Intravaskuläre Perfusion von Carbon Black Ink ermöglicht eine zuverlässige Visualisierung der Hirngefäße

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zerebrale Gefäßanatomie von Mäusen auf reproduzierbare Weise zu untersuchen. Zunächst werden die zerebralen Gefäße mit farbigem Latex markiert, um sie später mit der Färbung durch Rußschwarz-Tinte vergleichen zu können. Anschließend werden die Rußschwarz-Tinten gemischt und die Tiere über das linke Ventrikel mit P-B-S-P-F-A und der Rußschwarz-Tintenmischung perfundiert.

Im letzten Schritt wird das Gehirn entnommen und Fotos zur Vergleichs- und Analyse der gefärbten zerebralen Gefäße angefertigt. Abschließend wird die Image-J-Software verwendet, um die Anastomosenstellen zwischen der Arteria cerebri media und der Arteria cerebri anterior zu analysieren. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie zerebrovaskulärer Erkrankungen, insbesondere des Schlaganfalls, da sie zur Analyse der vaskulären Dichte und der Angiogenese eingesetzt werden kann.

Mit dieser Methode lassen sich Einblicke in das vaskuläre System des Gehirns gewinnen; sie kann zudem auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise zur Visualisierung von Mikrogefäßen im Herzen, in der Leber oder in der Niere. Nachdem das Latex mit Rußtinte in einem EP-Röhrchen gemischt wurde, erwärmen Sie die Mischung 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Verwenden Sie eine Nadel mit einer Größe von 23 bis 25 Gauge, um das erwärmte Latex in einer 2-Milliliter-Spritze aufzusaugen.

Lösen Sie anschließend 12,5 Milligramm Papin-Hydrochlorid-Pulver in einem Milliliter steriler Kochsalzlösung auf und geben Sie die erhaltene Lösung nach dem Vortexen in eine Insulinspritze. Brechen Sie danach die Nadel einer weiteren sterilen Insulinspritze ab und setzen Sie die abgetrennte Nadel an das Ende eines 20 Zentimeter langen PE-10-Schlauchs auf. Anschließend wird der PE-10-Schlauch mit der Nadel der Insulinspritze, die die Papin-Hydrochlorid-Lösung enthält, verbunden.

Füllen Sie nun zwei weitere Insulinspritzen mit einem Milliliter Kochsalzlösung und nehmen Sie alle Spritzen zusammen mit den sterilisierten Präparationsinstrumenten vor der Narkotisierung an den Operationsplatz mit. Wiegen Sie die Maus, danach positionieren Sie die kontinuierlich narkotisierte Maus in Rückenlage. Fixieren Sie die Gliedmaßen und schneiden Sie die Haut über der linken Femoralvene auf.

Suchen Sie nun die Vena femoralis und führen Sie die Spitze der Nadel, die mit dem PE-10-Schlauch verbunden ist, ein. Injizieren Sie dann die Papin-Hydrochlorid-Lösung langsam mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 Mikrolitern pro Minute und einer Dosis von 50 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht. Nach der Injektion öffnen Sie die Bauchhöhle und durchstechen anschließend das Zwerchfell.

Danach die Rippen durchschneiden, um das Herz freizulegen, und die absteigende Aorta mit einer Arterienklemme abbinden. Anschließend einen scharfen Schnitt über das rechte Vorherz führen, um das venöse Blut ablaufen zu lassen. Danach zwei Milliliter Kochsalzlösung in den linken Ventrikel injizieren.

Das Vorhandensein von Luft in den Profil-Lösungen oder in der kombinierten Tintenmischung kann zu ungefärbten Gefäßbereichen im Gehirn führen. Überprüfen Sie sorgfältig, ob alle Ihre Spritzen vollständig luftblasenfrei sind, um einen Erfolg sicherzustellen. Geben Sie nun vorsichtig den Inhalt der vorgefüllten Spritzen nacheinander über einen Zeitraum von 18 bis 20 Sekunden zur manuellen Injektion des gefärbten Latex ein und lassen Sie das Tier danach fünf Minuten lang ruhen.

Danach, nachdem das Tier enthauptet wurde, entfernen Sie vorsichtig den Schädelknochen und die Hirnhäute, wobei darauf geachtet werden muss, die Großhirnrinde oder die Gefäßarchitektur nicht zu verletzen, und entnehmen Sie anschließend das gesamte Gehirn sorgfältig. Legen Sie das Gehirn in eine 60 Millimeter große Zellkulturschale, die sechs bis acht Milliliter 4 % PFA enthält, und platzieren Sie ein Maßband unter der Schale, wobei eine an das Operationsmikroskop angeschlossene Kamera verwendet wird. Machen Sie Aufnahmen mit 25-facher Vergrößerung der dorsalen und ventralen Oberflächen des Gehirns im 90-Grad-Winkel zwischen Objektiv des Mikroskops und Petrischale.

Um die ursprüngliche Distanz zu quantifizieren, beginnen Sie die Färbeprozedur mit Rußtinte, indem Sie zwei Aliquots zu je 100 Mikroliter Herts-Stemple-Farba-Tinte oder CB eins mit jeweils zwei Aliquots zu 900 Mikroliter Pelikan-Skript-Schwarz-Tinte oder CB zwei in zwei separaten 1,5-Milliliter-EP-Röhrchen mischen. Sammeln Sie die Tintemischungen in zwei separaten Ein-Milliliter-Insulin-Spritzen. Verschließen Sie anschließend die Spritzen und legen Sie sie zusammen mit zwei weiteren Insulin-Spritzen, die jeweils ein Milliliter Kochsalzlösung enthalten, in ein 37 Grad-Celsius-Wasserbad.

Nach der Behandlung der Maus, wie gerade gezeigt, leichtem Druck ausüben, um beide Lösungen mit kohlenschwarzem Tinte über 18 bis 20 Sekunden pro Milliliter in das linke Ventrikel zu injizieren. Nachdem das Gehirn entnommen und wie eben gezeigt Bilder aufgenommen wurden, das Gehirn über Nacht in 4 % PFA einlegen, gefolgt von einer Inkubation in sukzessive steigenden Konzentrationen von Saccharose, bis das schwimmende Gehirn vollständig untertaucht. Beginnen Sie diesen Schritt mit der Induktion einer transitorischen fokalen zerebralen Ischämie.

Nach einem Standardprotokoll zur intraluminalen Okklusion der Arteria cerebri media wird am Ende der Reperfusionsphase die Gefäßversorgung mit den Farbstoffen CB one und CB two wie gerade gezeigt angefärbt und anschließend das gesamte Gehirn mit einer 2 %igen TTC-Lösung bei 37 Grad Celsius für fünf bis zehn Minuten gefärbt. Zur Identifizierung des Infarctvolumens bleibt der Infarktbereich weiß, während der nicht-ischämische Bereich rot anläuft. Sammeln Sie Bilder wie gerade gezeigt, um die makroskopische Anatomie der zerebralen Gefäße zu analysieren, indem Sie mit der Öffnung eines Bildes der gefärbten Gehirnoberfläche beginnen.

Mit der Bild-J-Software können Gehirne, die mit gefärbtem Latex perfundiert wurden, variable Grade der Gefärfärbung an der ventralen Oberfläche aufweisen. Während die Perfusion mit CB1 plus CB2 alle Gefäße an den ventralen und dorsal en Oberflächen anfärben wird. Stellen Sie den Maßstab in Millimetern ein und markieren Sie die Anastomosepunkte zwischen der Arteria cerebri anterior (ACA) und der Arteria cerebri media (MCA), um eine imaginäre Linie zu erstellen, die alle diese Anastomosepunkte verbindet.

Messen Sie nun den Abstand zwischen der Anastomoselinie und der Mittellinie bei vier und dann bei sechs Millimetern kaudal zur Frontalpole des Gehirns. Nach der Analyse von drei bis vier Bildern pro Tier den Mittelwert berechnen. Die Werte zwischen den verschiedenen Tiergruppen vergleichen, um die Variabilität innerhalb der zerebrovaskulären Anatomie zu identifizieren.

Bei C57BL/6J-Tieren verläuft die Anastomosenlinie zwischen der A. cerebri anterior (ACA) und der A. cerebri media (MCA) vier Millimeter vom frontalen Pol des Gehirns entfernt näher an der Mittellinie als sechs Millimeter vom frontalen Pol entfernt, während apolipoprotein E-Knockout-Mäuse bezüglich dieses Merkmals keinen signifikanten Unterschied aufweisen. Im Gegensatz dazu liegt die Anastomosenlinie bei SV129-Mäusen sowohl vier als auch sechs Millimeter vom frontalen Pol entfernt weiter von der Mittellinie entfernt und verläuft dort paralleler zu dieser, was für die Analyse der vaskulären Anatomie von Bedeutung ist. Unter ischämischen Bedingungen identifizieren Sie die Grenze des Infarkts als den rot- und weißgefärbten Geweberand, der jeweils das metabolisch aktive Gewebe und das nekrotische Gewebe darstellt, und messen Sie den Abstand der Infarktgrenze zur Mittellinie vier Millimeter sowie sechs Millimeter vom frontalen Pol des Gehirns entfernt.

Das hier beschriebene Protokoll überwindet die technischen Einschränkungen der herkömmlichen, auf Latex basierenden Visualisierung der zerebralen Gefäße von Nagetieren. Wie dieses erste Bild nach der Perfusion mit gefärbtem Latex zeigt, werden nur die großen Gefäße auf der ventralen Oberfläche angefärbt, während die gesamte dorsale Oberfläche ungefärbt bleibt. Im Gegensatz dazu führt die Perfusion mit CB eins plus CB zwei zu einer ausreichenden und gleichmäßigen Füllung sowohl der kleinen als auch der großen Gefäße.

Die Färbung ist sieben Tage lang stabil, ohne dass sich die Qualität verändert. Mithilfe des Image-J-Programms kann der Abstand der Anastomosenstellen zwischen der A. CA und der A. MCA zur Mittellinie in allen verschiedenen Mausgruppen analysiert werden, die zur Beurteilung der Unterschiede in der regionalen Gefäßanatomie mit Tinte perfundiert wurden. Obwohl das Ausschalten eines POE die anatomische Struktur der zerebralen Gefäße bei C57BL/6J-Mäusen nicht beeinträchtigt, lässt sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Stämmen C57BL/6J und SV129 feststellen.

In experimentellen Nagetier-Schlaganfallmodellen wird die TTC-Färbung häufig zur Visualisierung des Infarktvolumens verwendet. Die Färbung mit CB eins plus CCB zwei ist ebenfalls unter ischämischen Bedingungen anwendbar, um strukturelle Veränderungen im Gefäßsystem zu beobachten, und zeigt eine hohe Stabilität in Kombination mit der TTC-Färbung. Beachten Sie die gleichzeitige Visualisierung der zerebralen Gefäße und des Infarktvolumens in ischämischen Gehirnen, die durch unterschiedliche Dauer der zerebralen Ischämie und Reperfusionszeitpunkte induziert wurden.

Die Analyse der Anastomosenstellen zwischen der a c und der A. cerebri media nach 45 oder 90 Minuten Ischämie, kombiniert mit einer Reperfusion über einen Tag oder fünf Tage, zeigt, wie erwartet, dass der mittlere Abstand zwischen der Mittellinie und den Anastomosenstellen zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede aufwies. Außerdem lag der mittlere Abstand im gleichen Bereich wie bei nicht-ischämischen Tieren. Der Abstand von der Mittellinie zur Infarktrandzone unterschied sich jedoch signifikant zwischen den Gruppen, was dem zunehmenden Infarktvolumen bei stärkeren Graden der Ischämie-Reperfusionsschädigung entspricht.

Diese Technik könnte dazu beitragen, Forschern auf dem Gebiet des experimentellen Schlaganfalls den Weg zu ebnen, um die Gefäßversorgungsgebiete im Maushirn zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die zerebrovaskuläre Anatomie bei Mäusen untersucht, indem man das Gehirn mit löslichen oder kohlschwarzen Tinten durchspült, und wie man das resultierende angefärbte Hirngewebe mithilfe der Image-J-Software analysiert.