Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in Drosophila Larven

Das Ziel dieses Verfahrens ist die Analyse höherer Gehirnfunktionen. In einem einfachen Modell erfolgt dies an DFA-Larven mittels Appetit und assoziativem olfaktorischem Lernen. Dazu werden zunächst 30 sättigungsstarke Larven im dritten Larvenstadium aus einem Nährstoffgefäß gesammelt.

Anschließend werden die Larven fünf Minuten lang in einer Petrischale mit Fructose als Belohnung trainiert, wobei sich auf jeder Seite ein Duftbehälter befindet, der ein Octanol als olfaktorischen Reiz enthält. Danach folgt eine zweite Trainingsphase von fünf Minuten Dauer auf einer Schale ohne Fructose-Belohnung, mit Duftbehältern auf jeder Seite, die Amylacetat enthalten. Nach drei Wiederholungen der beiden Trainingsphasen werden die Larven in einem fünfminütigen Test ohne Belohnung Duftbehältern auf gegenüberliegenden Seiten ausgesetzt.

Der relative Geruchspräferenzgrad eines Octals gegenüber Amalacetat zeigt letztendlich, dass Drosophila-Larven eine Assoziation zwischen olfaktorischen Reizen und einer zuckerhaltigen Belohnung eingehen können, und dies kann genutzt werden, um assoziatives Lernen in einem genetisch modulierbaren System zu untersuchen. Diese Methode in Kombination mit genetischer Störung der neuronalen Funktion kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Lernen und Gedächtnis zu beantworten, beispielsweise welche Neuronen das Belohnungssignal übertragen oder welche Neuronen notwendig oder ausreichend sind, um eine wiederholte Erinnerung zu erwerben oder abzurufen. Die Durchführung des Verfahrens wird anti a postop demonstrieren.

Eine Doktorandin aus meinem Labor stellt zuerst 2,5 % Aros-Petri-Schalen ohne Fructose her. Um die Fructose-Schalen vorzubereiten, wird die Fructose zu dem gelösten Aros gegeben und anschließend in die Schale gegossen. Danach wird jede dieser Schalen mit einem anderen Symbol gekennzeichnet, um den Versuchsleiter zu blenden.

Die mit Fructose gefüllte Schale ist die belohnende Bedingung, und die leere Schale ist die Nicht-Belohnung. Für die konditionierten Reize bereiten Sie insgesamt drei maßgeschneiderte Teflon-Behälter für Gerüche mit je 10 Mikrolitern reinem One-Octal vor. Die Deckel weisen kleine Löcher auf, um die Verdunstung des Geruchs zu ermöglichen.

Zweitens bereiten Sie drei weitere Duftgefäße mit je 10 µL Amylacetat vor, das im Verhältnis 1:50 in Paraffinöl verdünnt wurde. Diese Verdünnung ist genauso attraktiv wie 10 µL reines Amylacetat. Beginnen Sie damit, 30 Tiere einzusammeln, die fressen und nicht umherwandern. Drittens aus einem Futtergefäß.

Dieses Protokoll kann zu jeder Tageszeit durchgeführt werden. Es ist unabhängig von circadianen Rhythmen. Überführen Sie die Lava in eine Petrischale, die einige Tropfen Leitungswasser enthält, und bewegen Sie sie vorsichtig mit einem Pinsel vor und zurück.

Überführen Sie dann die Larven in eine zweite Petrischale, die ebenfalls einige Tropfen Leitungswasser enthält. Untersuchen Sie die Larven auf Futterpaste an ihren Körperwänden. Stellen Sie nun die Petrischale in die Versuchsapparatur, um die Larven darin zu trainieren, Gerüche mit einer bestimmten Zuckerquelle zu assoziieren.

Platzieren Sie einen Duftbehälter auf die linke und rechte Seite einer der beiden Arten von Schalen, die für die Stimuli verwendet werden. Hier wird eine oktale Schale verwendet, aber die Wahl ist beliebig, da der Experimentator bezüglich der Belohnung geblendet ist. Danach platzieren Sie die Gruppe der Thi-Larven in die Mitte der Schale.

Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten, während die Tiere den Reizen ausgesetzt sind. Stellen Sie sicher, dass die Larven die Oberflächenspannung des Wassertropfens überwinden können, damit sie nicht eingeschlossen sind und sich frei bewegen können. Stellen Sie einen neuen Behälter mit Amalacetat auf eine frische Petrischale.

Nach fünf Minuten verwenden Sie eine feuchte Bürste, um die Larven in eine andere Art von Schale zu überführen, wobei sich die gegensätzlichen Reize auf der linken und rechten Seite befinden. Der Geruch hier ist Amylacetat. Sobald die Larven übertragen wurden, schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Tiere fünf Minuten lang erkunden.

Wenn diese Zeit abgelaufen ist, wurde die erste Trainingseinheit abgeschlossen. Führen Sie zwei weitere Trainingseinheiten auf dieselbe Weise wie die erste durch, indem Sie die Tiere mit einem feuchten Pinsel übertragen und sie insgesamt dreimal jeder Kombination aus Reizen und Belohnungen aussetzen.

Platzieren Sie für den experimentellen Test frische Duftbehälter, jeweils einen pro Stimulus, an gegenüberliegenden Seiten einer unbeschichteten Agarose-Petrischale. Überführen Sie die trainierten Tiere in die Mitte der Schale. Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten.

Nach fünf Minuten verwenden Sie eine Schablone unter der Petrischale, die deutlich drei Zonen der Schale definiert: links, rechts und die Mitte; zählen Sie die Anzahl der Larven in jeder Zone. Die mittlere Zone gilt als keine Präferenz und macht die Analyse strenger und weniger anfällig für Bias. Schließlich wählen Sie zur Beendigung des Experiments 30 neue, im dritten Larvenstadium befindliche, fütterungsaktive Larven aus und wiederholen Sie das Training und die Testung mit der umgekehrten Kombination aus Belohnung und Reizen.

Verwenden Sie weiterhin die gleichen Duftbehälter. Es sind mehrere Kontrolltests erforderlich, um zu bestimmen, ob transgene Tiere eine normale Geruchswahrnehmung für die Belohnungsreize aufweisen. Der Test zur naiven Geruchspräferenz beginnt mit dem Sammeln und Waschen von 30 Larven, wie bereits für Training und Test durchgeführt.

Als Nächstes pipettieren Sie die Larven auf eine Agarose-Petri-Schale mit nur einem Stimulusgefäß auf einer Seite. Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten. Zählen Sie anschließend mithilfe der Vorlage die Anzahl der Larven auf der dem Stimulus nahen Seite, in der Mitte und auf der dem Stimulus gegenüberliegenden Seite der Schale.

Führen Sie diesen Test für jeden im Experiment verwendeten Reiz durch, um die naive Zuckervorliebe zu überprüfen. Bereiten Sie halbe Petrischalen vor, indem Sie die Hälfte des Agars einer Kordelplatte herausschneiden und den freien Raum mit geschmolzenem Agar des anderen Typs auffüllen. Achten Sie darauf, dass beide Hälften im Volumen übereinstimmen und keine definierte Kante bilden.

Dies erfordert möglicherweise etwas Übung mit der halben Petrischale, die vorbereitet und auf Raumtemperatur gebracht wurde und auf der 30 naive, gereinigte Futterorganismen platziert sind. Drittens Larven im Sterneustadium in die Mitte der Schale geben. Den Deckel schließen und fünf Minuten warten.

Anschließend mithilfe der Vorlage die Anzahl der Larven auf jeder Seite zählen und jene in der Mitte erfassen. Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um trenchgenische Larven zu trainieren und zu testen. Anhand der Beispielreize wurden die Daten als Anzahl der Larven in verschiedenen Bereichen der Petrischalen erfasst.

Nach fünf Minuten außerhalb dieser Datenvorgabe wurden Indizes berechnet und Leistungsindizes aus den wechselseitig trainierten Gruppen abgeleitet. Da die getesteten Larven transgen waren, wurde zusätzlich eine Wahl zwischen einem gefüllten Duftbehälter und Luft sowie eine Wahl zwischen reinen Aros und Aros plus Zucker angeboten. Eine Untersuchung der berechneten Indizes im Boxplot ergab, dass die Tiere lernen konnten, ein Octal von ML-Acetat mithilfe von Fructose-Aros als Appetitverstärker zu unterscheiden.

Die Tiere erkannten beide Reize als Attraktanten und zeigten eine naive Präferenz für Fructose-Aros gegenüber Aero. Dieses experimentelle Paradigma wurde bereits erfolgreich mit einer Vielzahl olfaktorischer und visueller Reize sowie mit unterschiedlichsten belohnenden und bestrafenden Reizen angewandt. In Kombination mit den vielfältigen genetischen Manipulationsmöglichkeiten, die bei Drosophila zur Verfügung stehen, ist dieses Paradigma besonders nützlich zur Aufklärung neuronaler Netzwerke, beispielsweise indem spezifische Neuronengruppen genetisch verändert werden, die durch Gal4-Expressionsmuster definiert sind, um so die funktionelle Rolle dieser Neuronen beim Appetitlernen zu untersuchen.

Mithilfe dieses Verfahrens in Kombination mit genetischer Störung der neuronalen Funktion kann man die an Lernen und Gedächtnis beteiligten neuronalen Netzwerke des Larvengehirns analysieren. Aufgrund der Einfachheit des Larvengehirns ist dies bis auf Ebene einzelner Zellen möglich.