Identifikation der olfaktorischen Flüchtige mittels Gaschromatographie-Multi-unit Recordings (GCMR) im Insect Antennallobus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, biologisch wirksame Geruchsstoffe in komplexem Sinne durch Aufzeichnungen im Hummelgehirn zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem erstens der Verhaltenseffektsinn gesammelt und zweitens der Gaschromatograph und die Mehrkanal-Aufzeichnungssysteme für das Experiment vorbereitet werden. Der dritte Schritt besteht darin, das Hummelgehirn für die neuronalen Aufzeichnungen in der Antenne des Fabriklappens vorzubereiten und zu präparieren.

Das Experiment wird dann durchgeführt, indem die Elektroden in den Antennenlappen eingeführt und die Reaktionen auf aufgeblähte flüchtige Stoffe durch Analyse der neuronalen Aktivität als Reaktion auf komplexe Sinne und ihre individuellen Bestandteile gemessen werden. Biologisch aktive Odorstoffe, die durch Gaschromatographie gewonnen werden, können identifiziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Techniken wie G-C-E-A-G ist also die Empfindlichkeit von Antennenlastneuronen und die Fähigkeit, zu charakterisieren, wie Neuronen im Gehirn auf bestimmte florale flüchtige Stoffe reagieren.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine Kombination aus elektrophysiologischen und chemischen Analyseschritten aufgrund der elektrophysiologischen Präparationsaufzeichnungstechnik und der notwendigen Schritte zur Erfassung von flüchtigen Bestandteilen des Kopfraums schwer zu erlernen ist. Obwohl diese Technik Einblicke in die olfaktorische Verarbeitung von Hummeln geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Krankheitsfaktoren wie Mücken oder Kusswanzen oder Pflanzenschädlinge wie Blattläuse oder Motten angewendet werden. Für dieses Verfahren haben wir eine Referenzelektrode aus Wolframdraht an einem Mikromanipulator auf einem zweiten präpariert.

Mikromanipulatoren weisen eine Mehrkanalelektrode auf, wie z. B. einen Spiraldraht, eine Tede oder eine Silizium-Mehrkanalelektrode, die mit einem Vorverstärker verbunden ist, und verfügen über einen Gaschromatographen mit einem Ausgang auf einem abgeschirmten BNC-Tisch. Der Ausgang des GCs-Detektors ist mit dem Verstärker und dem Datenerfassungssystem verbunden, so dass sowohl das neuronale als auch das GC-Signal synchronisiert sind. In diesem Beispiel ist das GC-Trägergas Helium und befindet sich in einer DB-Säule mit fünf GC

Der GC verwendet einen Split-List-Einlass mit einer Temperatur von 200 Grad Celsius und eine Temperatur des Flammenionisationsdetektors von 230 Grad Celsius. Nachdem die Proben im gc erhitzt wurden, wird das Abwasser aus der Säule unter Verwendung eines Glasanschlusses eins zu eins zwischen dem Flammenionisationsdetektor und der B-Antenne aufgeteilt. In diesem Beispiel wird der GC verwendet, um flüchtige Bestandteile zu liefern, die durch dynamische Absorption von Mimus-Lewis-Augenblumen, einer in Kalifornien beheimateten alpinen Wildblume, gesammelt werden.

Alternativ können anstelle des gc auch einzelne flüchtige Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen durch Luftimpulse abgegeben werden. Durch eine separate Glasspritze schießen, die ein Stück Filterpapier enthält, auf dem sich die Verbindungen abgelagert haben. Die Luftimpulse werden mit Hilfe eines magnetisch betätigten Ventils, das von einem Computer gesteuert wird, aus einem konstanten Luftstrom abgeleitet.

Beginnen Sie die Vorbereitungen, indem Sie etwa einen Zentimeter vom Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze abschneiden. Setze eine Hummel in den Ansatz der Pipettenspitze ein und schiebe sie vorsichtig in Richtung des gegenüberliegenden Endes der Spitze, bis nur noch der Kopf freiliegt. Mache mit geschmolzenem Zahnwachs eine Form um den freiliegenden Kopf.

Das Wachs muss an den Facettenaugen haften, um den Kopf vollständig zu fixieren, darf aber bei Bedarf nicht mit der Antenne in Berührung kommen. Verwenden Sie kleine Stifte, um die Antennen zu fixieren. Machen Sie als Nächstes mit einer scharfen Klinge wie einem Mikroskalpell einen quadratischen fensterartigen Schnitt in die Kopfkapsel.

Beginnen Sie mit dem Schneiden direkt hinter der Antenne und neben einem der Facettenaugen. Schneide eine gerade Linie zwischen den Augen. Schneiden Sie dann dorsal, bis sich die Kopfkapsel zum Thorax hin wölbt.

Setze den Schnitt bis zum gegenüberliegenden Ende der Kopfkapsel fort. Zum Schluss an den Anfang zurückschneiden, um das Quadrat zu vervollständigen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Nagelhaut zu entfernen.

Die an die Antenne angrenzende Nagelhaut muss entfernt werden, da sie sonst die Elektrode behindert, sobald das Gehirn freigelegt wird. Verschmelzen Sie das Gewebe sofort mit Insektensalzlösung. Stellen Sie sicher, dass die Antennenkeulen gut freiliegen.

Verwenden Sie dann vorsichtig eine sehr feine Pinzette, um die perineurale Hülle unmittelbar über den Antennenlappen zu entfernen. Sei sehr vorsichtig, dass du das Gehirn der Biene nicht mit der Pinzette durchstichst. Das Bienenpräparat ist nun bereit für die elektrophysiologische Aufzeichnung.

Beginnen Sie damit, die vorbereitete Biene an einer Klemme zu befestigen, die an einem Magnetfuß befestigt ist. Halten Sie es super verschmolzen mit Insektensalzlösung, die aus einem Reservoir mit einem Durchflussregler geliefert wird. Führen Sie nun die Referenzelektrode in das kontralaterale Hirngewebe ein.

Führen Sie dann die Mehrkanalelektrode in die Antennenlappen der Biene ein. Wenn die Elektroden an Ort und Stelle sind. Warten Sie 30 bis 60 Minuten, bis sich die Aufnahmen stabilisiert haben.

Bereiten Sie sich während dieser Zeit auf die extrazellulären Spikes von Neuronen vor, indem Sie auch den Schwellenwert festlegen. Die einzelnen Aufnahmekanäle Für einige Kanäle kann aufgrund eines Rauschens in den Aufnahmekanälen eine manuelle Schwellenwerteinstellung erforderlich sein. Überprüfen Sie als Nächstes, ob die Temperaturrampe des GC-Laufs korrekt ist.

In diesem Beispiel beginnt die Temperatur vier Minuten lang bei 50 Grad Celsius und steigt dann um 10 Grad pro Minute auf eine Endtemperatur von 220 Grad Celsius an, oder sie wird sechs Minuten lang gehalten. Wenn die Wellenformen der Einheiten in den Aufzeichnungskanälen konsistent geworden sind, gelten die neuronalen Aufzeichnungen als stabil. Sobald sich die Spritze stabilisiert hat, befüllen Sie die Spritze mit dem blumigen Headspace-Geruch und injizieren Sie den Geruch in die Kopfinjektionsöffnung des GC.

Beginnen Sie dann sofort mit der Aufzeichnung von den Elektroden, nachdem der GC-Lauf beendet ist. Lassen Sie die Zubereitung fünf bis 15 Minuten ruhen. Injizieren Sie dann entweder eine weitere Probe in die GC oder stimulieren Sie die Präparation mit einzelnen flüchtigen Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen.

Wenn die spontane Aktivität zu irgendeinem Zeitpunkt plötzlich aufhört oder sich ändert, überprüfen Sie den Kochsalztropfen und lassen Sie das Präparat 15 Minuten ruhen. Wenn die Aktivität dann nicht wieder ihr vorheriges Niveau erreicht, verwerfen Sie die Vorbereitung. Fixieren Sie nach dem Experiment das Gehirn mit den Sonden noch im Gewebe, entfernen Sie dann das Gehirn, reinigen Sie das Fixiermittel und dehydrieren Sie das Gehirn.

Die Positionen der Aufnahmekanäle können dann durch konfokale Mikroskopie aus dem mimus Luci Blütenduft identifiziert werden. Die Gesamtzahl der flüchtigen Stoffe wird geplündert. Die GC liegt typischerweise zwischen 60 und 70 Verbindungen.

Der Duft von Mimus Luci besteht überwiegend aus Mono-Terpenoiden, darunter Beta-Myosin und Alpha-Pinin. Der Rest des Duftes setzt sich aus sechs flüchtigen Kohlenstoffen zusammen. Mehrere Präparate wurden mit drei Mikrolitern des Mimus Lewis Augenextrakts stimuliert.

Diese Aufzeichnung von einer der acht neuronalen Einheiten, die von der Mehrkanalelektrode aufgezeichnet werden, zeigt, wie selektiv ein Neuron mit bestimmten flüchtigen Stoffen konkurriert. In diesem Beispiel ist dine die gezeigte Verbindung. Hier sind die Antworten von acht neuronalen Einheiten.

Etwa die Hälfte des Ensembles war nicht ansprechbar. Dies ist überraschend angesichts der Vielfalt der flüchtigen Verbindungen, die aus dem blütenalen Kopfraum angedeutet werden, aber dies ist konsistent zwischen den Präparaten und wird in anderen Studien berichtet. Die normierte Brennrate der responsiven Einheiten zeigt, dass es eine starke Selektivität für eine Gruppe von Odorierstoffen gibt.

Die durch die Pfeile hervorgehobenen Geruchsstoffe lösten die robustesten Reaktionen aus. Dabei handelt es sich um Demine und trans beta osain. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie also ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr Insekt auf das Experiment vorbereiten und dann das Experiment mit Gaschromatographie mit Mehrkanalaufzeichnung durchführen.

Ziel ist es dann, vermeintlich verhaltenswirksame Geruchsstoffe in einem komplexen Bouquet zu identifizieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Andere Methoden, wie z.B. Verhaltenstests mit den identifizierten Geruchsstoffen, können durchgeführt werden, um die Wirksamkeit der flüchtigen Bestandteile bei der Vermittlung der Verhaltensreaktion des Insekts vollständig zu bestimmen.