Identifikation der olfaktorischen Flüchtige mittels Gaschromatographie-Multi-unit Recordings (GCMR) im Insect Antennallobus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, biologisch wirksame Geruchsstoffe in komplexen Duftgemischen durch Ableitungen aus dem Gehirn der Hummel zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst verhaltenswirksame Duftgemische gesammelt werden und anschließend das Gaschromatographie- und das Multikanal-Ableitsystem für das Experiment vorbereitet werden. Der dritte Schritt besteht darin, das Gehirn der Hummel für die neuronalen Ableitungen im Antennallobus vorzubereiten und zu präparieren.

Der Versuch wird anschließend durchgeführt, indem die Elektroden in einen Antennenlappen eingeführt werden und die Antworten auf zugegebene flüchtige Substanzen durch Analyse der neuronalen Aktivität auf komplexe Gerüche sowie deren einzelne Bestandteile gemessen werden. Biologisch aktive Geruchsstoffe können mittels Gaschromatographie identifiziert werden. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Verfahren wie G-C-E-A-G liegt somit in der Empfindlichkeit der antennalen Neuronen und der Möglichkeit, zu charakterisieren, wie Neuronen im Gehirn auf spezifische blütenständige flüchtige Verbindungen reagieren.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da kombinierte elektrophysiologische und chemisch-analytische Schritte aufgrund der elektrophysiologischen Präparationstechnik und der erforderlichen Schritte zur Sammlung flüchtiger Substanzen aus der Kopfraumphase schwer zu erlernen sind. Obwohl diese Technik Einblicke in die olfaktorische Verarbeitung von Hummeln ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise Krankheitsüberträger wie Mücken oder Raubwanzen oder Schädlinge von Nutzpflanzen wie Blattläuse oder Motten. Für dieses Verfahren sollte eine Referenzelektrode aus Wolframdraht an einem Mikromanipulator vorbereitet sein.

Mikromanipulatoren verfügen über eine Multikanalelektrode, wie beispielsweise einen aufgewickelten Draht, eine Tede- oder eine Silizium-Multikanalelektrode, die mit einem Vorverstärker verbunden ist und über eine abgeschirmte BNC-Tafel ein Ausgangssignal an ein Gaschromatographiegerät weitergibt. Der Ausgang des GC-Detektors ist mit dem Verstärker und dem Datenerfassungssystem so gekoppelt, dass sowohl die neuronalen Signale als auch die GC-Signale synchronisiert sind. In diesem Beispiel ist das Trägergas der Gaschromatographie Helium und die Säule ist eine DB-5-GC-Säule.

Die GC verwendet einen Split-List-Eingang mit einer Temperatur von 200 Grad Celsius und einen Flammenionisationsdetektor mit einer Temperatur von 230 Grad Celsius. Nachdem die Proben in der GC erhitzt wurden, wird das Eluat aus der Säule mithilfe eines Glas-Y-Stückes im Verhältnis eins zu eins auf den Flammenionisationsdetektor und die B-Antenne verteilt. In diesem Beispiel dient die GC der Übertragung flüchtiger Verbindungen, die mittels dynamischer Absorption aus den Blüten von Mimus Lewis Augenblumen, einer in Kalifornien heimischen alpinen Wildblume, gesammelt wurden.

Alternativ können anstelle der GC einzelne flüchtige Verbindungen oder Gemische von Verbindungen durch Luftstöße zugeführt werden. Diese werden durch eine separate Glas-Spritze geleitet, die ein Stück Filterpapier enthält, auf das die Verbindungen aufgetragen wurden. Die Luftstöße werden mithilfe eines computergesteuerten, elektromagnetisch betätigten Ventils aus einem konstanten Luftstrom abgezweigt.

Beginnen Sie mit den Vorbereitungen, indem Sie etwa einen Zentimeter vom Ende einer 1-mL-Pipettenspitze abschneiden. Platzieren Sie eine Hummel in der Basis der Pipettenspitze und schieben Sie sie vorsichtig bis zum gegenüberliegenden Ende der Spitze, bis nur noch der Kopf hervorschaut. Umschließen Sie den freiliegenden Kopf mit geschmolzenem Zahnwachs, um eine Halterung zu formen.

Das Wachs muss an den Facettenaugen haften, um den Kopf vollständig zu fixieren, darf aber gegebenenfalls nicht mit der Antenne in Kontakt kommen. Verwenden Sie kleine Nadeln, um die Antennen zu immobilisieren. Als Nächstes schneiden Sie mit einer scharfen Klinge, beispielsweise einem Mikroskalpell, eine quadratische Fensteröffnung in die Kopfkapsel.

Schneiden Sie direkt hinter der Antenne und neben einem der zusammengesetzten Augen an. Führen Sie eine gerade Linie zwischen den Augen. Schneiden Sie danach dorsal, bis sich die Kopfkapsel zum Thorax hin krümmt.

Fahren Sie mit dem Schnitt bis zum gegenüberliegenden Ende der Kopfkapsel fort. Schneiden Sie abschließend zurück zum Ausgangspunkt, um das Viereck zu vervollständigen. Entfernen Sie die Cuticula mit einer Pinzette.

Der zur Antenne benachbarte Cuticula muss entfernt werden, da sie der Elektrode im Weg steht, sobald das Gehirn freigelegt ist. Sofort das Gewebe mit Insekten-Salzlösung überfluten. Stellen Sie sicher, dass die Antennenlappen gut freigelegt sind.

Entfernen Sie dann vorsichtig mit einer sehr feinen Pinzette die perineurale Hülle direkt oberhalb der Antennenlappen. Achten Sie darauf, das Gehirn der Biene mit der Pinzette nicht zu verletzen. Die Bienenvorbereitung ist nun bereit für die elektrophysiologische Ableitung.

Befestigen Sie zunächst die präparierte Biene an einer Klammer, die an einer magnetischen Basis befestigt ist. Halten Sie sie mit Insektensalzlösung überflutet, die aus einem Reservoir über einen Durchflussregler zugeführt wird. Führen Sie nun die Referenzelektrode in das kontralaterale Hirngewebe ein.

Als Nächstes führen Sie die Multikanalelektrode in die Antennenlappen der Biene ein. Wenn die Elektroden korrekt positioniert sind, warten Sie 30 bis 60 Minuten, bis die Aufnahmen stabil sind.

Währenddessen bereiten Sie die extrazellulären Spikes von Neuronen durch zusätzliche Schwellenwertbildung vor. Für einzelne Aufnahmekanäle kann eine manuelle Schwellenwertbestimmung erforderlich sein, da in den Aufnahmekanälen Rauschen auftreten kann. Überprüfen Sie anschließend, ob die Temperaturrampe des GC-Laufs korrekt ist.

In diesem Beispiel beginnt die Temperatur bei 50 Grad Celsius für vier Minuten und steigt anschließend um 10 Grad pro Minute auf eine Endtemperatur von 220 Grad Celsius an oder wird sechs Minuten lang gehalten. Wenn die Wellenformen der Einheiten in den Aufnahmekanälen konsistent geworden sind, gelten die neuronalen Aufnahmen als stabil. Sobald die Stabilität erreicht ist, füllen Sie die Spritze mit dem Duft der floralen Kopfraumluft und injizieren den Duft in die Kopfinjektionsöffnung des GC.

Danach sofort mit der Aufzeichnung von den Elektroden beginnen, sobald der GC-Lauf beendet ist. Die Präparation fünf bis 15 Minuten ruhen lassen. Anschließend entweder eine weitere Probe in den GC injizieren oder die Präparation mittels einzelner flüchtiger Verbindungen oder Gemischen von Verbindungen stimulieren.

Falls die spontane Aktivität zu irgendeinem Zeitpunkt plötzlich stoppt oder sich verändert, überprüfen Sie den Salzlösungstropfen und lassen Sie das Präparat 15 Minuten ruhen. Falls die Aktivität danach nicht zu ihrem vorherigen Niveau zurückkehrt, entsorgen Sie das Präparat. Nach dem Experiment fixieren Sie das Gehirn mit den noch im Gewebe befindlichen Sonden, anschließend entnehmen Sie das Gehirn, entfernen das Fixativ und dehydrieren das Gehirn.

Die Positionen der Ableitungskanäle können anschließend mittels konfokaler Mikroskopie anhand des Duftes der Mimulus-Luci-Blüte identifiziert werden. Die Gesamtanzahl flüchtiger Verbindungen wird dabei erfasst. Die GC liegt typischerweise zwischen 60 und 70 Verbindungen.

Der Duft von Mimus Luci setzt sich hauptsächlich aus Monoterpenoiden zusammen, darunter Beta-Myosin und Alpha-Pinen. Der Rest des Duftes besteht aus flüchtigen Sechs-Kohlenstoff-Verbindungen. Mehrere Präparationen wurden mit drei Mikrolitern des Mimus-Lewis-Augen-Extrakts stimuliert.

Diese Aufnahme von einer der acht neuronaleinheiten, die mit der Multikanalelektrode aufgezeichnet wurden, zeigt, wie selektiv ein Neuron auf bestimmte flüchtige Substanzen reagiert. In diesem Beispiel ist Dine die dargestellte Verbindung. Hier sind die Reaktionen von acht neuronaleinheiten.

Etwa die Hälfte des Ensembles reagierte nicht. Dies ist angesichts der Vielfalt flüchtiger Verbindungen, die aus dem Blüten-Kopfraum angedeutet werden, überraschend, stimmt jedoch zwischen den Präparationen überein und wird auch von anderen Studien berichtet. Die normalisierte Feuerrate der reagierenden Einheiten zeigt, dass eine starke Selektivität für eine Gruppe von Geruchsstoffen besteht.

Die durch die Pfeile hervorgehobenen Duftstoffe lösten die stärksten Reaktionen aus. Dabei handelt es sich um Demin und trans-Beta-Osain. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr Insekt für das Experiment vorbereiten und anschließend das Experiment mittels Gaschromatographie mit Mehrkanalaufzeichnung durchführen.

Das Ziel besteht dann darin, in einem komplexen Duftbouquet mutmaßlich verhaltenswirksame Geruchsstoffe zu identifizieren. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Anwendung innerhalb von zwei bis drei Stunden durchgeführt werden. Weitere Methoden, wie beispielsweise Verhaltensprüfungen mit den identifizierten Geruchsstoffen, können durchgeführt werden, um die Wirksamkeit der flüchtigen Substanzen bei der Vermittlung der Verhaltensreaktion des Insekts vollständig zu bestimmen.