Name: Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie die heterologe Biosynthese von Erythromycin A in E. coli durch genetischen Transfer und Pathway-Rekonstruktion. Diese Methode ermöglicht die effiziente Produktion komplexer Antibiotika in einem wirtorganismus.

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Die Autoren danken den NIH (AI074224 und GM085323) und NSF (0.712.019 und 0.924.699) für die Finanzierung von Projekten gewidmet heterologen Biosynthese zu unterstützen.

Der Text ist spezifisch für das Antibiotikum Erythromycin A, aber die Schritte ausgebildet sind allgemein anwendbar auf andere natürliche Produkte als Kandidaten für heterologe Biosynthese. Ein. Erythromycin A Genetic Cluster Übertragung <ol><li> PCR-Primer-Design zu amplifizieren alle Gene mit dem Erythromycin A Cluster innerhalb des zugeordneten S. erythraea Chromosom. Dieser Schritt ist speziell auf diese Naturprodukt Kandidaten, deren genetische Sequenzen bestimmt wurden. Alternativ können die gewünschten Gene synthetisiert (durch mehrere kommerzielle Herstelleroptionen) mit dem Vorteil, dass die neu synthetisierte Gene für optimalen Codonverwendung würde innerhalb der neuen E. ausgebildet sein -coli-Wirt. Wenn die DNA-Synthese verfolgt wird, wird ein Strom Herausforderung Erzeugen megasynthase Gene, die 10 kb in der Länge überschreiten darf. Technisch kann Synthese bewerkstelligt werden, aber es ist schwierig und kostspielig. Es wird erwartet, dass kontinuierliche improvemEltern in Gensynthese-Technologie wird sich aktuellen Nachteile und weiter zu validieren diesen Ansatz für die Bereitstellung von heterologen genetischen Materials. </li><li> Führen Sie die PCR mit frisch zubereiteten S. erythraea genomische DNA als Matrize. Die chromosomale DNA kann aus Kulturen von S. hergestellt werden erythraea oder aus gefrorenen Beständen des Bakteriums (Abbildung 3) 25. PCR-Reaktionen können von der Zugabe von DMSO (4 pl in 50 ul Reaktionen) zur Berücksichtigung hohen G+ C-Gehalt im Target profitieren S. erythraea Gene. Jede amplifizierte Gen sollte sequenziert, um zu bestätigen, dass die vollständige Gen abgerufen wurde und dass keine Mutationen in den PCR-Prozess eingeführt werden. </li><li> Durch Restriktionsverdau und Ligation, legen jedes der isolierten Gene in Expressionsvektoren für E. konzipiert coli (Abbildung 3). Dies wird durch die Gestaltung Restriktionsstellen innerhalb der PCR-Primer, um die Verdauung und Ligation in geeignete Ex erlauben initiiertpression Vektoren (ein Beispiel ist in Abbildung 3 wurde im Lieferumfang enthalten). Wir haben sowohl pET21 und pET28 Vektoren verwendet. Die pET28 Vektor erlaubt die Einbeziehung eines 5&#39;-Leader-Sequenz, die Genexpression in dem Fall Erythromycin A unterstützt. Bestätigen einzelnen Genexpression durch RT-PCR, SDS-PAGE-Analyse (unter Verwendung von löslichen Proteinfraktionen) oder bequemer phänotypischen Assays (Abbildung 4). </li><li> Konstruieren Operons auf Gene erfolgreich von einzelnen Expressionsplasmide (Abbildung 3) ausgedrückt. Wir haben traditionell Kombinationen kompatible kohäsive-Restriktionsenzymen (z. B. Xba I und Spe I) 24 verwendet, um sequentiell umzuwandeln Gene Operons, jedoch werden die Restriktionsschnittstellen für Operon Konstruktion gewählt darf innerhalb befinden (oder müssen aus entfernt werden) das isolierte Gensequenzen (ein Problem, das vermieden werden, wenn Gen-Synthese verwendet werden kann). Dieser Schritt festigt die 20 Erythromycin A Gene vor der E. coli traformationen. Derzeit haben wir diese Methode verwendet, um bis zu 20 kb fremder DNA in einem Standard-pET-Vektor (zwei Gene von ~ 10 kb jeweils). Darüber hinaus haben wir diesen Ansatz verwendet, um Operons enthält neun Gene zu erzeugen. Es ist nicht bekannt, wie viel oder wie viele DNA Gene können in pET-Typ Plasmide zu integrieren, wobei jedoch die oben genannten Metriken eine Referenz für komplizierte Systeme wie das Erythromycin Biosyntheseweg bereitzustellen. Schließlich Standard-in vitro-Ligation Schritte und anschließende erfolgreiche Transformation Schritte zunehmend schwieriger als Operon und Plasmid Größe zunimmt. Ligation Temperatur (12-22 ° C) und die Zeit (3-24 Stunden) sind vielfältig und elektro-Transformation wird verwendet, um den Prozess der Herstellung der fertigen Plasmidkonstrukte unterstützen. </li><li> Verwandeln Sie die neu gestaltete biosynthetischen Plasmide in E. coli-Stamm BAP1 mit elektro-Transformation (Abbildung 5). Das Verfahren kann mit Plasmiden eingeführt versucht werden entweder nacheinander oder in Zusammenarbeitmbination. Bei der Umwandlung size-Lage oder zahlreiche Plasmide, haben wir traditionell elektro-Transformation (im Gegensatz zu chemischen Umwandlung Gegensatz) verwendet. Sobald transformiert, Platte die Zellen auf festem LB-Medium mit Tetrazyklin (5 mg / l), Carbenicillin (100 mg / l), Kanamycin (50 mg / l), Streptomycin (50 mg / l) und Apramycin (50 mg / l ) für Plasmids wählen. Es ist höchst ungewöhnlich, dass sechs verschiedene Selektionsantibiotika post-Transformation eines E. verwenden coli-Zelle, aber dies einfach gibt die Gesamtzahl von Plasmiden erforderlich, damit endgültige Erythromycin A-Biosynthese. Während möglich ist, wird der Ansatz begrenzen die Produktionsmöglichkeiten der Verbindung einmal Kultivierung begonnen hat (siehe unten). </li></ol> 2. E. coli Biosynthetische Rekonstitution <ol><li> Belastung BAP1 wurde entwickelt, um die erforderlichen Substrate für die Biosynthese geben und posttranslational modifizieren Desoxyerythronolid B megasynthase. Einzelne Gene des Erythromycin Ein Weg haben für die Genexpression getestet und konsolidiert Operons in Expressionsplasmide. Dieser Abschnitt ist Kulturbedingungen für konzertierte Aktionen der vollen Erythromycin Ein Weg testen gewidmet. </li><li> Take 3 separaten Kolonien des frisch transformierten BAP1 und 1,5 ml LB beimpft Kulturen, das die erforderlichen Antibiotika Plasmidselektion (bei den gleichen oben angegebenen Konzentrationen, um auf Transformanten auf festem Medium auszuwählen), Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG; 100 uM ) und Arabinose (2 mg / ml), um die Genexpression und 20 mM Natriumpropionat um intrazelluläre Biosynthesevorstufe Bildung unterstützt induzieren. Sobald die Produktion bestätigt wurde, können größere Kulturen in einem Versuch zu skalieren und zu maximieren Produkt Titer durchgeführt werden. </li><li> Kultur der Zellen bei 22 ° C und 250 rpm für 24-48 Std. In diesem Fall sorgt Antibiotikaselektion dass die erforderlichen Plasmide in den frühen Stadien der Zellkultur gehalten werden. Jedoch Plasmidss kann leicht verloren werden Selektionsantibiotikum Ebenen im Laufe der Anzucht ändern. Dies kann zu Plasmidinstabilität (dh, der Verlust von einem oder mehreren Plasmiden während der Kultivierung), die dann begrenzen würde Produktionskapazität führen. Das Problem wird verschlimmert, wenn inkompatible Plasmide verwendet werden, um eine vollständige heterologe Gencluster einzuführen. Dies ist der Fall für die Erythromycin A Verbindung (Abbildung 5) und müssten beseitigt werden, um wirklich Überproduktion der Verbindung aus E. coli. Für die Zwecke der Demonstration anfänglichen Produktion werden solche Konstruktionsfehler Gründen der zügig Gründung der Durchführbarkeit des heterologen Ansatz toleriert. </li><li> Klärung der Kulturen durch Zentrifugation bei 10.000 rpm in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und bei 4 ° C für die Analyse. </li><li> Im Fall von Erythromycin A, fehlende Verbindung Produktion wurde durch den Einschluss des GroES / EL Chaperonin (unter Verwendung pGro7 gerichtetspeziell ansprechen mangelnde Aktivität der Enzyme post-Expression) und die Aufnahme zusätzlicher Genkopien (für jene Gene schwache Expression / Aktivität vermutet). Ähnliche Strategien können mit anderen heterologen Naturprodukt Produktion Anstrengungen erforderlich werden. </li></ol> 3. Product Analysis <ol><li> Um zu bestätigen und zu quantifizieren Erythromycin A Formation, Injektion des Kulturüberstandes auf einem LC-MS-Systems (Abb. 6). Kommerziell erhältliche Erythromycin A wurde verwendet, um die Produktion zu bestätigen und als ein Standard bei der Quantifizierung. Für die Fälle, ohne kommerziell verfügbaren Standards würde LC-MS-Analyse erfordern zusätzliche chemische Charakterisierung durch NMR-und hochauflösender Massenspektrometrie. </li><li> Vergleichen Produktion zwischen den 3 Kolonien / Kulturen aus dem BAP1 Transformation. Wählen Sie die höchste Produzent und bereiten eine Glycerin Lager aus der Kolonie Quelle. Dieser Schritt kann gleichzeitig mit den Produktionskulturen Abschnitt des Protokolls erfolgen2 durch Verwendung eines kleinen Teils der Kulturen, um Glycerinstammkulturen vorzubereiten. Bewahren Sie das Glycerin Lager in einem -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Mit der Bestätigung höchsten produzierenden Zelle Lager, beginnt eine getrennte Produktion Kultur und extrahieren die endgültige Überstand mit 2x Volumen Ethylacetat. Verwenden Sie einen Staubsauger Verdunstungskontrollsystem um den Extrakt trocknen und resuspendieren in 100 ul Methanol. Übertragen des Extrakts auf einen Sterilfilter Scheibe (~ 1/4 Zoll Durchmesser) und damit die Scheibe zu trocknen. Separat, Kultur B. subtillis in LB Flüssigkeit über Nacht. Fügen Sie 20 ul der B. subtilis Kultur zu je 20 ml LB-Agar bei 45 ° C. Platte der Agar und lassen sich zu verfestigen. Setzen Sie den Filter Scheibe auf der Platte und bei 37 ° C (Abbildung 7). Alternativ kann der Extrakt die Flüssigkulturen in einer 96-Well-Platte zugesetzt werden, um die Aktivität unter Verwendung eines Plattenlesegeräts (Abbildung 7) zu quantifizieren. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

2) biosynthetischen Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse 1) Gentransfer: Critical Schritte in heterologen Biosynthese sind an jedem der drei Verfahrenssprachen Punkten im Prozess auftreten. Ein Problem in jedem Stadium wird entgleisen das ultimative Ziel der Schaffung heterologen Biosynthese. Vielleicht das schwierigste Aspekt des Verfahrens wird zur Festlegung rekonstituierten Biosynthese, da dies absolut notwendig ist, um erfolgreiche Analyse zu ermöglichen. Jedoch ist die Rekonstitution abhängig sorgfältige Planung...

Erythromycin A ist ein Antibiotikum Polyketid durch die Gram-positive Bodenbakterium Saccharopolyspora erythraea produziert und die laufende Produktion wurde schrittweise auf ~ 10 g / L durch jahrzehntelange traditionellen Mutagenese und Screening-Protokolle und neuerdings durch Prozessoptimierung Systeme 1-6 verbessert. Mutagenese und Screening-Strategien sind in antibiotischen Naturstoffen Produktentwicklung gemeinsame als Folge der Schwierigkeiten bei der Kultivierung und / oder genetisch manipuliert einheimische Produktion Hosts und wegen der leicht verfügbar antibiotische Aktivität oder verbesserte Wachstumsphänotypen zur Auswahl zu helfen. Im Fall von Erythromycin A, S. erythraea wird durch ein langsames Wachstum Profil und das Fehlen von mehr direkte genetische Manipulationsverfahren (bezogen auf Organismen wie E. coli) begrenzt somit behindern rasche Verbesserung der Produktionseffizienz und der Biosynthese von neuen Derivaten. Nachdem erkannte die Fragen der Produktion und entriegelt diversificatiüber die Möglichkeiten mit Verbindungen wie Erythromycin A, begann die Forschung, um die Idee von heterologen Biosynthese (Abbildung 1) 7 verfolgen. Diese Bemühungen fiel mit verfügbaren Sequenz für das Erythromycin A-Gencluster 8-11. Es sollte betont werden, dass die Zahl der sequenzierten komplexen Naturstoff Gencluster hat stark 12-16 erweitert werden und bietet den Anstoß für weitere Anstrengungen in heterologen Biosynthese kodiert medizinisches Potenzial zugreifen. Um dies zu tun, erfordert heterologen Rekonstitution, dass die neuen Host die Bedürfnisse der spezifischen Biosyntheseweg zu erfüllen. E. coli bietet technischen Komfort, eine breite umspannenden Reihe von Techniken der Molekularbiologie und Stoffwechsel-und Prozess-Engineering-Strategien für die Produktentwicklung. Doch wenn die einheimische Produktion Gastgeber, E. Vergleich coli zeigt nicht das gleiche Maß an komplexen Naturstoff Produktion. Es war daher nicht bekannt, ob E. coli konnte als eine tragfähige heterologen Option für komplexe Naturstoff-Biosynthese dienen. Es wurde jedoch angenommen, dass E. coli wäre eine ideale Wirtsorganismus sein, wenn heterologe Biosynthese erreicht werden könnte. Mit diesem Ziel im Hinterkopf, begann anfänglichen Bemühungen um die Polyketid-Aglykon 6-Desoxyerythronolid B (6dEB) durch E. produzieren coli. Allerdings, native E. coli Stoffwechsel konnten keine nennenswerte Ebenen der Propionyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA benötigt, um Vorstufen 6dEB Biosynthese unterstützt noch konnte der neue Host posttranslational modifizieren Desoxyerythronolid-B-Synthase (DEBS) Enzyme. Um diese Probleme zu beheben, wurde ein Stoffwechselweg von nativen und heterologen Enzymen bestehen, in E. gebaut coli, so dass exogen zugeführten propionat intrazellulär wurde zu Propionyl-CoA überführt und anschließend (2S)-Methylmalonyl-CoA; im Engineering, um dieses Weges zu vervollständigen, wurde ein Gen in sfp th platzierte Chromosom von E. coli BL21 (DE3), um einen neuen Stamm zu produzieren genannt BAP1. Die Sfp Enzym ist ein Phosphopantetheinyl Transferase Lage der Befestigung der 4&#39;-Phosphopantethein Cofaktor den DEBS Enzyme 17,18. Die drei DEBS Gene (jeweils ~ 10 kb) wurden dann auf zwei separat wählbar Expressionsvektoren, induzierbare T7 Promotoren gestellt. Nach einer Einstellung des Schlüssels nach Induktion Temperatur (bis 22 ° C) wurden die DEBS Gene koordinativ innerhalb BAP1 in einem aktiven Zustand erzeugen kann 6dEB 19 exprimiert. Das Streben nach voller Erythromycin A-Biosynthese begann dann mit einem analogen Gencluster aus Micromonospora megalomicea oder ein hybrides Weg der Gene von S. zusammen erythraea, S. fradiae und S. venezuelae die Zwischenprodukte Erythromycin C und 6-deoxyerythromycin D, jeweils 20-22 produziert. Kürzlich hat unsere Fraktion diese Bemühungen durch die Herstellung erythrom verlängertycin A (die meisten klinisch relevanten Form von Erythromycin) durch E. coli. Im Gegensatz zu früheren Arbeiten, unsere Strategie koordiniert äußerte die 20 original S. erythraea Gene für Polyketidbiosynthese, Desoxyzucker-Biosynthese und Befestigung, zusätzliche Anpassung und Selbst-Widerstand (Abbildung 2) benötigt. Insgesamt wurden 26 (native und heterolog) Gene entwickelt, damit E. coli zu Erythromycin A mit 4 mg / l 23,24 erzeugen. Dieses Ergebnis gegründet komplette Produktion eines komplexen Polyketid natürliches Produkt mit E. coli und dient als Grundlage zu nutzen, diese neue Produktion Option oder verfolgen neue.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> PCR-Maschine </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler personal </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Fischer </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Fischer </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpropionat </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-Arabinose </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Gekühlte Shaker </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> Zentrifuge 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Chaperone Plasmid Set (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, pCDF-Duet-1 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Ethylacetat </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> Concentrator 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Rotationsverdampfer </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

die logik, experimental steps, und potenziale heterologe naturstoffbiosynthese ausgestattet mit dem complex antibiotikum erythromycin a through produziert<em&gt; e. coli</em

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Die heterologe Produktion von komplexen Naturstoffen ist ein Ansatz entwickelt, um die jeweiligen Einschränkungen und zukünftigen Möglichkeiten anzugehen. Es ist besonders nützlich für solche Verbindungen, welche therapeutischen Wert besitzen, kann aber nicht ausreichend hergestellt waren oder aus einer verbesserten Form der Produktion profitieren. , 2) heterologe Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse 1) Gentransfer: Die experimentellen Verfahren beteiligt kann in drei Komponenten unterteilt werden. Jede experimentelle Komponente ist unter ständige Optimierung, um die Herausforderungen zu meistern und antizipieren die Chancen, die mit diesem neuen Ansatz verbunden. Heterologen Biosynthese beginnt mit der Identifikation einer genetischen Sequenz, die für wertvolle Naturprodukt. Übertragen dieser Sequenz mit einer heterologen Host wird durch den Biosyntheseweg Komplexität verantwortlich für die Produktentwicklung Bildung kompliziert. Das Antibiotikum Erythromycin A ist ein gutes Beispiel. Zwanzig Gene (in Höhe von&gt; 50 kb) sind für eventuelle Biosynthese erforderlich. Zusätzlich codieren drei dieser Gene Megasynthasen, Multi-Domain Enzyme jeweils ~ 300 kDa groß. Dieses genetische Material müssen so ausgelegt und übertragen werden E. coli für rekonstituierte Biosynthese. Die Verwendung der PCR Isolierung, Konstruktion Operon, Multi-cystronic Plasmiden und elektrooptischen Umwandlung wird bei der Übertragung der Erythromycin A bis E. genetischen Cluster beschrieben coli. Einmal übertragen, das E. coli Zelle muss unterstützt eventuelle Biosynthese. Dieser Prozess wird auch gegen die wesentlichen Unterschiede zwischen E. gegeben coli und originellsten Hosts verantwortlich komplexen Naturstoff Bildung. Die Zelle muss erforderlichen Substrate, um die Biosynthese unterstützen und koordinativ Ausdruck der übertragenen genetischen Cluster aktive Enzyme zu produzieren. Im Fall von Erythromycin A, das E. coli-Zelle musste entwickelt, um die beiden Vorstufen (pr liefernopionyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA) für die Biosynthese erforderlich. Zusätzlich wurden Gensequenz Modifikationen Plasmidkopienzahl, Chaperonin Koexpression, posttranslationale enzymatische Modifikation und Prozesstemperatur auch erforderlich, damit endgültige Erythromycin A Formation. Schließlich muss eine erfolgreiche Produktion beurteilt werden. Für die Erythromycin Ein Fall, präsentieren wir zwei Methoden. Die erste ist Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), um zu bestätigen und zu quantifizieren Produktion. Die Bioaktivität von Erythromycin A wird auch durch die Verwendung eines Bioassays, in dem der antibiotische Aktivität gegen Bacillus subtilis getestet wird bestätigt werden. Die Bewertungskriterien Assays etablieren Erythromycin A-Biosynthese aus E. coli und die Bühne für die zukünftige technische Anstrengungen zur Verbesserung oder Diversifizierung der Produktion und für die Herstellung neuer, komplexer Naturstoffe mit diesem Ansatz.

Das gewünschte Ergebnis dieses Ansatzes ist die Produktion eines vollständig bioaktiven Naturprodukt aus dem E. coli heterologe Wirt. Dies wird am besten durch die LC-MS-Ergebnisse verwendet, um zu bestätigen und zu quantifizieren Produktion (Abbildung 6) und die antibakterielle Bioassay zur endgültigen Aktivität zu bestätigen (Abbildung 7) dargestellt. In die allgemeine Systematik der heterologen Biosynthese, legt dieses Ergebnis Erfolg. Einmal erreicht, Forschungsanstrengunge...

Das heterologe Biosynthese von Erythromycin A durch<em&gt; E. coli</em&gt; Enthält die folgenden experimentellen Schritte: 1) Übertragung genetischer Information, 2) heterologe Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse. Jeder Schritt wird im Rahmen der Motivation, Potential und Herausforderungen bei der Herstellung von therapeutischen Naturprodukten mittels erläutert<em&gt; E. coli</em&gt; Als Surrogat-Host.

Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert<em&gt; E. coli</em

Die heterologe Produktion komplexer Naturstoffe ist ein Ansatz, der darauf abzielt, aktuelle Einschränkungen und zukünftige Möglichkeiten zu adressieren. Es ist ...

Heterologe Biosynthese ist eine Methode, bei der ein biosynthetischer Weg eines Organismus durch koordinierte Expression von Genen in einen anderen Wirtsorganismus übertragen wird. In diesem Experiment wird der biosynthetische Weg für Erythromycin A in ein E. coli-Wirtssystem übertragen, um letztendlich große Mengen dieses Antibiotikums herzustellen. Zunächst wird der für die Erythromycinbildung verantwortliche Gencluster aus dem ursprünglichen bakteriellen Wirt isoliert.Das fremde genetische Material wird dann im Opera-Format neu gestaltet, um die koordinierte Expression des vollständigen enzymatischen Weges in E. coli zu ermöglichen. Während der E. coli-Stamm, der den heterologen Erythromycin-Weg trägt, sich in der Kultur vermehrt, wird die endgültige Erythromycin-Verbindung produziert. Die antibiotische Wirkung der Verbindung kann anschließend mithilfe eines funktionellen Bacillus-solus-Assays getestet werden, im Gegensatz zur Herstellung komplexer Naturstoffe durch ihre ursprünglichen Organismen.Die heterologe Biosynthese mittels E. coli bietet die Möglichkeit einer schnellen Prozessentwicklung und großes Engineering-Potenzial. Diese Idee entstand vor etwa 10 bis 15 Jahren, doch erst kürzlich, dank verschiedener technischer Durchbrüche und Verbesserungen unserer Technologie, konnten erste Erfolgsgeschichten bei der komplexen Herstellung natürlicher Produkte mit E. coli verzeichnet werden. Entwerfen und bestellen Sie zunächst PCR-Primer, um alle Gene zu amplifizieren, die mit dem Cluster im Chromosom assoziiert sind. Verwenden Sie für die Polymerase-Kettenreaktion frisch präparierte genomische DNA als Vorlage.Wenn die Zielgene einen hohen GC-Gehalt aufweisen, wie zum Beispiel der Erythromycin-A-Cluster in S. erythri, geben Sie vier µL DMSO in eine 50-µL-Reaktion hinzu. Bestätigen Sie die Identität der PCR-Produkte durch Sequenzierung. Klonieren Sie anschließend die PCR-Genprodukte in ein E. coli-Expressionssystem. Während cin verwendeten wir das Muster acht als Expressionsvektor für bestimmte Gene, da die Aufnahme einer terminalen Leitersequenz eine Überexpression des Proteins bewirkte.Als Nächstes bestätigen Sie die Expression einer funktionalen Proteinpräparation. Konstruieren Sie unter Verwendung der R-T-P-C-R-S-D-S-Seitenanalyse oder geeigneter phänotypischer Assays Operons basierend auf Genen, die erfolgreich aus einzelnen Expressionsplasmiden exprimiert wurden. Gestalten Sie, falls möglich, Kombinationen kompatibler kohäsiver Restriktionsenzyme, um Gene schrittweise in tos umzuwandeln.Während des Prozesses der offenen Konstruktionen müssen wir sicherstellen, dass das verwendete Restriktionsenzym die individuelle Sequenz nicht schneidet. Falls dies der Fall ist, muss die Gensynthese in Betracht gezogen werden, um die 20 Erythromycin-A-Gene in Expressionsplasmide zu klonieren. Dabei sind die in der begleitenden Publikation detaillierten Faktoren zu berücksichtigen.Transformieren Sie nun den E. coli-Stamm BAP1 mit den neu entworfenen biosynthetischen Plasmiden entweder sequenziell oder in Kombination, und platzieren Sie die Zellen auf festem LB-Medium, das eine Kombination von Antibiotika enthält, um die Plasmid-Erhaltung auszuwählen. Es ist äußerst ungewöhnlich, dass wir sechs verschiedene antibiotische Selektionen für E. coli-Transformationen verwenden, doch dies liegt einfach daran, dass wir sechs Plasmide für die vollständige Synthese von Erythromycin A in E. coli benötigen. Dieser Abschnitt legt die Kulturbedingungen für die koordinierte Aktivität des gesamten Erythromycin-A-Synthesewegs fest.Gen BP eins wurde entwickelt, um das für die cin-Biosynthese benötigte Substrat bereitzustellen und die IDE-Mega-Synthese posttranslational zu modifizieren. Pflücke einzelne Kolonien der frisch transformierten BAP eins und impfiere drei 1,5-Milliliter-Kulturen in Alb-Medien, die das erforderliche Plasmidselektionsantibiotikum enthalten. Zusätzlich 100 Mikromolar IPTG, zwei Milligramm pro Milliliter Arabinose zur Induktion der Genexpression und 20 Millimolar Natriumpropionat.Um die Bildung intrazellulärer biosynthetischer Vorläufer in der Kultur zu unterstützen, die Zellen bei 22 Grad Celsius und 250 U/min für 24 bis 48 Stunden inkubieren. In regelmäßigen Abständen Proben der Kultur entnehmen, um die Plasmidstabilität während des Wachstums zu analysieren. Die Kulturen durch Zentrifugation bei 10.000 U/min klären.Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet zur Analyse bei vier Grad Celsius. Um die Bildung von Erythromycin A zu bestätigen und zu quantifizieren, injizieren Sie den kulturellen Überstand in ein LC-MS-System. Führen Sie außerdem Standardproben von kommerziell erhältlichem Erythromycin A durch. Für Fälle ohne kommerziell erhältliche Standards.Die Verbindung erfordert zusätzliche chemische Charakterisierungen mittels MR und Massenspektrometrie mit hoher Auflösung. Vergleichen Sie die Produktion zwischen den drei Präparationen und identifizieren Sie den höchsten Produzenten. Bereiten Sie eine Glycerin-Lagerkultur aus der Koloniequelle vor und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius zusammen mit dem Lagerstamm mit der höchsten Erythromycin-A-Produktion.Starten Sie eine separate E. coli-Produktionskultur, extrahieren Sie das endgültige Überstand mit der zweifachen Menge Ethylacetat. Anschließend trocknen Sie den Extrakt im Speed-Vac ein und resuspendieren das Pellet in 100 µL Methanol. Danach überführen Sie den Extrakt auf eine sterile Filtermembran und trocknen diesen separat an der Luft. Züchten Sie Kultur B subtles über Nacht in flüssigem LB-Medium, geben Sie 20 µL der B subtles-Kultur zu 20 mL flüssigem LB-Agar bei 45 °C und bereiten Sie eine Platte vor. Anschließend platzieren Sie eine Filterplatte mit Erythromycin A auf dem festen B solus-Agar und inkubieren bei 37 °C. In diesem Beispiel wird der Erythromycin-Gencluster von S urethra nach der Produktion von Erythromycin A im heterologen Wirt e coli auf e coli übertragen.Das bioaktive Produkt wird im nativen S ETH drei A Chromosom analysiert. Der Erythromycin-Gencluster ist in 55 KB gesamter DNA organisiert, und nach der Expression führt ein komplexer biosynthetischer Weg, der intrazelluläre Vorläufer sowie Polyketid-biosynthetische und modifizierende Enzyme erfordert, zur Bildung von Erythromycin A für den Gentransfer. Einzelne Gene werden zunächst mittels PCR isoliert.Dann wurden die für die Bildung von Erythromycin A benötigten Gene erstens einzeln in Expressionsvektoren kloniert, um die Proteinproduktion und -aktivität mittels SDS-Page und phänotypischer Assays zu bestätigen, und zweitens als Operone zusammengefasst, um schließlich den kompletten Biosyntheseweg in E. coli zu übertragen. Einige Gene erforderten eine Expression mit einer 5'-Leadersequenz, die sich aus dem PET-28-Expressionsvektor ergab, während andere dies nicht benötigten. Die Expression der einzelnen Gene wurde zunächst mittels SDS-Page analysiert. Dieses Ergebnis zeigt die phänotypische Bewertung des ERME-Gens für Erythromycin-A-Resistenz. Erythromycin A im festen Medium wird verwendet, um E. coli-Stämme zu testen, die Plasmide mit oder ohne das ERME-Gen für Erythromycin-A-Resistenz enthalten.Deutlich wird das Zellwachstum durch die Expression von ERME wiederhergestellt. Danach wird der vollständige Erythromycin-A-Weg in E. coli eingeführt, einschließlich eines Plasmids für den Grow-EL-Chaperon, und ein Plasmid, das eine zusätzliche Kopie von URI K enthält, wird mittels Elektrotransformation verwendet, um die Plasmide in E. coli zu übertragen. Anschließend wird die Plasmidstabilität des endgültigen Stammes bewertet.LC-MS-Ergebnisse bestätigen und quantifizieren die Produktion von Erythromycin. Eine wichtige Funktionalität wird durch antibakterielle Bioassays nachgewiesen, die Hemmzonen in Kulturen von empfindlichen Bakterien erzeugen oder das Wachstum empfindlicher Kulturen in seriellen Verdünnungen von Erythromycin A begrenzen. Mit dieser Videodemonstration der komplexen heterologen Biosynthese natürlicher Produkte verfügen Sie nun über die Fähigkeit, die einzelnen experimentellen Schritte zur Herstellung eines vollständigen heterologen Naturstoffs zu planen, durchzuführen und auszuwerten. Durch Anwendung von metabolischem Engineering an der E. coli-Zelle zur Optimierung verschiedener Vorstufen und des eingeführten Biosynthesewegs können Sie die Produktion von beispielsweise Erythromycin – dem heutigen Thema – oder eines anderen medizinisch relevanten oder schwer herstellbaren Wirkstoffs maximieren.

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Biology

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Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert E. coli (Video) | JoVE Journal

Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert

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