Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Identifizierung von Interaktionspartnern von Grab zwei durch CD NA-Expression, Klonierung und Beobachtung von Veränderungen im grün fluoreszierenden Protein, das mit Grab zwei markiert ist. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt zunächst eine CD-NA-Bibliothek aus bakteriellen Lysaten hergestellt wird. Die CDNAs werden in menschlichen embryonalen Nierenzellen transfiziert, was zur Expression des Reporterkonstrukts zusammen mit den interessierenden Genen führt.

Als nächstes werden die transfizierten Platten am Opernmikroskop analysiert, um Veränderungen in der Grab-2-Lokalisation in den Zellen sichtbar zu machen. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-vermittelte Rekrutierung von GFP zeigen. Nehmen Sie zwei bis Endosomen basierend auf der Fluoreszenzmikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie diesen beiden Hybriden besteht darin, dass die Interaktionspartner von Griff zwei in einer physiologischen Situation identifiziert werden können, die die subzelluläre Verteilung der Interaktionspartner berücksichtigt.

Nun, diese Methode kann jedoch verwendet werden, um die Signaltransduktion durch Grab zwei zu identifizieren. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf andere Proteine von Interesse. Der CDNA-Bibliothek wird ein einzelner bakterieller Klon in Glycerinaktien zur Verfügung gestellt.

In einem 96-Well-Format mit dem Befehl re ray im Auswahlmenü der Hudson Rapid Pick-Leuchte. Entnehmen Sie die bakteriellen Klone von der Quellplatte und impfen Sie sie in einer 96-Deep-Well-Platte in 1,5 Milliliter lb Amp. Verschließen Sie die Deep-Well-Platten spät mit einer gasdurchlässigen Versiegelung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Shaker. Am nächsten Tag drehen Sie die Deep-Well-Platten mit den Bakterien A 2000 U/min für 20 Minuten.

Mit Hilfe von Plattenadaptern in einer Tischzentrifuge wird das Medium aus den Vertiefungen abgesaugt, wobei das Bakterienpellet intakt bleibt. Konfigurieren Sie als Nächstes das Deck der Tecan Freedom Evo Automation Workstation wie hier gezeigt. Verteilen Sie die Lösungen für die Plasmidvorbereitung in die Tröge eins bis fünf und stellen Sie eine Deep-Well-Platte auf das Deck.

Setzen Sie einen Multi-Well-Trog mit alucianischer Lösung neben den Deep-Well-Plattenladespitzen in die Tip-Racks ein. Montieren Sie den Vakuumverteiler. Die Plasmidbindungsplatte wird innerhalb des Verteilers platziert und die Plasmidfilterplatte wird auf den Verteiler gelegt. Resus-Suspensionspellets mit 250 Mikrolitern Lösung eins.

Der Resus-Suspensionspuffer wird durch Auf- und Abpipettieren verwendet. Die Sicherstellung, dass die Pellets vollständig resuspendiert werden, ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Ein Schüttler kann verwendet werden, wenn ein Auf- und Abstreicheln das Pellet nicht vollständig resuspendiert.

Sobald die Pellets vollständig resuspendiert sind, legen sich die Bakterien ab, indem sie 250 Mikroliter Lösung zum Lysepuffer hinzufügen. Verschließen Sie die Platte und drehen Sie sie um, um ein vollständiges Mischen zu ermöglichen. Stellen Sie einen Timer auf zwei Minuten.

Fügen Sie als nächstes 350 Mikroliter Lösung drei hinzu. Der Neutralisationspuffer. Versiegeln Sie die Platte und kehren Sie drei Linien um.

Übertragen Sie die bakteriellen Lysate auf die Plasmidfilterplatten. Wenden Sie fünf Minuten lang ein Vakuum an. Entfernen Sie die Filterplatte und setzen Sie die Bindeplatte auf den Verteiler.

Wenden Sie eine Minute lang ein Vakuum an. Fügen Sie 500 Mikroliter zusätzlichen Waschpuffer hinzu und vakuumieren Sie zwei Minuten lang. Fügen Sie 900 Mikroliter Waschpufferlösung hinzu und vakuumieren Sie zwei Minuten lang.

Fügen Sie danach erneut 900 Mikroliter Waschpufferlösung hinzu und vakuumieren Sie 15 Minuten lang. Platzieren Sie die DNA-Sammelplatte in dem Verteiler. Geben Sie 100 Mikroliter Elucian-Puffer in die Bindeplatte und inkubieren Sie zwei Minuten lang.

10 Minuten lang Vakuum anwenden. Entfernen Sie abschließend die Entnahmeplatte und messen Sie die DNA-Konzentration mit dem NanoDrop 8.000. Typischerweise kann bei dieser Methode eine Ausbeute von etwa 100 Nanogramm pro Mikroliter erwartet werden, um dieses Verfahren zu beginnen.

Nach hec 2 9 3 werden die Zellen trypsiert, inisiert und gezählt. Verwenden Sie einen automatischen Spender, um zweimal 10 zu den vier Zellen in jede Vertiefung eines Perkin Elmer zu dosieren. View-Platte: Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für die Transfektion.

Verwenden Sie den automatisierten Liquid Handler, um die folgende Mischung in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und 100 Nanogramm GFP zuzubereiten. Entnehmen Sie zwei Plasmid-DNA mit 100 Nanogramm CD NA in 25 Mikrolitern serumfreiem Medium. Fügen Sie dann 25 Mikroliter serumfreies Medium mit 0,5 Mikrolitern hinzu, transfizieren Sie es pro Well-Mischung und starten Sie den Timer für 30 Minuten.

Nach 30 Minuten werden 50 Mikroliter an der CDNA transfect in mix auf die Zellen übertragen. Mit einer schonenden Dosiermethode. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, starten Sie die Opera-Software. Wählen Sie die Registerkarte Konfiguration und wählen Sie das 20-fache Ziel und den richtigen Plattentyp aus. Stellen Sie sicher, dass der Kragen auf dem Objektiv auf den richtigen Wert eingestellt ist, um die Fokussierung mit verschiedenen Plattentypen zu ermöglichen.

Wählen Sie anschließend die Registerkarte Mikroskop. Definieren Sie die erste Belichtung als fite 4 88 Laser und die zweite Belichtung als UV 365 Laser. Aktivieren Sie den UV-Filter bei beiden Aufnahmen und weisen Sie die Belichtung zu.

Eins zur Kamera, eins und Belichtung. Zwei für Kamera zwei. Stellen Sie die Belichtungszeiten auf 800 Millisekunden für die Belichtung, eine und 40 Millisekunden für die Belichtung ein.

Zwei, wählen Sie die Belichtung, stellen Sie die Fokushöhe auf null Mikrometer ein. Wählen Sie den Fokus aus, sobald Sie fokussiert sind. Belichtung der Kamera eins.

Passen Sie die Fokushöhe an, um die Belichtungsebene zu optimieren, und klicken Sie auf Höhe nehmen. Speichern Sie die Belichtungsparameter, wiederholen Sie den Vorgang für die Belichtung. Zweitens: Wählen Sie die Registerkarte "Experimentdefinition" aus, erstellen Sie ein Layout und ein Unterlayout.

Ziehen Sie das relevante Layout, die Belichtung, das Referenzbild, die Neigung, die Zuschneidedatei und das Unterlayout per Drag & Drop. Speichern Sie das Experiment. Wählen Sie die Registerkarte "Automatisches Experiment" und nehmen Sie Bilder unter normalen Bedingungen auf.

Grab zwei ist in der gesamten Zelle lokalisiert. Nach Stimulation eines Wachstumsfaktorrezeptors transloziert es zur Plasmamembran und wird anschließend in Endosomen internalisiert. In dieser Abbildung zeigt das obere Bild sechs Zellen von CO M, die transient mit GFP-Griff zwei transfiziert wurden, und wie erwartet ist die Fluoreszenz über die gesamte Zelle verteilt.

In Zellen, die transient mit GFP grab two transfiziert wurden, verlagert sich jedoch der Zelloberflächenrezeptor IT EGFR grab two in endosomenähnliche Strukturen, wie in der unteren Abbildung gezeigt. Daher kann bei der Anwendung einer genomweiten Bibliothek erwartet werden, dass neuartige Grab-Two-bindende Zelloberflächenproteine identifiziert werden können. Diese Methode ist nicht auf den Nachweis von Zelloberflächenproteinen beschränkt.

Zum Beispiel induziert das DYNAMIN two des GPA, das an der Grab 2-vermittelten Endozytose beteiligt ist, eine Translokation von Griff zwei. In diesem Experiment wurde GFP-Grab zwei mit DNM zwei in HEC 2 93 T-Zellen transfiziert. Die Verlagerung des GFP-Greifers zwei in endosomenähnliche Strukturen wird durch die Zellen innerhalb der roten Kreise verdeutlicht.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunpräzipitation oder biochemische Assays verwendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, z. B. ob es sich um eine direkte oder indirekte Interaktion handelt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Klonen von Expressionen verwenden können, um subzelluläre Proteininteraktionen zu identifizieren.