Name: Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in Drosophila Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Lernen Sie appetitives assoziatives olfaktorisches Lernen in Drosophila-Larven mit Fructose-Belohnung und Geruchstest. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Grundlagen von Lernen und Gedächtnis.

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Wir wollen vor allem die Mitglieder des Gerber Labor für technische Anleitungen auf ihren Versuchsaufbau und Anmerkungen zum Manuskript danken. Wir danken auch Lyubov Pankewytsch für Fliegenfischer Pflege und Wartung des Wildtyp Kantonen Lager. Diese Arbeit wird von der DFG-Stipendium TH1584/1-1 der SNF Gewährung 31003A_132812 / 1 und das Zukunftskolleg der Universität Konstanz (alle AST) unterstützt.

Ein. Vorbereitung <ol><li> Drosophila Wildtyp-Larven werden bei 25 ° C erhöht und 60% -80% Luftfeuchtigkeit in einem 14/10 Licht / Dunkel-Zyklus. Für die Steuerung das genaue Alter der Larven immer 20 Frauen sind mit 10 Männern in einem Fläschchen (6 cm Höhe und 2,5 cm Durchmesser), die etwa 6 ml Standard fly Essen beinhaltet setzen. Fliegen werden dürfen Eier für 12 h lag und in ein neues Fläschchen am zweiten Tag übertragen. 5-6 Tage nach der Eiablage Larven erreichen die Fütterung 3 rd instar der Bühne, wenn bei 25 ° C erhöht und kann nun für die Verhaltensexperiment verwendet werden. Allerdings muss man sicherstellen, um nur Larven, die sich noch in der Lebensmittel-und nicht der Larven aus der Seite der Flasche. Diese Larven haben bereits &quot;wandernden 3 rd instar Bühne&quot; erreicht - kurz vor der Verpuppung - und ihre Nutzung erschwert die Interpretation der Ergebnisse. </li><li> Zubereitung von 2,5% Agarose Petrischalen (anderen Labors nutzen auch Agar-Konzentrationen von 1% des gesamten Experiments, wieimmer geringeren Konzentrationen kann damit die Fütterung 3. Larvenstadium in das Substrat zu graben): Lösen Sie 2,5 g Agarose in 100 ml ddH 2 O. Heizen Sie die Lösung in einer Mikrowelle, bis es zu kochen beginnt. Vorsichtig schütteln Sie die Lösung und setzen Sie ihn wieder in die Mikrowelle, bis alle Agarose gelöst ist. Die heiße Lösung Agarose in Petrischalen so dass der Boden der Petri-Schalen vollständig bedeckt ist und die Agarose Lösung bildet eine glatte Oberfläche. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen Temperatur und schließen Sie den Deckel. Nicht sofort schließen die Deckel, weil es zur Kondensation von Wasser an den Deckeln ermöglichen würde. </li><li> Herstellung von 2M Fructose Petrischalen: Man löst 2,5 g Agarose in 100 ml ddH 2 O (wiederum ist die Nutzung von 1% Agar Konzentration möglich, jedoch kann sie zulassen Zuführen 3. Larvenstadium in das Substrat graben). Heizen Sie die Lösung in einer Mikrowelle, bis es zu kochen beginnt. Vorsichtig schütteln Sie die Lösung und setzen Sie ihn wieder in die Mikro-Welle bis alle Agarose gelöst ist. Vorsichtig 35 g Fruktose in die heiße Lösung, langsam rühren die Mischung, bis der Zucker aufgelöst ist, um Siedeverzug zu vermeiden. Die heiße Fructose-Agaroselösung in Petrischalen so dass der Boden vollständig bedeckt ist und der Fructose-Agaroselösung bildet eine glatte Oberfläche. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen Temperatur und schließen Sie den Deckel. Nicht sofort schließen die Deckel, weil es zur Kondensation von Wasser an den Deckeln ermöglichen würde. </li><li> Herstellung von 1-Octanol (OCT) Geruch Behälter: Füllen Sie 10 ul reines Oktober in eine maßgeschneiderte Teflon Geruch Behälter und schließen Sie es mit einem Deckel, der mehrere kleine Löcher für die Verdampfung des Geruchs zu ermöglichen hat. Eine detaillierte Beschreibung der Behälter in Gerber und Stocker 2007. Bereiten Sie drei Geruch Behälter für Oktober Geruch Behälter ermöglichen für die Verdampfung der eingesetzten Chemikalien, sondern vermeiden, daß Larven können direkt kontaktieren. So sind die hier beschriebenen Experimente gezieltAdresse olfaktorischen Lernens bei Larven ohne störende Geschmacks Nebenwirkungen. </li><li> Vorbereitung der Amylacetat (AM) Geruch Behälter: verdünnen AM 1:50 in Paraffinöl. Füllen Sie 10 ul der Verdünnung in einem speziell angefertigten Teflon Geruch Behälter und schließen Sie es mit einem Deckel, der mehrere kleine Löcher für die Verdampfung des Geruchs zu ermöglichen hat. Bereiten Sie drei Geruch Behälter für AM. Die Verdünnung ist aus praktischen Gründen wichtig, nämlich eine starke Bevorzugung eines Geruchs über die andere, die einen Lern-abhängige Veränderung der relativen bevorzugt zwischen den beiden Gerüche maskieren, zu vermeiden. Das gleiche Attraktion für Gerüche müssen eventuell im Labor vor dem Experiment werden durch Aufbringen der später beschriebenen Test (2.5) mit naiven Tieren bestätigt. Die Werte hier präsentiert auf mehreren Veröffentlichungen des Gerber-Labor, das vor kurzem von unserem Labor 9,15,16 wurden reproduziert basieren. </li><li> Die Beschriftung der Petrischalen: Vor den Verhaltensexperimente alle Petrischalen codiert werden. Das bedeutet, dassfructosehaltigen Petrischalen müssen zum Beispiel mit einem &quot;X&quot; oder ein &quot;A&quot; und Agarose nur Petrischalen mit einem &quot;Y&quot; oder &quot;B&quot; markiert werden. Dieser Code sollte der Experimentator erst alle Daten aufgezeichnet wurden aufgedeckt werden. Durch die Durchführung der Experimente &quot;blind&quot; ist es also nicht möglich, dass die Erwartungen der Experimentator kann die Leistung der Larven beeinflussen. Um ein Verständnis für die breite Leserschaft wir im Folgenden nur die Gerüche als konditionierte Stimuli (CS1 oder CS2), die entweder belohnt werden, wenn sie auf einer Fructose Petrischale (+) oder nicht belohnt präsentiert, wenn auf einem Agarose nur vorgestellt werden reden erleichtern Petrischale (-). </li></ol> 2. Zucker Belohnung Training und Test- <ol><li> Sammle 30 Fütterung 3 rd Larven aus einem Lebensmittel Fläschchen. Übertragung auf einen ersten Petrischale, die einige Tropfen Leitungswasser enthält und vorsichtig bewegen sie vorwärts und rückwärts mit einer Bürste. Übertragung auf einen zweiten Petrischale dass enthält auch einige Tropfen Leitungswasser water zu überprüfen, dass keine Nahrung Paste auf der Körperwandschicht der Larven bleibt, andernfalls Larven der Lage wäre, die Nahrungsmittelgeruch während des Experiments zu erleben. Dies würde wahrscheinlich zu verdunkeln den Lernprozess und ihre Leistung in der Testsituation. </li><li> Training: Um Larven Associate Gerüche trainieren mit einem appetitive Zucker Cue folgende Regelung angewendet wird. Setz einen OCT Geruch Behälter auf der linken und rechten Seite eines &quot;X&quot; gekennzeichnet - dadurch, Fructose Belohnung enthaltend (+) Petrischale (&quot;Blind&quot;-Experiment, für Details siehe 1,6). Fügen Sie die Gruppe von 30 Fütterung 3 rd Larven auf die Mitte der Petrischale, den Deckel schließen und warten, 5 min, während die Tiere Oktober ausgesetzt sind. Stellen Sie sicher, dass die Larven nicht im Wasser Tropfen gefangen und kann die Oberflächenspannung zu überwinden. Bis dahin Larven können frei auf der Petrischale zu bewegen und erleben Geruchs-und / oder geschmackliche Reize. </li><li> Training: Nehmen Sie die Larven aus der Petrischale mit einem feuchten Pinsel und übertragen diem auf eine zweite Petrischale, die mit einem &quot;Y&quot; bezeichnet ist - dadurch, Agarose nur (-), enthaltend Petrischale - und weist einen AM Geruch Behälter an seiner linken und rechten Seite angeordnet. Schließen Sie den Deckel und warten 5 Minuten, während die Tiere AM ausgesetzt sind. </li><li> Training: Repeat 2,2) und 2,3) zweimal, so dass alle 30 Larven Erfahrung drei Trainings-Zyklen: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). In diesem Experiment CS1 stellt Oktober und CS2-Codes für AM. </li><li> Test: Legen Sie eine Uhr und ein Oktober Geruch Container auf den gegenüberliegenden Seiten eines Agarose-only Petrischale. Übertragen der trainierten Tieren zur Mitte des Tests Petrischale. Schließen Sie den Deckel und warten Sie 5 min. Anschließend zählt die Anzahl der Larven auf der linken Seite, der mittlere und rechte Seite des Prüflings Petrischale. </li><li> Wiederholen Schritte 2.1) bis 2.5) mit einer zweiten Gruppe von 30 Fütterung 3. Larvenstadium aber tauschen die experimentellen Rollen von AM und OCT, dass die Tiere die folgende Ausbildung erhalten: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). In diesem Experiment CS1 stellt Oktober und CS2-Codes für AM. </li><li> Mögliche Vorkehrungen für die Ausbildung. Oben haben wir eine Ausbildung, die von drei Trainings Studien entweder Oktober / (+) existiert präsentieren - AM / (-) oder im reziproken Gruppe auch drei Trainings Studien AM / (+) - Oktober / (-). Jedoch zu sequenzieren abhängigen Effekte während des Trainings zu vermeiden, ist es wichtig, um die Reihenfolge der Reize im folgenden Wiederholungen des gesamten Tests variieren. Durch Variieren der Reihenfolge CS1 oder CS2 und auch die Belohnung Präsentation in der ersten oder zweiten Platte präsentierten sind vier verschiedene Sequenzen für die Ausbildung Versuche möglich: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Erste Gruppe </td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td><td> Gegenseitige Gruppe </td><td> CS2 / (+) - CS1 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (+) - CS2 / (-) </td><td></td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td></tr></tbody></table> Um systematische Wirkungen von Reizen im umgebenden experimentellen Umgebung zu verhindern, sollte man den Test in einer Hälfte der Fälle, dass Oktober auf der linken Seite dargestellt und AM nach rechts durchzuführen. In der anderen Hälfte der Fälle FSK sollte auf der linken und auf der rechten Oktober präsentiert. 3. Tests für Task-relevanten Sensory-Motor Fakultäten Die Gestaltung der oben beschriebenen Experimente zur Analyse ermöglicht geruchsbindende Zucker Lernen in Wildtyp Zuführen 3. Larvenstadium auf eigene. Jedoch in täglichen Lebens lab Forscher benutzen normalerweise zwei oder mehr verschiedenen Versuchsgruppen von Larven zu vergleichen, wenn olfaktorischen Lernen hängt auf einer Stufesondere Gen, einem bestimmten Satz von Neuronen, eine Mutante Lager, eine spezielle Diät, unterschiedliche Haltungsbedingungen, toxische Chemikalien zugesetzt während der Entwicklung, usw. Somit wird in allen Fällen, wenn zwei oder mehr Gruppen von experimentellen Larven getestet werden ein bis a tun hat gesetzt der obligatorischen Bekämpfung Experimenten zu überprüfen, ob die verschiedenen Gruppen von Larven richtige sensomotorische acuities zeigen. Diese Pflicht wird als potentielle Phänotypen nicht unbedingt aufgrund der reduzierten oder abgeschafft Fähigkeiten Associate Gerüche mit Zucker. Vielmehr könnte Potential Lern ​​Defekten auf Defekte in einem beliebigen Schritt des sensomotorischen Schaltung in der Verarbeitung von Gerüchen und / oder Zucker basieren. Oder in anderen Worten, wenn eine Mutante Larve ist nicht in der Lage zu erfassen Zucker, kann es nicht zu etablieren einen Zucker Speicher. Aber dies bedeutet nicht erlauben dem Schluss, dass die Larve kann man nicht lernen. Im Einzelnen sind folgende Kontrolle Experimente haben zu tun, um für die ordnungsgemäße Oktober, AM und Fructose Verarbeitung von transgenen Larven zu testen. Ein. Test für naiv Oktober preferenz Sammle 30 Fütterung 3 rd Larven aus einem Lebensmittel Fläschchen. Waschen Sie sie sorgfältig in Leitungswasser wie in 2.1 beschrieben. Legen Sie eine einzelne Oktober Geruch Container auf einer Seite einer Agarose Petrischale, fügen die Larven in die Mitte der Petrischale, den Deckel schließen und warten, 5 min, so dass die Larven können sich auf der Petrischale und orientieren in Richtung Oktober kriechen Geruchsquelle. Anschließend zählt die Anzahl der Larven auf der linken Seite, in der Mitte und auf der rechten Seite des Prüflings Petrischale. 2. Test für naiv AM Präferenz Sammle 30 Fütterung 3 rd Larven aus einem Lebensmittel Fläschchen. Waschen Sie sie sorgfältig in Leitungswasser wie in 2.1 beschrieben. Legen Sie eine einzelne Uhr Geruchs-Container auf einer Seite einer Agarose Petrischale, fügen die Larven in die Mitte der Petrischale, den Deckel schließen und warten 5 Minuten, so dass die Larven können sich auf der Petrischale und orientieren in Richtung der Uhr kriechen Geruchsquelle. Anschließend zählt die Anzahl der larvae auf der linken Seite, in der Mitte und auf der rechten Seite des Prüflings Petrischale. 3. Test für naiv Zucker Präferenz Sammle 30 Fütterung 3 rd Larven aus einem Lebensmittel Fläschchen. Waschen Sie sie sorgfältig in Leitungswasser wie in 2.1 beschrieben. Planen Petrischalen, die 2,5% Agarose enthält, in die eine Hälfte und einer 2M Fructose-Agarose Mischung in der anderen Hälfte. Fügen Sie den Larven auf die Petrischale, den Deckel schließen und für 5 min, so dass die Larven können sich auf der Petrischale und orientieren in Richtung fructosehaltigen Seite kriechen warten. Anschließend zählt die Anzahl der Larven auf der linken Seite, in der Mitte und auf der rechten Seite des Prüflings Petrischale. Vorbereitung der halbe-halbe Petrischalen: Bereiten normalen Agaroseplatten wie oben beschrieben in Abschnitt 1,2. Wenn die Agarose gefüllt Petrischalen abgekühlt sind, sorgfältig ausgeschnitten die Agarose entlang der vertikalen Achse mit einem Skalpell. Entfernen einer Hälfte des Agarosegel aus der Petrischale. Add ein heißes Fructose-Agarose-Lösung (zur Herstellung siehe 1,3) auf die leere Hälfte der Petrischale. Achten Sie darauf, dass beide Hälften und passen nicht bilden eine definierte Kante - das wirkt sich auf die Larven Wahlverhalten und macht einen Verhaltensanalysen ziemlich schwierig 4.. Sham Ausbildung Trotz Prüfung, ob transgene Fütterung 3 rd Larven in der Lage, auf einem Wildtyp-Ebene zwischen Oktober und Luft (3,1), AM und Luft (3,2) und Zucker und reine Agarose (3,3), ein zusätzlicher Satz von Test-Experimenten zu unterscheiden sind, hat vor kurzem eingeführt (zur Diskussion siehe Gerber und Stocker, 2007). Die Begründung für diesen Experimenten ist die folgende. Während der Ausbildung Larven durchlaufen massiven Handhabung und aufeinander Geruch und Zucker Stimulation. Somit ist es auch möglich, dass die beobachteten Phänotyp Lernen irreführend ist (obwohl naiven Geruch und Zucker Wahrnehmung Tests sind auf einem Wildtyp Niveau!). Tatsächlich ist es möglich, dass die transgenen Tiere differ von Wildtyp-Larven mit Bezug auf Belastbarkeit, Motivation, Müdigkeit, sensorische Anpassung kontextuellen Lernen und Veränderungen in der Sättigung. So führte Michels et al. (2005) Steuerelemente, die testen, ob eine bestimmte Mutante in der Lage, (1) zu erkennen ist, im Vergleich zu einem leeren Geruch Behälter Uhr, wenn Sie die Larven genau wie beim Training, außer dass Sie weglassen die Belohnung und lediglich um sowohl aussetzen zu behandeln Gerüche, (2) erkennen Oktober nach dem gleichen Regime, (3) erkennen Uhr gegenüber einem leeren Geruch Container, wenn Sie die Larven in einem Training-like Weise, außer dass man auch die Gerüche und lediglich auf die Belohnung aussetzen zu behandeln, und (4 ) erkennen Oktober nach dem gleichen Schema. Für eine umfassende Diskussion und weitere Details zu den Methoden finden Sie Michels et al (2005) und Gerber und Stocker (2007). 4. Datenanalyse für Zucker Belohnung Learning <ol><li> Um die Daten des Zuckers Belohnung Lernen Protokoll auszuwerten berechnen Oktober Präferenz Index (PREF OCT) für jede der beiden reziprokentisch geschult Gruppen: Für die erste Gruppe, die OCT / (+) erhalten - AM / (-) Ausbildung: PREF Oktober (Oktober + / AM-) = (Anzahl der Larven auf Oktober Seite - Anzahl der Larven auf AM Seite) / # aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen Für die zweite Gruppe, die AM / (+) erhalten - Oktober / (-) Ausbildung: PREF AM (AM + / OCT-) = (Anzahl der Larven auf AM Seite - Anzahl der Larven auf Oktober auf dieser Seite) / # aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen </li></ol><ol start="2"><li> Berechnen Sie einen Performance-Index (PI) für die beiden PREF Werte von 4,1). Die PI stellt assoziativen Lernens durch Auslöschen Störwirkung von Geruch und Bestrafung Belichtung Laufe der Zeit und Handhabung: PI = (PREF Oktober (Oktober + / AM) + PREF AM (AM + / Oktober)) / 2 So PIs können von -1 bis 1 liegen. Deutlich negative Werte repräsentieren aversive lernen, während deutlich positive Werte appetitive Lernen zu beschreiben. Ein komplettes Experiment umfasst in der Regel von 10 oder mehr PIs. Daten werden visualisiert, wie Boxplots including alle Werte einer Versuchsgruppe. 50% der Werte innerhalb der Box befindet, der Median-Performance-Index wird als fette Linie innerhalb der Box-Plot angezeigt. </li></ol> 5. Datenanalyse für Task-relevanten Sensory-Motor Fakultäten <ol><li> Zur Auswertung der Daten bei der Prüfung auf ordnungsgemäße Oktober Geruch Verarbeitung Berechnung eines OCT Geruch Präferenz-Index wie folgt: Geruch PREF Oktober = (Anzahl der Larven auf Oktober Seite - Anzahl der Larven auf der anderen Seite) / # aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen </li><li> Zur Auswertung der Daten bei der Prüfung auf ordnungsgemäße AM Geruchswahrnehmung berechnen AM Geruch Präferenz-Index wie folgt: Geruch PREF AM = (Anzahl der Larven auf AM Seite - Anzahl der Larven auf der anderen Seite) / # aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen </li><li> Zur Auswertung der Daten bei der Prüfung auf ordnungsgemäße Fructose Wahrnehmung berechnen Fructose Präferenz-Index wie folgt: PREF Fructose = (Anzahl der Larven auf Fruktose Seite - # von Larven auf der anderen Seite) / # Aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen </li><li> Details zum Schein Ausbildung sind in Michels et al. 2005. </li></ol>

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<li>Michels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+site+and+molecular+mode+of+synapsin+action+in+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning.</a> Learn Mem. 18, 332-344 (2011).</li>
<li>Saumweber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+synaptic+plasticity+are+impaired+upon+lack+of+the+synaptic+protein+SAP47%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47.</a> J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186, 735-755 (2010).</li>
<li>Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+TRP+channels+are+required+for+warm+and+cool+avoidance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Die beschriebene Einrichtung in Drosophila-Larven erlaubt die Untersuchung von assoziativen Lernen olfaktorischen innerhalb eines vergleichsweise elementaren Gehirn. Der Ansatz ist einfach, billig, einfach, in einem Labor zu etablieren und benötigt keine High-Tech-Ausrüstung 9. Wir präsentieren eine Variante des Experiments, um appetitive assoziativen Lernens durch Fructose Belohnung 11 verstärkt zu studieren. Die beschriebene Setup basiert auf einer Reihe von parametrischen Studien,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> CAS-Nummer </td></tr><tr><td> Fructose </td><td> Sigma </td><td> 47740 </td><td> 57-48-7 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71350 </td><td> 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td> 9012-36-6 </td></tr><tr><td> 1-Octanol </td><td> Sigma </td><td> 12012 </td><td> 111-87-5 </td></tr><tr><td> Amylacetat </td><td> Sigma </td><td> 46022 </td><td> 628-63-7 </td></tr><tr><td> Petroleum </td><td> Sigma </td><td> 18512 </td><td> 8012-95-1 </td></tr></tbody></table>

appetitive assoziative olfaktorischen lernens in<em&gt; drosophila</em&gt; larven

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Im Folgenden beschreiben wir die methodischen Einzelheiten der appetitive assoziative olfaktorische Lernen in Drosophila-Larven. Das Setup in Kombination mit genetischen Störungen, bietet ein Handle auf die neuronale und molekularen Grundlagen von speziell assoziativen Lernens in einer einfachen Larven Gehirns zu analysieren. Organismen können Erfahrungen aus der Vergangenheit zu präsentieren Verhalten anzupassen. Solche Akquisition von Verhaltensstörungen Potential kann als Lernen definiert werden, und die physikalischen Grundlagen dieser Potentiale als Gedächtnisspuren 1-4. Neurowissenschaftler versuchen zu verstehen, wie diese Prozesse im Hinblick auf die molekularen und neuronalen Veränderungen im Gehirn werden durch eine Vielzahl von Methoden im Modell Organismen von Insekten Wirbeltiere 5,6 organisiert. Für diese Bemühungen ist es hilfreich, Modellsysteme, die einfach und experimentell zugänglichen verwenden. Die Drosophila Larve hat sich diese Anforderungen auf Basis erfüllen sichdie Verfügbarkeit von robusten Verhaltens-Assays, die Existenz einer Vielzahl von transgenen Techniken und der elementaren Organisation des Nervensystems, die nur etwa 10.000 Neuronen (wenn auch mit einigen Zugeständnissen: kognitive Einschränkungen, nur wenige Handlungsoptionen, und den Reichtum der Erfahrungen fraglich) 7-10 . Drosophila-Larven bilden können Assoziationen zwischen Gerüchen und appetitive geschmackliche Verstärkung wie Zucker 11-14. In einem Standardtest, gegründet im Labor von B. Gerber, erhalten Tiere eine zwei-Geruch gegenseitige Ausbildung: Eine erste Gruppe von Larven zu einer Geruchs A zusammen mit einer geschmacklichen Verstärker (Zucker Belohnung) ausgesetzt und anschließend zu einem Geruch ausgesetzt B ohne Verstärkung 9. Unterdessen eine zweite Gruppe von Larven empfängt reziproken Ausbildung aber gleichzeitig mit Geruch A ohne Verstärkung und nachfolgend um Geruch B mit Verstärkung (Zucker Belohnung) ausgesetzt. In den folgenden beiden Gruppen sind tesTed für ihre Präferenz zwischen den beiden Gerüche. Relativ höhere Präferenzen für den belohnten Duft spiegelt assoziativen Lernens - präsentiert als Performance-Index (PI). Die Schlussfolgerung in Bezug auf die assoziative Natur des Performance-Index ist überzeugend, denn abgesehen von der Kontingenz zwischen Gerüche und Geschmacksstoffe auch andere Parameter, wie Geruch und Belohnung Belichtung Laufe der Zeit und Handhabung nicht zwischen den beiden Gruppen 9 unterscheiden.

1A zeigt einen Überblick über die experimentellen Verfahren für die Larven olfaktorischen assoziativen Lernens. Durch Koppeln eines der beiden vorgestellten Gerüche mit einem Zucker Belohnung Larven erfassen das Verhalten Potential, um ein attraktives Verhalten gegenüber dem belohnten Duft im Vergleich zum unbelohnt Geruch abzugeben. Zwei Gruppen von Larven sind immer entweder durch Paarung der Verstärker mit dem Geruch Oktober oder AM geschult. Die Leistung (PI) misst die assoziativen Funktion als Diff...

Drosophila-Larven sind in der Lage, um Geruch Reize mit geschmackliche Belohnung assoziieren. Hier beschreiben wir eine einfache Verhaltensänderungen Paradigma, das die Analyse von appetitive assoziative olfaktorische Lernen ermöglicht.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Im Folgenden beschreiben wir die methodischen Details des appetitiven assoziativen olfaktorischen Lernens bei Drosophila-Larven. Der Versuchsaufbau in Kombination mit ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist die Analyse höherer Hirnfunktionen. In einem einfachen Modell erfolgt dies an DFA-Larven mittels Appetit und assoziativem olfaktorischem Lernen. Dies wird erreicht, indem zunächst 30 sättigungsstarke Larven im dritten Larvenstadium aus einem Nahrungsröhrchen gesammelt werden.Anschließend werden die Larven fünf Minuten lang in einer Petrischale mit Fructose als Belohnung und je einem Geruchbehälter auf jeder Seite trainiert, wobei ein Octanol als olfaktorischer Stimulus dient. Danach erfolgt eine zweite Trainingsphase von fünf Minuten Dauer auf einer Schale ohne Fructose-Belohnung und mit Geruchbehältern auf beiden Seiten, die Amylacetat enthalten. Nach drei Wiederholungen der beiden Trainingsphasen werden die Larven einem fünfundzwanzigminütigen Test mit gegenüberliegenden Geruchbehältern ohne Belohnung ausgesetzt.Letztlich zeigt die relative Geruchspräferenz eines Octals gegenüber Amalacetat, dass Drosophila-Larven eine Assoziation zwischen olfaktorischen Reizen und einer zuckerbasierten Belohnung eingehen können, was zur Untersuchung assoziativen Lernens in einem genetisch modulierbaren System genutzt werden kann. Diese Methode in Kombination mit genetischer Störung der neuronalen Funktion kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Lernen und Gedächtnis zu beantworten, beispielsweise welche Neuronen das Belohnungssignal vermitteln oder welche Neuronen notwendig oder ausreichend für die Bildung beziehungsweise den Abruf eines wiederholten Gedächtnisses sind. Die Durchführung des Verfahrens wird Anti A Postop demonstrieren.Ein Doktorand aus meinem Labor stellt zunächst 2,5 % aros-Petri-Schalen ohne Fructose her. Um die Fructose-Schalen herzustellen, wird die Fructose dem gelösten aros zugegeben und anschließend die Mischung in die Schale gegossen. Danach wird jede dieser Schalen mit einem anderen Symbol gekennzeichnet, um den Experimentator zu blenden.Die mit Fructose versetzte Schale ist die belohnende Bedingung, und die unveränderte Schale ist die Nicht-Belohnung. Für die konditionierten Reize bereiten Sie insgesamt drei individuell angefertigte Teflon-Gefäße für Gerüche mit je 10 µL reiner One-Octal vor. Die Deckel weisen kleine Löcher auf, um die Verdunstung des Geruchs zu ermöglichen.Zweitens bereiten Sie drei weitere Duftgefäße mit je 10 Mikrolitern Amylacetat vor, die im Verhältnis 1:50 in Paraffinöl verdünnt sind. Diese Verdünnung ist ebenso attraktiv wie 10 Mikroliter reines Amylacetat. Beginnen Sie damit, 30 Tiere zu sammeln, zu füttern und sicherzustellen, dass sie nicht umherwandern. Drittens von einem Nahrungsgefäß entfernt.Dieses Protokoll kann zu jeder Tageszeit durchgeführt werden. Es ist unabhängig von circadianen Rhythmen. Überführen Sie die Lava in eine Petrischale, die einige Tropfen Leitungswasser enthält, und bewegen Sie sie vorsichtig mit einem Pinsel vorwärts und rückwärts.Überführen Sie dann die Larven in eine zweite Petrischale, die ebenfalls einige Tropfen Leitungswasser enthält. Untersuchen Sie die Larven auf Futterpaste an ihren Körperwänden. Stellen Sie nun die Petrischale in die Versuchsapparatur, um die Larven darin zu trainieren, Gerüche mit einer bestimmten Zuckerquelle zu assoziieren.Stellen Sie einen Duftbehälter auf die linke und rechte Seite einer der beiden Arten von Schalen, die für die Reize verwendet werden. Hier wird eine oktale verwendet, aber die Wahl ist beliebig, da der Versuchsleiter bezüglich der Belohnung geblendet ist. Danach platzieren Sie die Gruppe der Thi-Larven in die Mitte der Schale.Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten, während die Tiere den Stimuli ausgesetzt sind. Stellen Sie sicher, dass die Larven die Oberflächenspannung des Wassertropfens überwinden können, damit sie nicht eingeschlossen sind und sich frei bewegen können. Setzen Sie einen neuen Behälter mit Amalacetat auf eine frische Petrischale.Nach fünf Minuten verwenden Sie einen feuchten Pinsel, um die Larven auf eine andere Art von Schale zu übertragen, auf deren linker und rechter Seite sich jeweils der entgegengesetzte Reiz befindet. Der Geruch hier ist Amalacetat. Sobald die Larven übertragen wurden, schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Tiere fünf Minuten lang erkunden.Wenn diese Zeit abgelaufen ist, ist die erste Trainingseinheit abgeschlossen. Führen Sie zwei weitere Trainingseinheiten auf dieselbe Weise wie die erste durch. Überführen Sie die Tiere mit einem feuchten Pinsel und setzen Sie sie insgesamt dreimal jeder Kombination aus Reizen und Belohnungen aus.Platzieren Sie für den experimentellen Test frische Duftbehälter, jeweils einen von jedem Stimulus, an gegenüberliegenden Seiten einer unbeschichteten Agarose-Petri-Schale. Überführen Sie die trainierten Tiere in die Mitte der Schale. Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten.Nach fünf Minuten eine Schablone unter der Schale verwenden, die deutlich drei Zonen – links, rechts und eine Mitte – definiert, und die Anzahl der Larven in jeder Zone zählen. Die mittlere Zone gilt als Indikator für fehlende Präferenz und macht die Analyse strenger und weniger anfällig für Verzerrungen. Zum Abschluss des Experiments 30 neue, im dritten Larvenstadium befindliche Tiere auswählen und das Training sowie die Prüfung mit der umgekehrten Kombination aus Belohnung und Reizen wiederholen.Verwenden Sie weiterhin die gleichen Duftbehälter. Es sind mehrere Kontrolltests erforderlich, um zu bestimmen, ob transgene Tiere eine normale Geruchswahrnehmung für die Belohnungsreize aufweisen. Der Test zur naiven Geruchspräferenz beginnt mit dem Sammeln und Waschen von 30 Larven, wie bereits für Training und Test durchgeführt.Als Nächstes pipettieren Sie die Larven auf eine Agarose-Petri-Schale, auf deren einer Seite sich nur ein Stimulusgefäß befindet. Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten. Zählen Sie anschließend mithilfe der Vorlage die Anzahl der Larven auf der dem Stimulus zugewandten Seite, in der Mitte und auf der dem Stimulus abgewandten Seite der Schale.Führen Sie diesen Test für jeden im Experiment verwendeten Reiz durch, um die naive Zuckervorliebe zu überprüfen. Bereiten Sie halbe Petrischalen vor, indem Sie die Hälfte des Agars einer Petrischale ausschneiden und den freien Raum mit geschmolzenem Agar des anderen Typs auffüllen. Achten Sie darauf, dass beide Hälften im Volumen übereinstimmen und keine definierte Kante bilden.Dies erfordert möglicherweise etwas Übung mit der halben Petrischale, die vorbereitet und auf Raumtemperatur gebracht wurde und auf der 30 naive, gereinigte Futterorganismen platziert sind. Drittens Larven im Sterndesign in die Mitte der Schale geben. Den Deckel schließen und fünf Minuten warten.Anschließend mithilfe der Vorlage die Anzahl der Larven auf jeder Seite zählen und jene in der Mitte erfassen. Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um trenchgenische Lava zu trainieren und zu testen. Anhand der Beispielreize wurden die Daten als Anzahl der Larven in verschiedenen Bereichen der Petrischalen erfasst.Nach fünf Minuten außerhalb dieser Datenvorliebe wurden Indizes berechnet und Leistungsindizes aus den gegenseitig trainierten Gruppen abgeleitet. Da die getesteten Larven transgen waren, wurde zusätzlich eine Wahl zwischen einem gefüllten Duftbehälter und Luft sowie eine Wahl zwischen reinen Aros und Aros plus Zucker angeboten. Eine Untersuchung der berechneten Indizes in einem Boxplot zeigte, dass die Tiere lernen konnten, ein Octal von ML-Acetat mithilfe von Fructose-Aros als Appetitverstärker zu unterscheiden.Die Tiere erkannten beide Reize als Attraktanten und zeigten eine naive Präferenz für Fructose-Aros gegenüber Aero. Dieses experimentelle Paradigma wurde bereits erfolgreich mit einer Vielzahl olfaktorischer und visueller Reize sowie mit unterschiedlichsten belohnenden und bestrafenden Reizen angewandt. In Kombination mit den vielfältigen genetischen Manipulationsmöglichkeiten, die bei Drosophila zur Verfügung stehen, ist dieses Paradigma besonders nützlich zur Aufklärung neuronaler Netzwerke, beispielsweise indem spezifische Neuronengruppen genetisch verändert werden, die durch Gal4-Expressionsmuster definiert sind, um so die funktionelle Rolle dieser Neuronen beim Appetitlernen zu untersuchen.Mithilfe dieses Verfahrens in Kombination mit genetischer Störung der neuronalen Funktion kann die Analyse der neuronalen Netzwerke im Larvengehirn, die an Lernen und Gedächtnis beteiligt sind, bis auf Ebene einzelner Zellen durchgeführt werden.

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JoVE Journal

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Neurowissenschaften

In diesem Video-Beitrag beschreiben wir eine neue Methode erlaubt den Bau von Geruchsrezeptoren Gradienten mit stabilen und kontrollierbaren Geometrien. Wir haben kurz zeigen, wie diese Gradienten zu Bildschirm kann für olfaktorische Mängel (vollständiger oder teilweiser Anosmie) verwendet werden und auf subtilere Funktionen der Chemotaxis Verhalten zu studieren.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Die Methode, die erwachsenen Drosophila Assoziativspeicher messen beschrieben. Der Test basiert auf der Fähigkeit der Fliege, einen Geruch mit einem negativen Verstärker (elektrischer Schlag) vorgestellt verbinden und dann erinnern diese Informationen zu einem späteren Zeitpunkt, so dass Speicher gemessen werden kann.

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster.

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Wir präsentieren eine Choice-Test, um den Einfluss von Geruchsstoffen auf Drosophila Verhalten mit einem Y-Labyrinth-Test offenbaren.

Testen<em&gt; Drosophila</em&gt; Riechen mit einem Y-Labyrinth-Test

Wir beschreiben hier eine Verhaltensaufbau- und Datenanalysemethode zur Untersuchung der Geruchsreaktionen von bis zu 100 Essigfliegen (Drosophila melanogaster). Dieses System kann mit einzelnen oder mehreren olfaktorischen Reizen verwendet werden und kann für die optogenetische Aktivierung oder Stilllegung neuronaler Untergruppen angepasst werden.

Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking<em&gt; Drosophila</em&gt; In einem Vier-Quadranten-Olfaktometer

Geschmack ist ein wichtiger sensorischer Prozess, der die Anziehungskraft auf nützliche Substanzen und die Vermeidung von giftigen Substanzen erleichtert.  Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ingestion-Assay zur Bestimmung der gustatorischen Präferenz von Drosophila für eine gegebene chemische Verbindung.

Geschmackspräferenz Assay für Erwachsene<em&gt; Drosophila</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Drosophila Lern-und Gedächtnis-Assay namens Balz Konditionierung. Dieser klassische Assay basiert auf einer Verringerung des männlichen Balzverhaltens nach sexueller Ablehnung durch eine nicht-rezeptive vorbereitete Frau. Diese natürliche Form der Verhaltens-Plastizität kann verwendet werden, um Lernen, Kurzzeitgedächtnis und Langzeitgedächtnis zu testen.

Drosophila Courtship Conditioning Als Maß für Lernen und Gedächtnis

Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

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Ein wesentliches Hindernis für die Untersuchung der zellulären Aktivität während kognitiver Prozesse wie Lernen und Gedächtnis ist die Verwendung von Anästhetika für die Vorbereitung von In-vivo-Bildgebung . Die Anästhesie beeinträchtigt das Kurzzeitgedächtnis und die Kognition in mehreren Modellen, einschließlich Drosophila. Diese Studie stellt eine einzigartige Methode zur Vorbereitung adulter Drosophila für die In-vivo-Bildgebung ohne Anästhesie vor.

Im lebenden Organismus Bildgebung der neuronalen Aktivität in nicht anästhesierten erwachsenen Drosophila-Fliegen

Lernen Sie appetitives assoziatives olfaktorisches Lernen in Drosophila-Larven mit Fructose-Belohnung und Geruchstest. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Grundlagen von Lernen und Gedächtnis.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in

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