Name: Viral Nanopartikel für In vivo Tumor Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und funktionale Charakterisierung pflanzlicher viraler Nanopartikel für Tumor-Targeting und In-vivo-Imaging in Maus-Xenotransplantat-Modellen. Diese Methode ermöglicht präzise Biodistributionsstudien.

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Diese Arbeit wurde vom NIH / NIBIB Zuschüsse R00 EB009105 (NFS) und P30 EB011317 (NFS), ein NIH / NIBIB Ausbildungsförderung T32 EB007509 (um AMW), einem der Case Western Reserve University Interdisziplinäre Alliance Investment Grant (NFS) unterstützt, und ein Gehäuse Comprehensive Cancer Center Gewährung P30 CA043703 (NFS). Wir danken den Steinmetz Lab Bachelor-Student Forscher für ihre tatkräftige Unterstützung: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D&#39;Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian So, und Paul Chariou .

Ein. VNP (CPMV, BMV, PVX und TMV) Propagation <ol><li> Stellen Sie die Indoor-Anlage Kammer steuert bis 15 h Tag (100% Licht, 25 ° C, 65% Luftfeuchtigkeit) und 9 h Nacht (0% Licht, 22 ° C, 60% Luftfeuchtigkeit). </li><li> Beimpfen Anlagen nach der Timeline in Tabelle 1. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX, TMV und BMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tag 0: Plant 3 cowpea Samen / Topf. </td><td> Tag 0: Plant ~ 30 N. benthamiana Samen / Topf. Düngen Sie einmal pro Woche mit 1 Esslöffel Dünger / 5 L Wasser. </td></tr><tr><td> Tag 14: Re-Topf N. benthamiana bei 1 Pflanze / Topf. </td></tr><tr><td> Tag 10: Infect lässt primäre Blätter mit CPMV (5 &amp;mgr; g/50 ul / Blatt) durch mechanische Inokulation mit einem leichten Abstauben von Carborundum. </td><td> Tag 28: Infect drei bis five Blätter mit PVX, TMV oder BMV (5 &amp;mgr; g/50 ul / Blatt) durch mechanische Inokulation mit einem leichten Abstauben von Carborundum. </td></tr><tr><td> Tag 20: Harvest Blätter und lagern -80 ° C. </td><td> Tag 42: Harvest Blätter und lagern -80 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Timeline für den Anbau, infizieren, und die Ernte Blätter. Hinweis: Nur CPMV Ausbreitung wird als Beispiel gezeigt. 2. VNP (CPMV, BMV, PVX und TMV) Reinigung Hinweis: Alle Schritte werden auf Eis oder bei 4 ° C. <ol><li> Homogenisieren 100 g gefrorene Blätter in einem Standard-Mixer mit 2 Volumina kaltem Puffer (siehe Tabelle 2). Anschließend wird durch 2-3 Schichten Gaze. </li><li> Für PVX, pH-Wert auf 6,5 mit 1 M HCl. Hinzufügen 0,2% (w / v) Ascorbinsäure und 0,2% (w / v) Natrium Sulfite. </li><li> Zentrifuge rohen Pflanzenextrakten Homogenat bei 5.500 xg für 20 min. Sammle Überstand. </li><li> Für BMV, Schicht 25 ml Überstand auf 5 ml 10% (w / v) Saccharose-Lösung. Zentrifuge bei 9000 × g für 3 h und resuspendieren Pellets in 38,5% CsCl-Lösung (w / v). Mix durch Schütteln für 5 Stunden, dann mit Schritt 2,12 fortzusetzen. </li><li> Extrahieren Pflanzenmaterials durch Zugabe von 0,7 Volumina von 1:1 (v / v) Chloroform :1-Butanol. Stir Mischung für 30-60 min. </li><li> Zentrifuge Lösung bei 5.500 xg für 20 min. Sammeln der oberen wäßrigen Phase. </li><li> Hinzufügen NaCl bis 0,2 M und 8% (w / v) PEG (MW 8000). Für TMV, auch die 1% (v / v) Triton X-100. Stir für mindestens 1 h, dann lassen Sie sich für mindestens 1 Stunde. </li><li> Zentrifuge Lösung bei 15.000 × g für 15 min. Pellet in 10 ml Puffer. Für PVX, fügen Sie 0,1% β-Mercaptoethanol und Harnstoff zu 0,5 M. </li><li> Zentrifuge bei 8.000 xg für 30 min und sammeln Überstand. </li><li> Ultrazentrifuge Überstand bei 160.000 xg für 3 Stunden. Pellet in 5 ml Puffer overnight. </li><li> Vorbereiten einer 10-40% Saccharosegradienten mit gleichen Volumina von 10%, 20%, 30% und 40% Saccharose in Puffer (schwerste zuerst). Lassen Sie den Gradienten über Nacht ins Gleichgewicht bei Raumtemperatur. </li><li> Ultrazentrifuge resuspendiert Pellet über Saccharosegradienten bei 100.000 × g für 2 h (24 h bei BMV). </li><li> Sammle Lichtstreuung Band und Dialyse gegen Puffer. </li><li> Charakterisieren die VNPS (unten) und bei 4 ° C. Für die langfristige Lagerung bei -80 ° C lagern </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV und TMV </td><td> 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0,5 M Boratpuffer (pH 7,8) 0,5 M Borsäure Der pH-Wert mit NaOH </td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA Puffer (pH 4,5) 250 mM Natriumacetat 10 mM MgCl 2 2 mM β-Mercaptoethanol (add frisch) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Puffer und ihre Rezepte für jeden VNP. Hinweis: Nur CPMV Ausbreitung wird als Beispiel gezeigt. 3. VNP (CPMV, BMV, PVX und TMV) Charakterisierung <ol><li> Führen UV / VIS-Spektroskopie, die Konzentration von VNPS bestimmen. <ol><li> Messen Sie die Absorption von 2 ul Probe mit einem NanoDrop Spektralphotometer. </li><li> Bestimmung der Konzentration von Partikeln und Farbstoffen Verwendung des Beer-Lambert-Gesetz (A = εcl, wobei A die Absorption, ε ist der Extinktionskoeffizient ist, c die Konzentration ist, und l die Weglänge). Die Weglänge beträgt 0,1 cm für den NanoDrop. Die VNP-spezifischen Extinktionskoeffizienten sind: CPMV: 8,1 cm -1 mg -1 ml (bei ​​260 nm) PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (bei ​​260 nm) TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (bei ​​260 nm) BMV 5.15 cm -1 mg -1 ml (bei ​​260 nm) </li></ol></li><li> Analysieren Partikel durch Ausschluss-Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC). <ol><li> Mit einer Superose 6 Ausschluss-Säule und die ÄKTA Explorer, Last 50-100 ug VNPS in 200 ul 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0). </li><li> Detektoren eingestellt auf 260 nm (Nukleinsäure), 280 nm (Protein) und der Anregungswellenlänge etwaiger Farbstoffe beigefügt. </li><li> Ausführen bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min für 72 min. </li><li> Das Elutionsprofil und A260: A280 nm angibt, ob der VNP Vorbereitung rein ist und ob Partikel sind intakt und montiert. Die folgende A260: 280 Kennzahlen deuten auf eine reine VNP Zubereitung: CPMV: 1,8 ± 0,1 PVX: 1,2 ± 0,1 TMV:1,1 ± 0,1 BMV: 1,7 ± ​​0,1 </li></ol></li><li> Führen Denaturierung (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris Polyacrylamid 4-12% Gradienten-Gel-Elektrophorese, um die Reinheit der Vorbereitung und Konjugation an einzelnen Hüllproteine ​​analysieren. <ol><li> 3 ml 4x LDS-Probenpuffer bis 10 ug der Partikel in 9 ul Kaliumphosphatpuffer. Fügen Sie eine weitere 1 ul 4x LDS-Probenpuffer und 3 ul β-Mercaptoethanol BMV die hohe Zahl von Disulfidbindungen zu reduzieren. </li><li> Inkubieren in Heizblock für 5 min bei 100 ° C. </li><li> Legen Sie die Proben auf einem SDS-Gel. </li><li> Führen Proben bei 200 V für 1 Stunde in 1x MOPS Laufpuffer. </li><li> Dokumentieren Sie das Gel unter UV-Licht fluoreszierenden Hüllproteine ​​zu visualisieren. </li><li> Für nicht-fluoreszierendes Protein, mit Coomassie-Blau (0,25% (w / v) Coomassie-Brilliantblau R-250, 30% (v / v) Methanol, 10% (v / v) Essigsäure) für 1 Stunde zu färben. </li><li> Entfärben mit 30% Methanol, 10% Essigsäure über Nacht. Change die Lösung, wenn erforderlich. </li><li> Dokumentieren Sie das Gel unter weißem Licht. </li></ol></li><li> Analysieren Integrität der Teilchen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). <ol><li> Verdünnen Sie die Proben auf 0,1-1 mg / ml in 20 ul DI-Wasser. </li><li> Platz 20 ul Tropfen der Proben auf Parafilm. </li><li> Titelbild Tropfen mit einem TEM-Gitter und lassen Sie sich für 2 min. Wick das überschüssige Lösung auf dem Gitter mit Filterpapier. </li><li> Waschen Sie Grid, indem auf einen Tropfen DI Wasser dann Dochtwirkung trocken. </li><li> Fleck Gitter durch Aufstellung auf einem 20 ul Tropfen von 2% (w / v) Uranylacetat für 2 min. Wick das überschüssige Fleck mit Filterpapier. </li><li> Waschen Sie Grid einmal mehr im Wasser. </li><li> Beobachten Gitter unter einem Transmissions-Elektronen-Mikroskop. </li></ol></li></ol> 4. Chemische Konjugation von VNPS mit PEG und Fluorophore, Reinigung und Charakterisierung <ol><li> Für die Berechnungen für die Reaktionen unten, sind die Molmasse der VNPS: CPMV: 5,6x 10 6 g / mol PVX: 35 x 10 6 g / mol TMV: 41 x 10 6 g / mol BMV: 4,6 x 10 6 g / mol </li><li> Konjugat Farbstoffen und PEG an die Oberfläche Lysine CPMV und PVX mit einem Ein-Schritt-N-Hydroxysuccinimid Kupplungsreaktion: In 2.500 Moläquivalenten (alle molare Überschüsse beziehen sich auf molaren Überschuss pro VNP) von Alexa Fluor 647 Succinimidylester und 4.500 Äquivalente von NHS- PEG (MW 5000) in DMSO auf CPMV gelöst in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer. Bei der Arbeit mit PVX, fügen Sie ein 10.000 molaren Überschuß von NHS-Farbstoff und NHS-PEG. Durch Veränderung der Puffer und DMSO Volumina, so dass die Endkonzentration von CPMV und PVX 2 mg / ml und DMSO-Gehalt 10% des gesamten Reaktionsvolumens liegt. Inkubieren die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. CPMV und PVX haben 300 und 1.270 adressierbare Lysine sind. (Der Leser wird auf den folgenden Literaturhinweise am bezeichnetchemische Modifikation von CPMV und PVX: 13-15). </li><li> Konjugat Farbstoffen und PEG Tyrosine des TMV von Diazonium Kopplung von Kupfer (I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition gefolgt. <ol><li> Planen Diazoniumsalz (Alkin) durch Mischen von 400 ul 0,3 M p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat, 25 ul 3,0 M Natriumnitrit und 75 ul 0,68 M destilliertem 3-Ethinylanilin in Acetonitril bei 4 ° C für 1 Stunde gelöst. </li><li> Hinzufügen 3,3 ml Boratpuffer, pH 8,8, enthaltend 100 mM NaCl und 1,25 ml TMV (20 mg / ml Stammlösung). </li><li> Reagieren des TMV mit 450 ul des Diazoniumsalzes (Alkin)-Lösung in einem Eisbad für 3 Stunden zum Hinzufügen eines Alkins Ligation Griff durch Diazonium Kopplung TMV. Die Lösung wird in eine hellbraune Farbe einzuschalten. TMV hat 2.140 Verfügung Tyrosine zur Konjugation. </li><li> Reinige das Endprodukt mit einer Saccharose-Kissen wie in Schritt 4.4 beschrieben. </li><li> Bringen Azid-funktionale Alexa Fluor 647 und PEG-Azid (MW 5.000) using Kupfer (I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC). Add 2 Äquivalenten Farbstoff-und PEG-Azid pro Hüllprotein und inkubieren mit 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG und 2 mM Natriumascorbat bei Raumtemperatur für 15 min. Passen das Puffervolumen so daß die endgültige Konzentration der Reaktion TMV 2 mg / ml beträgt. (: 16,17 Der Leser wird auf den folgenden Literaturhinweise zur chemischen Modifikation von TMV bezeichnet). </li></ol></li><li> Konjugat Farbstoffe Lysine und PEG Cysteine ​​BMV Cystein-Mutante (cBMV): <ol><li> Hinzufügen 2000 Moläquivalenten Oregon Green 488 Succinimidylester in DMSO, um cBMV gelöst in 0,1 M TNKM Puffer (50 mM Tris-Base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 7,4). Durch Veränderung der Puffer und DMSO Volumina, so dass die Endkonzentration von BMV 1 mg / ml und DMSO-Gehalt 10% des gesamten Reaktionsvolumens liegt. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung über Nacht bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li><li> Purify Partikel mit Zentrifugenfugierten Filter wie in Schritt 4.4 beschrieben. </li><li> Hinzufügen 2000 molaren Überschuß von PEG-Maleimid (MW 2000) unter Verwendung der gleichen Reaktionsbedingungen wie vor und inkubieren des Reaktionsgemisches für 2 Stunden bei 4 ° C. cBMV hat 180 reaktive Lysine und Cysteine. (: 18 Der Leser wird auf den folgenden Literaturhinweise zur chemischen Modifikation von BMV genannt). </li></ol></li><li> Reinigung: Übergeben der Lösung durch eine 40% (w / v) Saccharose-Kissen bei 160.000 × g für 2,5 Stunden. Wieder das Pellet in Puffer. Alternativ gegen entsprechende Puffer mit 10 kDa cut-off Spin-Filter dialysiert. </li><li> Charakterisierung: PEGylierten und fluoreszenzmarkierten VNPS analysiert werden unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren: UV / Vis-Spektroskopie, SDS-Gelelektrophorese, FPLC und TEM (nicht gezeigt, aber auf die 6 und 7 beziehen). </li></ol> 5. Tumor-Targeting-und Imaging mit einer Maus Xenograft Modell<ol><li> Kultur menschliche HT-29-Kolonkrebszellen in RPMI Medium mit 5% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% L-Glutamin bei 37 ° C in 5% CO 2 unter Verwendung von 175 cm 2 Zellkulturflaschen ergänzt. </li><li> Waschen der Zellen zweimal mit sterilem PBS und Ernte durch Inkubation mit 5 ml Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 5 min. Inaktivierung des Trypsin mit 5 ml RPMI-Medium. Collect Zellen durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 min. bei 4 ° C und resuspendieren in frischem RPMI bei 5x10 6 Zellen/50 ul Medium (festzustellen gesamten Zellzahl mittels Trypanblau und eines Hämozytometers). Mischen mit einem gleichen Volumen von Matrigel vor der Injektion (keep alle Lösungen und Reagenzien steril). </li><li> Beschaffen sechs Wochen alten NCR nu / nu-Mäusen und halten sie auf einer Luzerne freie Diät für 2 Wochen. [Anmerkung:. Alle tierischen Verfahren müssen IACUC genehmigt] Erbrechen Tumorxenotransplantaten durch subkutane Injektion von 5x10 6 Zellen/100 ul / Tumor in den Flanken (2 Tumoren / Maus) mit einem 18 1/2 Gauge sterilenNadel. Überwachen Sie die Tiere regelmäßig. Messen Sie die Größe des Tumors mit Bremssätteln und damit die Tumore zu einem durchschnittlichen Volumen von 20 mm 3 (innerhalb der nächsten 12 Tage) wachsen. Weisen Mäusen zu zwei verschiedenen Gruppen randomisiert: PBS und VNP (n = 3 Tiere / Gruppe / Zeitpunkt). Verwendung einer 1 ml 28 Gauge Insulinspritze durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene 100 ul sterilem PBS oder 10 mg / kg VNP Formulierung zu verabreichen. </li></ol> Hinweis: Gewebekultur Experimente und Studien mit lebenden Tieren nicht nachgewiesen werden. Hands-on-Demonstration wird die Gewebe-Verarbeitung und Datenerfassung begrenzt werden. Für einen Hinweis bei der HT-29 Xenograftmodell, wird der Leser auf ref bezeichnet. 19 Drei Techniken werden verwendet, um von einem Tumor einfindende VNPS auszuwerten: <ol start="4"><li> Fluoreszenz-Imaging mit Maestro Imaging System: Sacrifice Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (2, 24 und 72 h) unter Verwendung von CO 2Gas. Sezieren die Tiere und Verbrauchsteuern alle wichtigen Organe (Gehirn, Herz, Lunge, Milz, Nieren und Leber) zusammen mit den Tumoren an den Flanken, legen Sie das Gewebe auf Parafilm und analysieren mit Fluoreszenz-Imaging Instrument mit gelben Anregungs-und Emissions-Filter (800 ms Exposition), um die Anwesenheit von Fluoreszenzsignalen in den Geweben (abgeleitet von A647 Label konjugiert zu den VNPS) zu detektieren. Speichern Sie die Bilder und analysieren Fluoreszenzintensitäten mit ImageJ 1.44o Software ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ). Vergleichen des Musters der Aufnahme der VNPS in Tumoren mit anderen wichtigen Geweben mit der Zeit. </li><li> Nach der Bebilderung, schneiden jedes Gewebe in der Mitte und betten die eine Hälfte in OCT-Verbindung für Kryo-Schnitte und konfokale Analyse. Sammeln Sie die andere Hälfte in vorgewogenen Cryoröhrchen und sofort einfrieren mit flüssigem N 2. Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung bereit. </li><li> Fluoreszenz Quantifizierung: ReKord Geweben Gewichte. Eingefrorene Gewebe bei Raumtemperatur und legen Sie sie in separaten 50 ml Falcon-Röhrchen mit 1 ml PBS. Mit einem Handheld Gewebehomogenisator, Homogenisierung der Gewebe für 2-3 min in PBS übertragen dann das Homogenat zu Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugation der Homogenate 10 min bei 13.000 × g, um nicht homogenisierten Gewebe zu entfernen. </li><li> Je 100 ul des Überstands aus den Geweben aus jeder Gruppe (PBS und VNP Formulierungen / Zeitpunkten) in einer 384 well black UV Platte. Bewerten Fluoreszenzintensität (Ex / Em Wellenlängen 600/665) mit einer Platte Leser. Normalisieren der erhaltenen fluoreszierenden Werte durch die Gewebe-Gewichte. </li><li> Immunhistochemie: Bereiten Kryo-Mikrotomschnitte (10 um) und bei -20 ° C. Fleck Gewebeschnitte für Zellkerne (DAPI) und endothelialer Zellmarker (FITC-markierte Anti-Maus-CD31-Antikörper). Durchführung Konfokalmikroskopie Analyse, um den vaskulären und intratumorale Lokalisierung von fluoreszenzmarkierten VNP abzubildens. </li></ol> Hinweis: Dieses Verfahren nicht nachgewiesen werden, repräsentative Daten sind in Abbildung 8 dargestellt. Für einen Verweis auf Immunhistochemie und den beschriebenen Färbemethoden, wird der Leser auf ref bezeichnet. 19

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<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die chemische Modifikation von VNPS und deren Anwendungen zur in vivo-Tumordarstellung. Die Tier-Fluoreszenz-Imaging-, Fluoreszenz-Quantifizierung und Immunhistochemie hier vorgestellten Verfahren sind nützlich für das Studium Bioverteilung und Auswertung Tumor Homing. Diese Techniken wertvolle Informationen über den Zugang der Nanopartikel an den Tumor durch die EPR-Effekt. Durch die Kombination der Ergebnisse aus den verschiedenen analytischen Methoden, erhalten wir ei...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;stark&gt;VNP-Produktion&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Innere Pflanzenkammer</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; Samen (California black-eye Nr. 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; Samen</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Die N. benthamiana-Samen stammten aus einer Spende des Salk Institute. Die Samen werden durch Pflanzenvermehrung gewonnen.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Carborundum</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Pro-mix BX Blumenerde</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Dünger</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;stark&gt;Ausrüstung&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>50.2 Ti-Rotor</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti-Rotor</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>SLA-3000-Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>SS-34-Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylenflasche</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>Für SLA-3000-Rotor</td></tr><tr><td>Polycarbonatflasche</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Für SS-34-Rotor</td></tr><tr><td>Ultra-Clear-Röhrchen</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Für Saccharose-Dichtegradient und SW 32 Ti Rotor</td></tr><tr><td>Polycarbonatflasche</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>Zum Pelletieren und mit 50.2 Ti-Rotor</td></tr><tr><td>NanoDrop-Spektrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>PowerEase 500 Gelsystem mit vorgefertigten Gele</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL (24 ml) Größenausschluss-Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;KTA Explorer 100 Chromatograph</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>Laborzentrifuge</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; Abbildungssystem</td></tr><tr><td>Tissue-Tearor</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplattenreader</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>FluoView Laser-Scanning-Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;stark&gt;Chemikalien und Reagenzien&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-Ethynylanilin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>384-Well-Schwarzplatte</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>4–12 % Bis-Tris NuPAGE SDS-Gele</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>4X LDS-Probenpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-Azid</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Carbonsäure, Succinimidester</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0,5-ml-Zentrifugalfilter</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>10-kDa-Cut-off</td></tr><tr><td>Aminoguanidinhydrochlorid</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>P5-Grad</td></tr><tr><td>FITC-markiertes Anti-Maus-CD31</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsalz der L-Ascorbinsäure</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopische Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>MOPS-Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-2k</td><td>MW 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>Nanocs</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>MW 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanocs</td><td>PG1-SC-5k</td><td>MW 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488-Succinimidylester *6-Isomer*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitrit</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfit</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>TEM-Gitter</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;Ethanol</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;stark&gt;Gewebekultur&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>HT-29-Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturgefäße</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0,05 % (1X) mit EDTA 4Na, flüssig</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;stark&gt;Tierstudien&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>18 % Eiweißhaltige Nagerdiät</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>Alfalfafreie Diät</td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>28 Gauge</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel-Matrix-Basalmembran</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>NCR nu/nu-Mäuse</td><td></td><td></td><td>CWRU School&lt;br/&gt; der Medizin Athymische Tier- und Xenotransplantat-Kernfacility</td></tr><tr><td>Sterile Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18 1/2 Gauge</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

viral nanopartikel für<em&gt; in vivo</em&gt; tumor imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Die Verwendung von Nanomaterialien hat das Potenzial, Materialwissenschaft und Medizin zu revolutionieren. Derzeit sind eine Anzahl verschiedener Nanopartikel ist für Anwendungen in der Bildgebung und Therapie untersucht. Viral-Nanopartikel (VNPS) aus Pflanzen gewonnen werden kann als self-assembled Bionanomaterialien mit definierten Größen und Formen betrachtet werden. Pflanzenviren untersuchten im Labor gehören Steinmetz ikosaedrischen Teilchen durch Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV) und Brome Mosaik Virus (BMV), die beide 30 nm im Durchmesser sind, gebildet. Wir entwickeln auch stabförmigen und filamentöse Strukturen aus den folgenden Pflanzenviren abgeleitet: Tabak-Mosaik-Virus (TMV), die starre Stäbe bildet mit den Abmessungen von 300 nm von 18 nm und Potato virus X (PVX), die filamentöse Partikel 515 bilden nm Länge und 13 nm in der Breite (der Leser auf refs bezeichnet. 1 und 2 für weitere Informationen über VNPS). in großem Maßstab in planta hergestellt werden, sind außergewöhnlich stabil und biokompatibel. Auch sind VNPS &quot;programmierbar&quot;-Einheiten, die speziell entwickelt werden mit gentechnischen Veränderung oder chemische Biokonjugation Methoden 3 können. Die Struktur der VNPS wird bis zu atomarer Auflösung bekannt und Modifikationen können mit räumlicher Präzision durchgeführt werden auf atomarer Ebene 4, ein Maß an Kontrolle, die nicht erreicht werden kann mit synthetischen Nanomaterialien mit aktuellen State-of-the-art Technologien werden. In diesem Papier beschreiben wir die Ausbreitung von CPMV, PVX, TMV und BMV in Vigna ungiuculata und Nicotiana benthamiana Pflanzen. Extraktion und Reinigung Protokolle für jede VNP gegeben. Methoden zur Charakterisierung von gereinigtem und chemisch-markierten VNPS beschrieben. In dieser Studie haben wir am ch konzentrierenemical Kennzeichnung VNPS mit Fluorophoren (zB Alexa Fluor 647) und Polyethylenglykol (PEG). Die Farbstoffe erleichtern Verfolgung und Erfassung der VNPS 5-10, und PEG reduziert Immunogenität der proteinartigen Nanopartikel gleichzeitig ihre Pharmakokinetik 8,11. Wir zeigen Tumor Homing von PEGylierten VNPS mit der Maus Xenograft-Tumor-Modell. Eine Kombination von Fluoreszenz-Bildgebung von Gewebe ex vivo mit Maestro Imaging System, Fluoreszenz Quantifizierung in homogenisierten Geweben und konfokale Mikroskopie wird verwendet, um Bioverteilung studieren. VNPS werden über das retikuloendotheliale System (RES) gelöscht ist; Tumor einfindende wird passiv über das erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Wirkung 12 gelöst. Der VNP Nanotechnologie ist ein leistungsstarkes Plug-and-play-Technologie auf Bild und Behandlung von Seiten der Erkrankung in vivo. Wir arbeiten weiter an VNPS um Drogen Frachten und klinisch relevante Bildgebung Einheiten sowie Gewebe-spezifische Liganden zu tragenZiel molekularen Rezeptoren bei Krebs und kardiovaskuläre Erkrankungen überexprimiert.

<img alt="Vergleichende Analyse des Pflanzenwachstums; experimenteller Aufbau, Untersuchung der Blattfarbvariation, Chlorose-Methode." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Pflanzen, die mit Pflanzenviren infiziert sind. Vigna unguiculata-Pflanzen, infiziert mit CPMV (A). Nicotiana benthamiana-Pflanzen, infiziert mit PVX (B), TMV (C) und BMV (D). Die Aufnahmen wurden etwa...

Pflanzen virale Nanopartikel (VNPS) sind vielversprechende Plattformen für Anwendungen in der Biomedizin. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Anlage VNP Ausbreitung, Reinigung, Charakterisierung und Biokonjugation. Schließlich zeigen wir die Anwendung der VNPS für die Tumor-Homing und Bildgebung mit der Maus Xenograft-Modell und Fluoreszenz-Bildgebung.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Der Einsatz von Nanomaterialien hat das Potenzial, die Materialwissenschaft und die Medizin zu revolutionieren. Derzeit werden eine Reihe verschiedener Nanopartikel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die in-vivo-Tumortargeting und die Biodistribution fluoreszenzmarkierter viraler Nanopartikel zu untersuchen. Zunächst werden in Maus-Tumor-Modellen das Virus vermehrt und gereinigt, anschließend werden die Farbstoffe und PEG an die Partikel konjugiert. Nach der Charakterisierung der funktionalisierten Partikel werden diese in Mäuse mit Tumor-Xenotransplantaten injiziert. Ergebnisse aus Maestro-Bildgebung, Fluoreszenzintensitätsmessungen, der Untersuchung der Gewebshomogenität und der Immunfluoreszenz zeigen die Lokalisation der viralen Nanopartikel im Tumor und in verschiedenen Organen des Körpers. Plattform. Nanopartikel oder BMPs sind aussichtsreiche Plattformen für Anwendungen in der Biomedizin. Hier beschreiben wir die Verfahren für PLA-VMP, Vermehrung, Reinigung, Charakterisierung und Konjugation mit Antikörpern.Schließlich zeigen wir die Anwendung von V mps für das Tumor-Targeting und die Bildgebung anhand eines malignen Transplantatmodells und der Fluoreszenzbildgebung. Derzeit werden eine Reihe unterschiedlicher Nanopartikel für Anwendungen in der Bildgebung und Therapie untersucht. Die Hauptvorteile der Verwendung biogener Nanopartikel gegenüber synthetischen Materialien wie metallischen oder polymeren Nanomaterialien liegen darin, dass BMPs aus Pflanzen monodisperse sind und ihre Strukturen bis auf atomare Auflösung bekannt sind.Pflanzenviren können im großen Maßstab durch molekulares Farming hergestellt und sowohl genetisch als auch chemisch verändert werden. In dieser Demonstration zeigen wir die chemische Modifizierung viraler Nanopartikel mit Fluor Vierer- und PEG-Gruppen. Die Fluor Vierer-Gruppen werden zur Verbesserung der Bildgebung eingesetzt, während das PEG zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften dient.Chemische Modifikationen können erweitert werden, um virale Nanopartikel mit Therapeutika und Kontrastmitteln für die klinische Bildgebung, wie z. B. die MRT, zu beladen. Hier demonstrierten wir die Biodistributionsstudie ated viraler Nanopartikel wie bei anderen Nanopartikeln. Das Tumor-Anhaften von V-NPS basiert auf der erhöhten Permeabilität und Retention, die als passive Tumor-Homemaking beschrieben wird.Wir haben kürzlich festgestellt, dass die Biodistributionsprofile verschiedener Pflanzenviren unterschiedlich sind. Für diese Demonstration verwenden wir das Cowpea Mosaic Virus, das als Goldstandard für die virale N-Technologie gilt. Wir haben ein besonderes Interesse daran, aus Pflanzenviren hergestellte Nanomaterialien zu entwickeln, zu konstruieren und zu untersuchen.Unser Labor konzentriert sich darauf, ein grundlegendes Verständnis dafür zu erlangen, wie Ed cow p mosaic virus bro mosaic virus, rock shaped bacca mosaic virus und das fadenförmige Potato virus X mit dem Säugetiersystem interagieren. Insbesondere möchten wir untersuchen, wie Form und Flexibilität die EVO-Eigenschaften beeinflussen und wie sie am besten für Anwendungen wie die gewebespezifische Bildgebung und die Arzneimittelabgabe maßgeschneidert werden können. Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von kalp mosaic virus, Potato virus X, brown mosaic virus und Tobacco mosaic virus.Aus Vic, Gil und Nicotiana beschreiben wir deren Funktionalisierung und Anwendung in einem präklinischen Mausmodell. In dieser Demonstration verwenden wir das Cowpea-Mosaikvirus in einer Inneninkubationskammer. Pflanzen Sie drei Cowpea-Samen pro Topf.Am Tag 10 jede Blattfläche mit 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter CPMV durch mechanische Inokulation infizieren, indem man eine leichte Bestäubung mit Carum durchführt, gefolgt von vorsichtigem Reiben der Blätter. Nach 10 Tagen die Blätter ernten und bei minus 80 Grad Celsius lagern. 100 Gramm gefrorene Blätter in einem Standardmixer in zwei Volumina kaltem 0,1-molarem Kaliumphosphatpuffer, pH 7, homogenisieren, das Homogenat durch drei Lagen Mullbinde filtrieren und 20 Minuten bei 5.500 × g zentrifugieren.Sammeln Sie das Überstand, anschließend führen Sie eine organische Extraktion des Pflanzenmaterials mit 0,7 Volumina eines Gemischs aus Chloroform zu Butanol im Verhältnis eins zu eins durch, wobei Sie die Mischung mindestens 30 Minuten lang rühren. Nach einer Zentrifugation der Lösung bei 5.500 ×g für 20 Minuten sammeln Sie die obere wässrige Phase und führen eine Ultrazentrifugation durch.Zentrifugieren Sie mit 160.000 × g für drei Stunden. Resuspendieren Sie das Pellet danach in fünf Milliliter Phosphatpuffer und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie außerdem einen 10 bis 40 %igen Saccharosegradienten vor, indem Sie gleiche Volumina von 10, 20, 30 und 40 %iger Saccharose in Puffer mischen.Platzieren Sie die schwerste zuerst, um den Gradienten über Nacht bei Raumtemperatur auszugleichen. Schichten Sie die REsuspendierte Probe auf den Saccharosegradienten und zentrifugieren Sie zwei Stunden bei 100.000 ×g. Sammeln Sie das lichtstreuende Band und dialysieren Sie gegen Puffer, um die Farbstoffe und PEG an die lysinhaltigen Oberflächenreste unter Verwendung von 2.500 molaren Äquivalenten Fluor und 4.500 Äquivalenten NHS-PEG bezogen auf CPMV zu konjugieren.Nach der Reinigung der Reaktion das Absorptionsspektrum von zwei Mikrolitern Probe mit dem Nano Drop messen und die Werte bei 260, 280 und 651 Nanometern notieren. Danach die Partikel nach Größe mittels Größenausschluss-Chromatographie analysieren, unter Verwendung einer Super-OH6-Größenausschluss-Säule und des ACTA Explorer, wobei 50 bis 100 Mikrogramm der VNP-Probe in 200 Mikrolitern 0,1-molarer Kaliumphosphatpuffer aufgegeben werden.pH 7,0; stellen Sie die Detektoren auf 260 Nanometer für Nukleinsäuren und 280 Nanometer für Proteine ein. Stellen Sie außerdem die Absorptionswellenlänge für eventuell angebundene Farbstoffe ein. Führen Sie die Trennung mit einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute über einen Zeitraum von 72 Minuten durch.Das Ellucian-Profil im Verhältnis 2 62 80 zeigt an, ob die Reaktion rein ist und ob die V-NPS vollständig assembliert und intakt sind. Bereiten Sie anschließend eine denaturierende SDS-Gelelektrophorese vor, um die Konjugation an einzelne Hüllproteine zu analysieren. Geben Sie für jede Probe drei Mikroliter Vierfach-XLDS-Probenpuffer zu 10 Mikrogramm der Partikel in neun Mikrolitern Kaliumphosphatpuffer und denaturieren Sie fünf Minuten bei 100 Grad Celsius im Heizblock.Laden Sie die Proben auf ein SDS-Gel auf und laufen Sie eine Stunde lang bei 200 Volt. Dokumentieren Sie das Gel in einem X MOPS-Laufpuffer unter Weißlicht. Nach der Färbung sind diese viralen Nanopartikel nun bereit für die Tumortargeting- und Bildgebung unter Verwendung eines Xenotransplantat-Mausmodells.Üblicherweise verwenden wir eine Schwanzveneninjektion, um diese Partikel intravenös zu verabreichen, um die Tumorwanderung der VN-PS zu bewerten. Analysieren Sie die Gewebe mit dem Maestro-Fluoreszenzbildgebungsgerät. Verwenden Sie gelbe Anregungs- und Emissionsfilter mit einer Belichtungszeit von 800 Millisekunden, um das Vorhandensein fluoreszierender Signale nachzuweisen, die vom mit den VN-PS konjugierten A647-Farbstoff stammen, zur Fluoreszenzquantifizierung.Homogenisieren Sie die Gewebe zwei bis drei Minuten lang in PBS. Anschließend überführen Sie das Homogenat in Zentrifugenröhrchen für jede PBS- und VNP-Formulierung pro Zeitpunkt. Geben Sie 100 Mikroliter der Probe Senna in eine schwarze 384-Well-UV-Platte. Messen Sie die Fluoreszenzintensität unter Verwendung einer Anregungs- und Emissionswellenlänge von 660 bzw. 665 Nanometern.Eine erfolgreiche VNP-Vermehrung kann anhand des Auftretens von Mosaiksymptomen auf den Blättern etwa eine Woche nach mechanischer Inokulation festgestellt werden. Die UV-Vis-Spektroskopie kann zur Beurteilung der Reinheit der Partikel verwendet werden. Die Absorption bei 260 Nanometern ist proportional zur Nukleinsäurekonzentration und die Absorption bei 280 Nanometern ist proportional zur Proteinkonzentration.Diese Größenausschluss-Elutionsprofile von VN-PS wurden unter Verwendung einer Superos-Sechssäule und eines ACTA-Reinigungssystems erhalten. Wie bei den UV-sichtbaren Spektren kann das Verhältnis von A260 zu A280 zur Beurteilung der Reinheit von VNP-Präparationen herangezogen werden. Zusätzlich kann das Elutionsprofil zur Bestimmung der Reinheit der Partikel verwendet werden.Die SDS-Gelelektrophorese trennt die denaturierten Hüllproteinsubeinheiten. Die CPMV-Partikel bestehen aus zwei Proteinen, einem großen 42-Kilodalton-Protein und einem kleinen 24-Kilodalton-Protein. Hinweis: Das kleinere Protein weist in diesen TEM-Aufnahmen von Viruspartikeln zwei elektrophoretische Formen auf.Die TEM-Gitter wurden mit 2 % Urinylacetat negativ gefärbt, sodass die Partikel auf dunklem Hintergrund hell erscheinen. Die CPMV-Partikel haben eine Größe von 30 Nanometern. Die VNPs können anschließend über biokonjugate Chemien funktionalisiert werden.Zum Beispiel verfügen CPMV über Lysine, die zur Reaktion mit funktionalisierten NHS-Estern genutzt werden können, um die Funktionalisierung der VN-NPS mittels derselben Methoden wie zuvor für die gereinigten Partikel zu bestätigen. Dies sind repräsentative Daten fluoreszenzmarkierter und pegylierter VN-Ps. Die funktionalisierten Partikel können anschließend für nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, wie beispielsweise die Untersuchung der Biodistribution und des Tumor-Targetings mit pegylierten und stark markierten VN-Ps.Hier wird die Biodistribution von CPMV in nude-Mäusen mit implantierten humanen HT-29-Xenotransplantaten untersucht, wobei Biodistribution und Tumoransiedlung mittels Maestro-Bildgebung von Geweben analysiert werden. Ex vivo wurde für die PBS-Kontrolle keine Fluoreszenz beobachtet. Bei CPMV, konjugiert mit 647 und PEG, war hingegen eine starke Fluoreszenz in der Leber sowie eine geringere im Milzgewebe nachweisbar, verursacht durch den Abbau über das retikuloendotheliale System.Auffällige Fluoreszenz im Tumor weist auf eine Tumoransiedlung über den Effekt der erhöhten Durchlässigkeit und Retention hin. Diese quantitativen Daten wurden durch Fluoreszenzmessung homogenisierter Gewebe ermittelt, die auf das Gewicht des Gewebes normiert waren. Wie erwartet zeigen die Daten einen Clearance-Effekt von CPMV durch Leber und Milz.CPMV wird ebenfalls im Tumor nachgewiesen. Eine weitere intratumorale Lokalisation mittels Immunfärbung von kryoseziierten Geweben zeigt die intratumorale Verteilung von CPMV. CPMV ist in Rot dargestellt.Das Blau zeigt die Kerne, das Grün ein mit Anti-CD31 angefärbtes Blutgefäß. CPMV wurde hauptsächlich in der Nähe der Tumorgefäße gefunden. Die beschriebenen Techniken haben eine Anwendbarkeit für eine Vielzahl von bio-nanopartikulären Systemen ermöglicht.Die Arbeitsgruppe Stein untersucht VMP, wie beispielsweise das Kuh-Mosaik-Virus, das Bro-Mosaik-Virus, das Kartoffelvirus X und das Tabakmosaikvirus. Die Methoden könnten jedoch auch auf andere virale Nanopartikel oder proteinbasierte Nanostrukturen wie Hitzeschockproteine angewendet werden. Nach Durchführung dieses Verfahrens können zusätzliche Methoden wie R-T-P-C-R oder Western Blot als eigenständige Methoden durchgeführt werden.Mit Hilfe der Kryoschnitte und der Immunhistochemie können zusätzliche Informationen über die intratumorale Lokalisation der vps sowie eine mögliche Kolokalisation mit tumorassoziierten Makrophagen oder anderen Organellen gewonnen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man virale Nanopartikel vermehrt, reinigt, funktionalisiert und charakterisiert sowie deren Verteilung in vivo anhand eines Tumormausmodells untersucht.

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Quelle: Kim, B. D., et al. Nanopartikel-Abgabe einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell. J. Vis. Exp. (2024)Dieses Video zeigt die intravenöse Injektion von therapeutischen Nanopartikeln in eine Glioblastom-tragende Maus. Die Methode ermöglicht eine gezielte Verabreichung über die Blut-Hirn-Schranke und unterstützt die nicht-invasive Bildgebung zur Bewertung der Bioverteilung von Nanopartikeln und der therapeutischen Wirksamkeit bei Hirntumoren.

Intravenöse Verabreichung von therapeutischen Nanopartikeln in einem murinen Glioblastommodell

Das Video zeigt eine Fluoreszenzbildgebungsmethode für die Lokalisierung von  in vivo Antikörpern in einem Maus-Tumor-Xenotransplantatmodell. Dabei werden Tumorzellen in eine Maus injiziert, um feste Xenotransplantate unter der Haut zu erzeugen. Die anschließende Injektion von fluoreszierenden Antikörpern bestätigt die spezifische Lokalisation durch verstärkte Fluoreszenzsignale innerhalb des Tumor-Xenotransplantats.

In vivo Fluoreszenzbildgebung zur Lokalisierung von Antikörpern in einem Maustumor-Xenotransplantatmodell

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren für die optische Bildgebung Analyse der Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox. Insbesondere wird eine detaillierte Verwendung der Multimode-Bildaufnahmevorrichtung zum Erfassen Tumor-Targeting und Bewertung Tumorpenetration beschrieben.

Gezielte Analyse von viralen Proteins Nanopartikel HER2 + Tumoren Lieferung

Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs ​​(Maroi)-System für die in vivo Quantifizierung einer Fluoreszenzmarkierung von Saposin C (SapC), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles geliefert. Der Einsatz Mausmodellen von Krebs und Arthritis, zeigen wir, wie die Signalkurve Maroi Analyse kann für die genaue Zuordnung und biologische Charakterisierung von Krankheitsprozessen eingesetzt werden.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erforderlich sind, um die ex vivo-Validierung von in vivo Nahinfrarot-Fluoreszenz-Xenotransplantat-Bildgebungsexperimenten an Mäusen unter Verwendung von Fluorophor-markierten Nanobodies und konventionellen Antikörpern durchzuführen.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

Das schlechte Verständnis der In-vivo-Leistung von Nanomedikamenten behindert ihre klinische Umsetzung. Verfahren zur Bewertung des in vivo-Verhaltens von Krebs-Nanoarzneimitteln auf systemischer, Gewebe-, Einzelzell- und subzellulärer Ebene bei tumortragenden immunkompetenten Mäusen werden hier beschrieben. Dieser Ansatz kann Forschern helfen, vielversprechende Krebs-Nanomedikamente für die klinische Umsetzung zu identifizieren.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance von Krebs Nanomedizin

Wir beschreiben ein Protokoll für die präklinische in Vivo Verfolgung von Krebsmetastasen. Es basiert auf einem Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter Kombination von Natrium Iodid Symporter, entdeckt nichtinvasive [18F] Tetrafluoroborate-PET, und ein fluoreszierendes Protein für optimierte ex Vivo Bestätigung. Die Methode ist anwendbar für präklinische in Vivo Zelle tracking über Tumorbiologie.

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Wir stellen einen neuartigen Ansatz für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln an das Glioblastom in einem Mausmodell vor.

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

Die Blut-Hirn-Schranke ist eine große Hürde bei der Bereitstellung von Therapien für das Glioblastom, eine Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Hier berichten wir über eine in vivo bildgesteuerte therapeutische Nanoplattform für Eisenoxid, die diese physiologische Barriere aufgrund ihrer Größe umgehen und sich im Tumor anreichern kann.

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Erfahren Sie die Herstellung und funktionale Charakterisierung pflanzlicher viraler Nanopartikel für Tumor-Targeting und In-vivo-Imaging in Maus-Xenotransplantat-Modellen. Diese Methode ermöglicht präzise Biodistributionsstudien.

Viral Nanopartikel für

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