Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Interaktionspartner von Grab zwei mittels CDNA-Expressionsklonierung und Beobachtung von Veränderungen im grün fluoreszierenden Protein-markierten Grab zwei zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst als erster Schritt eine CDNA-Bibliothek aus bakteriellen Lysaten hergestellt wird. Im zweiten Schritt werden die CDNAs in menschliche embryonale Nierenzellen transfiziert, was zur Expression des Reporterkonstrukts zusammen mit den Genen von Interesse führt.

Anschließend werden die transfizierten Platten am Opera-Mikroskop analysiert, um Veränderungen in der Lokalisation von „Grab zwei“ im Zellverband sichtbar zu machen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-vermittelte Rekrutierung von GFP-markiertem Grab zwei zu Endosomen basierend auf Fluoreszenzmikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu etablierten Methoden wie dem Hefe-Zwei-Hybrid-System besteht darin, dass Interaktionspartner von Grab zwei unter physiologischen Bedingungen identifiziert werden können, wobei die subzelluläre Verteilung der Interaktionspartner berücksichtigt wird.

Auch wenn diese Methode zur Identifizierung der Signaltransduktion durch Grab zwei verwendet werden kann, ist sie ebenfalls auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise auf andere Proteine von Interesse. Die cDNA-Bibliothek wird als einzelne bakterielle Klone in Glycerin-Stämmen bereitgestellt.

In einem 96-Loch-Format unter Verwendung des Re-Ray-Befehls im Picker-Menü des Hudson Rapid Pick Light bakterielle Klone von der Quellplatte aufnehmen und in 1,5 Milliliter LB-Amp in einer 96er-Tiefbrunnenplatte ansiedeln. Die Tiefbrunnenplatten mit einem gasdurchlässigen Siegel verschließen und über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler inkubieren. Am folgenden Tag die Tiefbrunnenplatten, die die Bakterien enthalten, bei 2000 U/min 20 Minuten lang zentrifugieren.

Unter Verwendung von Plattenadaptern in einer Tischzentrifuge das Medium von den Vertiefungen abziehen, wobei das bakterielle Pellet intakt bleibt. Danach die Arbeitsfläche der Tecan Freedom Evo Automatisierungsplattform wie hier gezeigt konfigurieren. Lösungen für die Plasmidpräparation in den Rinnen eins bis fünf verteilen und eine Tieflochplatte auf die Arbeitsfläche stellen.

Stellen Sie einen Mehrfachbrunnenbehälter mit Alucian-Lösung neben die Tiefbrunnenplatte. Laden Sie die Spitzen in die Spitzenracks. Bauen Sie das Vakuummanifold zusammen. Die Plasmid-Bindungsplatte wird in das Manifold eingesetzt und die Plasmid-Filterplatte auf das Manifold gelegt. Resuspendieren Sie die Pellets mit 250 Mikrolitern Lösung 1.

Den Resus-Aufschlämmungspuffer durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Es ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens, sicherzustellen, dass die Pellets vollständig resuspendiert sind. Ein Schüttler kann verwendet werden, falls das Auf- und Abpipettieren die Pellets nicht vollständig resuspendiert.

Nachdem die Pellets vollständig resuspendiert sind, fügen Sie 250 Mikroliter der Lösung zum Lysepuffer hinzu, um die Bakterien aufzulösen. Verschließen Sie die Platte und drehen Sie sie um, um eine vollständige Durchmischung zu ermöglichen. Stellen Sie einen Timer auf zwei Minuten.

Fügen Sie anschließend 350 Mikroliter Lösung drei hinzu, dem Neutralisierungspuffer. Verschließen Sie die Platte und invertieren Sie sie dreimal.

Überführen Sie die bakteriellen Lysate in die Plasmid-Filterplatten. Unter Vakuum fünf Minuten lang ablaufen lassen. Entfernen Sie die Filterplatte und setzen Sie die Bindungsplatte auf den Manifold auf.

Unter Vakuum eine Minute lang abziehen. 500 µL zusätzliches Waschpuffer hinzufügen und zwei Minuten lang unter Vakuum abziehen. 900 µL Waschpufferlösung vier hinzufügen und zwei Minuten lang unter Vakuum abziehen.

Danach 900 Mikroliter Waschpufferlösung vier erneut hinzufügen und 15 Minuten lang Vakuum anlegen. Die DNA-Sammelplatte in das Manifold geben. 100 Mikroliter Eluierpuffer zur Bindungsplatte hinzufügen und zwei Minuten lang inkubieren.

Wenden Sie 10 Minuten lang Vakuum an. Entfernen Sie schließlich die Sammelplatte und messen Sie die DNA-Konzentration mit dem NanoDrop 8,000. Typischerweise kann man mit dieser Methode eine Ausbeute von etwa 100 Nanogramm pro Mikroliter erwarten, um dieses Verfahren zu beginnen.

Nachdem die HEK 293-Zellen trypsinisiert und gezählt wurden, geben Sie mithilfe eines automatischen Dosiergeräts jeweils zwei mal 10 hoch vier Zellen in jede Vertiefung einer Perkin Elmer View-Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zur Transfektion.

Verwenden Sie den automatisierten Flüssigkeitshandler, um in jedem Brunnen einer runden 96-Well-Platte folgende Mischung herzustellen: 100 Nanogramm GFP-Plasmid-DNA mit 100 Nanogramm CD-DNA in 25 Mikroliter serumfreiem Medium. Geben Sie anschließend 25 Mikroliter serumfreies Medium mit 0,5 Mikrolitern Transfectin pro Brunnen hinzu und starten Sie die Zeituhr für 30 Minuten.

Nach 30 Minuten 50 Mikroliter der cDNA-Transfektionsmischung in die Zellen überführen. Verwenden Sie dazu eine schonende Dosiermethode. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um die Bildaufnahme zu beginnen, starten Sie die Opera-Software. Wählen Sie den Konfigurationsreiter und anschließend das 20-fache Objektiv sowie den korrekten Platten-Typ aus. Stellen Sie sicher, dass die Korrekturscheibe am Objektiv auf den richtigen Wert eingestellt ist, um die Fokussierung mit verschiedenen Platten-Typen zu ermöglichen.

Wählen Sie als Nächstes die Mikroskop-Registerkarte aus. Definieren Sie die erste Belichtung als Fite 4 88 Laser und die zweite Belichtung als UV 365 Laser. Aktivieren Sie den UV-Filter bei beiden Belichtungen und weisen Sie die Belichtung zu.

Eins an Kamera eins und Belichtung. Zwei an Kamera zwei. Stellen Sie die Belichtungszeiten auf 800 Millisekunden für die Belichtung eins und auf 40 Millisekunden für die Belichtung ein.

Zwei, Belichtung auswählen, Fokushöhe auf null Mikrometer einstellen. Fokussieren, sobald fokussiert. Kamera eins belichten.

Stellen Sie die Fokusposition ein, um die Belichtungsebene zu optimieren, und klicken Sie auf „Höhe aufnehmen“. Speichern Sie die Belichtungsparameter und wiederholen Sie den Vorgang für die Belichtung. Zwei: Wählen Sie den Reiter „Experimentdefinition“, erstellen Sie ein Layout und ein Unterlayout.

Ziehen und legen Sie das entsprechende Layout, die Belichtung, das Referenzbild, die Schräglage, die Beschneidungsdatei und das Teil-Layout ab. Speichern Sie das Experiment. Wählen Sie den Reiter für automatische Experimente und nehmen Sie Bilder unter normalen Bedingungen auf.

Grab zwei ist in der gesamten Zelle lokalisiert. Nach Stimulation eines Wachstumsfaktor-Rezeptors transloziert es an die Plasmamembran und wird anschließend in Endosomen internalisiert. In dieser Abbildung zeigt das obere Feld CO M sechs Zellen, die vorübergehend mit GFP-Grab zwei transfiziert wurden, und wie erwartet ist die Fluoreszenz in der gesamten Zelle verteilt.

Jedoch verlagert sich bei Zellen, die vorübergehend mit GFP-GRAB2 und dem Zelloberflächenrezeptor EGFR transfiziert wurden, GRAB2 in endosomenähnliche Strukturen, wie in der unteren Abbildung dargestellt. Daher kann bei Anwendung einer genomweiten Bibliothek erwartet werden, dass neuartige GRAB2-bindende Zelloberflächenproteine identifiziert werden können. Diese Methode beschränkt sich nicht auf den Nachweis von Zelloberflächenproteinen.

Beispielsweise induziert das GPA-Protein DYNAMIN zwei, das an der grab zwei-vermittelten Endozytose beteiligt ist, eine Translokation von grab zwei. In diesem Experiment wurde GFP-grab zwei gemeinsam mit DNM zwei in HEC 293T-Zellen transfiziert. Die Umlokalisation von GFP-grab zwei zu endosomenähnlichen Strukturen wird durch die Zellen innerhalb der roten Kreise veranschaulicht.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die Immunpräzipitation oder biochemische Assays verwendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die Interaktion direkt oder indirekt ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mittels Expressionsklonierung subzelluläre Proteininteraktionen identifiziert werden können.