleichen Volumen PBS bei Raumtemperatur verdünnen. Fügen Sie dann 15 Milliliter PHI bei Raumtemperatur hinzu, geben Sie es in 50-Milliliter-Konischflaschen und überlagern Sie langsam 25 Milliliter der verdünnten Blutmischung auf das PHI.

Rufen Sie danach, nachdem Sie die Proben 30 Minuten bei 700 × g und Raumtemperatur mit Abbremsung zentrifugiert haben. Überführen Sie die Lymphozyten-Schnittstelle vorsichtig mit einer Pasteurpipette in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie anschließend die Lymphozyten in 50 Milliliter PBS, verwerfen Sie den Überstand und vereinigen Sie die Röhrchen einer einzelnen Spenderin bzw. eines einzelnen Spenders in einem einzigen Röhrchen.

Nachdem die PBMC erneut mit 20 Milliliter PBS gewaschen wurden, zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie anschließend in Max-Puffer mit einer Konzentration von fünf mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter. Zur Isolierung der T-Zell-Fraktion inkubieren Sie 100 Mikroliter PAN-T-Zell-Anreicherungslösung aus dem EP-Human-T-Zell-Anreicherungs-Kit mit zwei Milliliter PBMC 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend inkubieren Sie die Lösung mit 100 Mikroliter magnetischen Kügelchen 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Bringen Sie das endgültige Volumen des Lösungsmittels auf 2,5 Milliliter und stellen Sie das Röhrchen dann auf das Magnet. Nach fünf Minuten gießen Sie den CD3-positiven Anteil schnell in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen ab. Waschen Sie die Zellen nun mit fünf Milliliter kaltem Max-Puffer und zählen Sie die lebensfähigen Zellen.

Entnehmen Sie eine Aliquotprobe für die Färbung nach Fakt, um zunächst die CD161-positiven Zellen auszuwählen. Resuspendieren Sie die angereicherten T-Zellen in 980 Mikroliter eiskaltem Max-Puffer und inkubieren Sie die Zellen anschließend 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit 10 Mikrogramm anti-CD161 monoklonalem Antikörper. Nach dem Waschen der Zellen resuspendieren Sie das Pellet in 800 Mikroliter Max-Puffer und 200 Mikroliter anti-US-IgG1-Mikroperlen.

Inkubieren Sie diese Lösung weitere 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Während die Zellen mit den Mikroperlen inkubieren, geben Sie drei Milliliter Max-Puffer hinzu, um eine LS-Säule zu equilibrieren. Nach dem Waschen dieses Zellanteils pipettieren Sie langsam die Zellen in drei Milliliter Max-Puffer in die Säule.

Spülen Sie die Säule nun dreimal mit je drei Milliliter frischem Max-Puffer. Geben Sie anschließend weitere drei Milliliter frischen Max-Puffer auf die Säule und überführen Sie die Säule in ein 15-Milliliter-Konischglas. Eluieren Sie die gereinigten CD161-positiven, CD3-positiven Zellen und zählen Sie danach den angereicherten NKT-Zell-Fraktion.

Beginnen Sie diesen Schritt mit der Kokultivierung von 10 hoch 6 angereicherten CD161-positiven, CD3-positiven T-Zellen und 10 hoch 6 AA-PC in 16 Millilitern vollständigem Kulturmedium. Pipettieren Sie 160 Mikroliter pro Vertiefung der Kokultur in eine 96-Loch-Gewebezüchtungsplatte aus Polystyrol mit U-förmigem Boden und einem Deckel mit geringer Verdunstungsrate. Am Tag 12 bis 14 ernten und zählen Sie die Zellen. Analysieren Sie die Populationen mittels Durchflusszytometrie und pflanzen Sie anschließend erneut aus und führen Sie die Kokultivierung durch.

Die expandierten NKT-Zellen, wie gerade gezeigt, frieren die überschüssigen NKT-Zellen nach der zweiten Expansion ein. Um die Funktionalität der A A PC-Zellen zu testen, erfolgt zunächst eine Co-Kultur von fünf mal 10 hoch vier NKT-Zellen pro Vertiefung mit fünf mal 10 hoch fünf A A PC in einem Endvolumen von 200 µL vollständigem Medium in einer 96-Loch-Rundbodenplatte. Nach 24 bis 48 Stunden wird der Zellkulturüberstand zur Analyse mittels ELISA gewonnen. Diese erste Abbildung zeigt, dass die CD1D-Ig-Proteine stabil auf der Oberfläche der magnetischen Perlen immobilisiert sind, wie hier dargestellt.

CD1D-Ig- und Anti-CD28-Antikörper sind beide auf der Oberfläche der magnetischen Kügelchen exprimiert, wie in dieser Grafik gezeigt. Das Vα14-positive murine NK-T-Zell-Hybridom DN3A2-D3 wurde entweder mit mittellöslichem, unbeladenem α-GalCer-Antigen, unbelegten AA-PC oder mit α-Gal-beladenen AA-PC koinkubiert. Anschließend wurden die Kulturüberstände gewonnen und die IL-2-Produktion mittels ELISA gemessen, was eine einfache Methode zur Prüfung jeder Charge von antigenpräsentierenden Zellen darstellt. In diesem Experiment wurden humane CD161-positive, CD3-positive periphere Blut-T-Zellen mittels magnetischer Kügelchenanreicherung angereichert.

Die Zellen wurden anschließend einmal pro Woche über einen Zeitraum von 14 Tagen mit Alpha-Galera-beladenen A A PC stimuliert und auf die Expression von V alpha 24 und V beta 11 analysiert. Wichtig ist, dass selbst bei einer relativ geringen anfänglichen NKT-Zellpopulation von 0,03 % eine Expansion auf etwa 67 % V alpha 24-positiver und V beta 11-positiver Zellen erreicht werden konnte. Hier wurden C ein R CD 1D-Zellen mit NKT-Zellen in den angegebenen Verhältnissen in An- oder Abwesenheit von Alpha Gal SER-Antigen in 96-Well-U-Boden-Platten für 20 bis 24 Stunden inkubiert.

Die von NKT-Zellen vermittelte Zelllyse der B-Zell-Lymphomlinie wurde anschließend mittels eines Chromfreisetzungsassays bewertet. A A PC-erweiterte NKT-Zellen konnten diese Lymphomzelllinie lysieren. In Gegenwart oder Abwesenheit von Alpha-Galactosylceramid wurden NKT-Zellen aus den PBMCs sowohl gesunder Spender als auch Krebspatienten expandiert und mit Alpha-Galactosylceramid beladen.

A A PC konnten die NKT-Zellpopulationen aus beiden Gruppen expandieren. Bei Verwendung einer Startpopulation von 2 Millionen CD161-positiven, CD3-positiven T-Zellen können nach zwei Expansionsrunden mehr als 107 Zellen erhalten werden. NK-NKT-Zellen können für funktionelle Untersuchungen verwendet werden, wie hier gezeigt.

Die ex vivo expandierten NKT-Zellen bleiben ansprechbar auf Alpha-Gal-Stimulation und sind weiterhin starke Produzenten von IL-17A, TNF-alpha und Interferon-gamma. Es sollte beachtet werden, dass, wenn die anfängliche T-Zell-Anreicherungspopulation gering ist und der zweite CD161-Anreicherungsschritt nicht durchgeführt werden kann, die durch APC vermittelte Expansion möglicherweise nicht die erwarteten Ergebnisse liefert. Wenn jedoch der Prozentsatz zirkulierender NKT-Zellen höher als 0,1 % ist, sollte dennoch eine signifikante Expansion invarianter NKT-Zellen erzielt werden können.

Insgesamt zeigen diese Daten, dass die auf CD1D-basierende AAPC dazu verwendet werden kann, primäre humane NK-T-Zellen effektiv zu expandieren und zu stimulieren, nachdem dieses Verfahren angewendet wurde. Andere Methoden wie die QPCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise nach der Kinetik der Aktivierung von NK-T-Zellen nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Hepatologie den Weg, um die Rolle von NKT-Zellen bei der Fettlebererkrankung zu untersuchen.