Name: Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Interaktionspartner von Grb2 durch cDNA-Expression-Cloning und hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie in HEK293-Zellen identifizieren. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung subzellulärer Proteinlokalisationen.

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Diese Arbeit wurde von der Medical Research Council und der Marie-Curie International Reintegration Grants Schema (zum JKV) unterstützt.

Ein. Picking cDNA Expression Clones <ol><li> Die cDNA-Bibliothek wird als einziges Bakterienklone in Glycerinstammkulturen in einer 96-Well-Format bereitgestellt. Verwendung des Rearray Befehl im Menü des Picker Norgen CP7200, Pick Bakterienklone von der Quelle Platte und Inokulat in 1,5 ml LB / amp in einer 96-Deepwell (1 ml well) Platte. </li><li> Verschließen Sie die Deepwell-Platten mit einer gasdurchlässigen Dichtung und über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker. </li></ol> 2. Herstellung von cDNA-Expressionsbibliothek <ol><li> Drehen Sie die Deepwell-Platten, die die Bakterien bei 2.000 rpm für 20 min mit Platte Adapter in einer Tischzentrifuge. </li><li> Absaugen Medien aus dem Brunnen, verlassen das Bakterienpellet intakt. </li><li> Konfigurieren des Deck des Laborautomatisierung Arbeitsstation wie in Abbildung 2 dargestellt. Lösungen für Plasmid Herstellung sind in Tröge 1-5 verteilt und die Deepwell Platte auf dem Deck angeordnet ist. Mehrgefässanordnung Trog mit Elutionslösungplatziert ist benachbart zum Deepwell Platte. Trinkgelder sind in den Spitzenracks geladen. </li><li> Montieren Sie die Vakuumkammer. Das Plasmid Bindungsplatte ist im Inneren des Verteilers angeordnet ist und das Plasmid Filterplatte wird auf der Oberseite des Verteilers angeordnet. </li><li> Resuspendieren Pellets mit 250 ul Lösung 1 (Resuspensionspuffer) durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Lyse der Bakterien durch Zugabe von 250 ul Lösung 2 (Lysepuffer). Die Platte ist abgedichtet und invertiert, um vollständiges Mischen zu ermöglichen. </li><li> Start 2 min Timer. </li><li> Fügen Sie 350 ul Lösung 3 (Neutralisation Puffer). Verschließen Sie die Platte und invertieren 3 mal. </li><li> Übertragen Sie die Bakterienlysate den Plasmid Filterplatten. </li><li> Bewerben Vakuum 5 min. </li><li> Filterscheibe entnehmen und platzieren Sie die Bindungsplatte auf dem Verteiler. Bewerben Vakuum für 1 min. </li><li> Fügen Sie 500 ul zusätzliche Wäsche (AW) Puffer. </li><li> Bewerben Vakuum für 2 min. </li><li> Fügen Sie 900 ul Waschpuffer Solution 4. Bewerben Vakuum für 2 min. </li><li> Wiederholen step 2,14. Anwenden Vakuum für weitere 15 min. </li><li> Zeigen DNA Klingelbeutel innerhalb des Verteilers. Fügen Sie 100 ul Elutionspuffer auf die Bindungs-und inkubieren für 2 min. </li><li> Vakuum für 10 min. </li><li> Entfernen Klingelbeutel und messen DNA-Konzentration mit dem Nanodrop 8000. Typischerweise wird eine Ausbeute von ~ 100 ng / ul können mit dieser Methode zu erwarten. </li></ol> 3. Zellaussaat <ol><li> HEK293-Zellen werden trypsiniert und gezählt. </li><li> 2 x 10 4 Zellen in jede Vertiefung einer PerkinElmer Viewplate mit dem ThermoFisher 96-well Multidrop verzichtet. </li><li> Die Zellen werden über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 4. Transfektion <ol><li> Vorbereiten einer Mischung aus 100 ng GFP-Grb2 Plasmid DNA mit 100 ng der cDNA in 25 ul serumfreiem Medium pro Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte. </li><li> Fügen Sie 25 ul Serum-freie Medien mit 0,5 ul Transfectin pro Vertiefung. </li><li> Vermischen und Timer-for 30 min. </li><li> Übertragen 50 ul cDNA / Transfectin Mix, um Zellen mit einem sanften Dosierung. Alternativ kann die erste Transfektionsgemisch zu Platten verzichtet werden und dann Zellen zugegeben oben (umgekehrter Transfektion). </li><li> Inkubieren Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 5. Image Acquisition <ol><li> Starten Sie Opera Software. Ein Bildschirm-Schnappschuss des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 3 dargestellt. Wählen Sie die Registerkarte &quot;Konfiguration&quot; und wählen 20x-Objektiv und die richtige Plattentyp. Stellen Sie sicher, &quot;Kragen&quot; ist auf den korrekten Wert am Ziel gesetzt, für die Fokussierung mit verschiedenen Plattentypen ermöglichen. </li><li> Wählen Sie das &quot;Microscope&quot; tab. Definieren Exposition 1 als FITC (488 Laser) und Belichtung 2 als UV (365 Laser). Aktivieren Sie die UV-Filter auf beiden Belichtungen und weisen Exposition 1 auf die Kamera 1 und Exposition 2 zur Kamera 2. Set Belichtungszeiten bis 800 ms für die Exposition 1 und 40 ms für die Exposition 2. </li><li> Wählen Sie das &quot;Microscope&quot; tab. Definieren Sie exposure 1 als FITC (488 Laser) und Belichtung 2 als UV (365 Laser). Aktivieren Sie die UV-Filter auf beiden Belichtungen und weisen Exposition 1 auf die Kamera 1 und Exposition 2 zur Kamera 2. Set Belichtungszeiten bis 800 ms für die Exposition 1 und 40 ms für die Exposition 2. </li><li> Wählen Belichtung 1. Setzen Sie den Fokus Höhe auf 0 um. Wählen Sie &quot;Focus&quot;. Sobald konzentriert, setzen Kamera 1. Stellen Sie den Fokus Höhe, um den Belichtungsebene optimieren und klicken Sie auf &quot;Take Höhe&quot;. Ändern der Belichtungszeiten und Laserleistung auf einen maximalen Pixelintensität ~ 3.000 zu ergeben. Speichern Expositionsparameter. Wiederholen Sie für die Exposition 2. </li><li> Wählen Sie &quot;Experiment Definition&quot;. Neues Layout und sublayout. Ziehen Sie die entsprechenden Layout, Belichtung, Referenzbild, skewcrop Datei und sublayout. Speichern Experiment. </li><li> Wählen Sie &quot;Automatisch Experiment&quot; Registerkarte und Bilder aufzunehmen. </li></ol> 6. Image Analysis (auf ImageJ 1.46h-Version.) <ol><li> Konvertieren Sie die proprietären PerkinElmer. Flex Dateien Tagged Image Format. Tif-Datei mit demFlex2Volocity Acapella Skript. </li><li><ol><li> Importieren Bilder in ImageJ als Bildsequenz, was zu einem Stapel. </li><li> Wandeln Sie den Stapel in einem 2-Kanal-HyperStack, indem Sie die Image / HyperStack / Stack zu HyperStack Menüpunkt. Die Anzahl der Scheiben müssen zur Hälfte des eingeführten Stapel eingestellt werden. </li><li> Duplizieren Sie die GFP-Kanal mit dem Bild / Befehl Duplizieren: kreuzen Sie das Doppelte HyperStack Checkbox und geben Channels: 1-1. Jenseits verwenden vervielfältigt Stapel. </li></ol></li><li> Wählen Sie Process / Enhance Contrast mit 0,01% gesättigte Pixel, mit Stapel-Histogramm und konvertieren zu 8 Bit mit Image/Type/8-bit. </li><li> Definieren Sie eine 15 Pixelradius lokale adaptive Segmentierung mit den Bernsen Algorithmus mit Kontrastschwelle (Parameter 1) q = 30. Kreuzen Sie die Weiße Objekte auf schwarzem Hintergrund Checkbox in der Bild / Anpassen / Auto Local Threshold-Menü. </li><li> Segmentation Qualitätskontrolle: Erzeugung segmentierter Objektkontur Overlay auf den Originalbildern. </li><li> Feature Extraktion durch Analyse von Partikeln: Messbereich, Mittelwert und insgesamt Intensität jeder Organelle. Ergebnis speichern Dateien. </li><li> Öffnen Sie die Eigenschaften ergeben Datei in R und erzeugen ein Histogramm. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Unter normalen Bedingungen Grb2 wird während der gesamten Zelle lokalisiert. Bei Stimulierung eines Wachstumsfaktor-Rezeptors ist transloziert zur Plasmamembran und anschließend in Endosomen internalisierten wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Expression eines Zelloberflächen-Rezeptor binden kann Grb2 ist ausreichend, um die Translokation zu induzieren. In einem typischen Experiment Screening, wird keine Änderung in GFP-Grb2 Körperregion beobachtet. Wenn jedoch ein Protein exprimiert wird, dass ein Grb2 Rekruten subzelluläre Ort, gibt es eine Änderung in der Lokalisierung, die leicht sichtbar gemacht werden kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Zum Beispiel werden die Expression der EGFR führt Relokalisation von GFP-Grb2 um Endosom Strukturen (Abbildung4). Wenn somit Anwenden einer Genom-weiten Bibliothek, kann erwartet werden, dass neuartige Grb2-bindende Zelloberflächenproteine ​​identifiziert werden kann. Dieses Verfahren ist nicht auf die Detektion von Zelloberflächenproteinen begrenzt. Zum Beispiel induziert Dynamin2 eine Änderung in sub-zelluläre Lokalisation von GFP-Grb2 Anzeige Endosom-like Rekrutierung (Abbildung 5). Dynamin2 bindet an das C-terminale SH3-Domäne von Grb2 und in Endozytose dieses Komplexes 9,10 beteiligt. Somit ermöglicht dieser Ansatz die allgemeine Identifizierung von Protein-bindenden Komplexe und ist nicht auf die Identifikation der Interaktionspartner für die SH2-Domäne begrenzt. Mehrere verschiedene Typen von Translokation kann wie Lokalisierung zur Plasmamembran zu erwarten ist, um Endosomen anderen cytoplasmatischen vesikulären Strukturen oder den Zellkern. Daher ist es empfehlenswert, dass alle Bilder auch von Auge inspiziert. Allerdings, wenn Screening großer Mengen von cDNAs eine automatisierteBildanalyse-Algorithmus ist praktischer. In diesem Fall ist eine Kombination der Algorithmen wünschenswert, wie beispielsweise Winkel-Erkennung, um Endosomen Cytoplasma / Kern Detektion identifizieren nuklearen pendelt und allgemeinen morphologischen Algorithmen identifizieren, um zelluläre Formänderungen identifizieren. Die Verwendung dieser unterschiedlichen phänotypischen Nachweisverfahren hat an anderer Stelle 11 diskutiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Das Experiment Angaben eine komplette High-Content-Screening Workflow beginnend mit der Amplifikation und Präparation der cDNA-Bibliothek, die Transfektion von cDNA-Vektoren sowie Reporterkonstrukte, Bildaufnahme und Bildauswertung unter Verwendung des freien offenen Software imagej. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> FBBILDUNG 2. Konfiguration der Tecan Deck. (1) Auf der linken Seite, müssen fünf 100 ml Tröge mit Puffer 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) und A4 (100 ml) gefüllt. Trough A4 müssen einmal während des Verfahrens wieder gefüllt. (2) Der Vakuumverteiler an Position 14 in diesem Beispiel befindet. (3) Der Deepwell Platte mit bakteriellen Pellets auf Position 30, neben dem Elutionspuffer Trog mit 25 ml Elutionspuffer befindet. (4) Einweg-Tips für den 8-Kanal-Kopf müssen in den Spitzenracks auf der linken Seite und Tipps für die Mehrkanal-Kopf geladen werden müssen, auf Position 40 gefüllt werden. Die Tecan FreedomEvo Liquid Handler, die in diesem Experiment verwendet wird, wird mit 500 ul Spritzen ausgestattet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> Abbildung3. Automatisierung der Bildaufnahme über die Opera LX. A) Wählen Sie die Registerkarte Konfiguration (1). Aktivieren die Laserlinien zum Versuch (2) erforderlich. Wählen Sie die Kameras zur Bildaufnahme (3). Wählen des plattenförmigen und die Objektivlinse für das Experiment (4). B) Wählen Sie das Mikroskop Registerkarte (1). Definieren Sie die Lichtquelle und die Belichtungszeit für die Exposition 1 (2,3). Konzentrieren Sie sich auf ein gut und nehmen Höhe (4). C) Wählen Sie das Experiment Registerkarte Definition (1). Drag &amp; Drop Belichtung, skewcrop, Referenz, Layout und sublayout Dateien (2). Drag &amp; Drop das Experiment Datei (3). D) Wählen Sie Automatische Experiment (1). Drag &amp; Drop Experiment Datei (2). Bereitstellung angemessener Barcode (3). Starten Bildaufnahme, indem Sie auf die Start-Taste (4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 4. GFP-Grb2-Translokation durch cDNA Ausdruck. GFP-Grb2 zieht aus einem überwiegenden cytoplasmatische Lokalisation an Endosom-ähnliche Strukturen auf Überexpression eines Transmembran Wachstumsfaktor-Rezeptor internalisiert und anschließend um Endosomen. Auf der linken Seite sind Mikroskopie-Aufnahmen von COS M6 Zellen gezeigt, dass wurden transient mit GFP-Grb2 (oben) oder GFP-Grb2 und EGFR (unten) transfiziert. Co-Expression von EGFR den Ergebnissen bei der Verlagerung von GFP-Grb2 um Endosom-ähnlichen Strukturen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiel cDNA-induzierte Translokation von GFP-Grb2. Die GTPase Dynamin2, die in Grb2 Endocytose beteiligt ist, verlagert, um GFP-Grb2 Endosom Strukturen (eingekreist). In diesem Experiment wurde GFP-Grb2 mit DNM2 in HEK293T-Zellen co-transfiziert. Die Zellen wurden mit Hoechst 33342 gefärbt nach 24 h und Bilder auf dem Ope erworben wurdenra LX. Einem Sichtfeld des grünen (GFP) Kanal und der UV (blau; Hoechst 33342) angezeigt wird.

<ol><li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li>
<li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr%2FAbl+and+epidermal+growth+factor+receptor%3A+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li>
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<li>Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789%2C+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Expressionsklonierung ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das in der Vergangenheit verwendet wurde, um neuartige zellulären Komponenten wie Viren Rezeptoren und Blutzellen-Antigene 12 identifizieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die Identifikation von neuartigen putativen Signaltransduktion Rezeptoren binden, die Grb2 erleichtern. Es gibt ein paar wichtige Schritte im Protokoll. <ol><li> Für die automatisierte Plasmidpräparation ist es unbedingt erforderlich, um eine vollständige Resuspension des Bakterienpellet haben. Manchmal ist es notwendig, eine rigorose Schüttelschritt oder weitere Vermischung mit Pipetten umfassen. </li><li> Bei der Zugabe der Lösung 2 und 3, vollständige Vermischung notwendig und wir haben herausgefunden, dass der versiegelte manuell invertierenden Platte effizienter ist als die Verwendung eines automatisierten Schüttler ist. Pipettiervorrichtung sollte in diesem Schritt vermieden werden, da sie auf Scherung der DNA führen würde. </li><li> In allen Vakuumöffnungen Schritte, muss man sicherstellen, dass die Flüssigkeit vollständig entwässertvon der Platte. Ansonsten niedrigen Renditen zu erwarten sind. </li><li> Bei der Elution, ist es durchaus üblich, dass Eluat Form an der Unterseite des Plasmids Bindungsplatte abfällt. Diese Tropfen müssen in der Elution Platte gesammelt werden, so empfiehlt es sich, dass das Plasmid Bindungsplatte sorgfältig und hob alle restlichen Tropfen an der Unterseite sorgfältig zu dem Eluat Platte übertragen. </li><li> Während der Transfektion, ist die Zeit der Komplexbildung kritisch. Wir gehen normalerweise in 20-30 min halten. Längere Zeiten bis zu 1 h sind ohne Verringerung der Ausbeute in Ordnung, während kürzere Zeiten nicht empfohlen. </li><li> Für die Mikroskopie, ist die Wahl der Vergrösserung wichtig. Auf der Opera LX hier verwendete System ist die Auflösung bei 20x ausreichen, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Wenn Bilder mit höherer Auflösung erforderlich sind, das Ziel verändert werden kann, sondern um statistisch signifikante Anzahl von Zellen zu erhalten, werden eine größere Anzahl von Feldern und höheren Erfassungszeiten erforderlich. Im Allgemeinen streben wirauf mindestens 100 Zellen pro Vertiefung erhalten abgebildet. </li></ol> Der Assay wurde Grb2 Translokation von anderen Gruppen verwendet worden, um kleine Moleküle als Inhibitoren von EGFR-Kinase-Aktivierung 6 identifizieren. In diesem Fall wird die EGFR spezifisch mit Ligand Bewirken Rekrutierung von Grb2 zur Plasmamembran aktiviert. Disruption dieser Interaktion kann dann untersucht mit kleinen Molekülverbindungen werden. Ebenso kann vorgesehen sein, dass siRNA Screens eingesetzt werden können, um endogene Gene EGFR-Signalgebung Grb2 oder andere Grb2-bindenden Wachstumsfaktor-Rezeptoren, wie c-KIT oder Erythropoietin-Rezeptor beteiligt identifizieren. Somit gibt es mehrere mögliche Anwendungen für diese Technik. Ein analoger Ansatz könnte auf GFP-markierten Reporter für andere Adapter Moleküle wie Shc, Gab oder IRS angewendet werden. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung dieser zellbasierten Assay in Säugetierzellen ist, dass sie die Identifizierung von physiologisch rel ermöglichtvanten Interaktionen. Der Test ist ein Messwert für Protein-Komplex Bildung, aber noch wichtiger ist, die relevanten Wechselwirkungen an der richtigen subzellulären Ort überwacht. Diesbezüglich überwindet diese Technik Artefakte aus anderen Protein-Protein-Wechselwirkung Methoden wie Hefe-Zwei-Hybrid-oder in vitro-Assays. Es sollte allerdings angemerkt werden, dass indirekte Wechselwirkungen könnten auch Grb2 Einstellung führen. Ebenso kann die transkriptionelle Hochregulation von Bindungspartnern von cDNA-Expression induziert werden. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, ist es erforderlich, die entsprechenden sekundären Assays durchzuführen, um zwischen direkter und indirekter Bindung Wirkungen unterscheiden. Abschließend verspricht der GFP-Adaptormolekül Translokation Assay hohes Potenzial für genomweite Screening und Wirkstoffsuche Anwendungen.

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> cDNA-Bibliothek </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + Amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gasdurchlässigen Dichtungen </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin 96 Plasmid Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625,4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Freedom Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Mit Vakuum-Verteiler </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opera LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

ein high-content-imaging workflow grb2 signaling-komplexe durch expression cloning studie

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signaltransduktion durch Wachstumsfaktor-Rezeptoren ist wesentlich für Zellen zur Proliferation und Differenzierung zu halten und erfordert eine strenge Kontrolle. Signaltransduktion wird durch Bindung eines Liganden an einen externen Transmembranrezeptor und Aktivierung der nachgeschalteten Signalkaskaden initiiert. Ein wesentlicher Regulator von mitogener Signalgebung ist Grb2, eine modulare Protein eines internen SH2 (src-Homologie 2)-Domäne durch zwei SH3-Domänen, die enzymatische Aktivität fehlt flankiert zusammengesetzt. Grb2 konstitutiv mit der GTPase son-of-Sevenless (SOS) über seine N-terminale SH3-Domäne verbunden. Die SH2-Domäne von Grb2 bindet an Rezeptoren der Wachstumsfaktoren an phosphorylierte Tyrosinreste damit Kopplung Aktivierung des Rezeptors an die SOS-Ras-MAP-Kinase-Signalkaskade. Darüber hinaus haben weitere Rollen für Grb2 als positiver oder negativer Regulator der Signalisierung und Rezeptorendozytose beschrieben worden. Der modulare Aufbau der Grb2 legt nahe, dass es zu einer Vielzahl von Rezeptoren und Transduktion andockene signalisiert entlang einer Vielzahl verschiedener Wege 1-3. Beschrieben ist hier eine einfache Mikroskopie Assay, Rekrutierung von Grb2 überwacht an der Plasmamembran. Es ist aus einem Assay, der Änderungen in subzellulären Lokalisation von grün-fluoreszierende Protein (GFP)-tagged Grb2 in Reaktion auf einen Reiz 4-6 misst angepasst. Plasmamembran-Rezeptoren, wie Grb2 aktiviert Epidermal Growth Factor Receptor binden (EGFR) Rekrutenschule GFP-Grb2 zur Plasmamembran auf cDNA-Expressions und anschließend endosomalen Kompartimenten in der Zelle zu verlagern. Um in vivo-Protein-Komplexe von Grb2 identifizieren, kann diese Technik verwendet, um eine genomweite High-Content-Bildschirm auf Veränderungen in Grb2 subzelluläre Lokalisation basierend auszuführen. Die Herstellung von cDNA-Expressionsbibliothek Klone, Transfektion und Bildaufnahme werden im Folgenden ausführlich beschrieben. Im Vergleich zu anderen Methoden verwendet werden, um genomische Protein Interaktionspartner zu identifizieren, wie zB Hefe-Zwei-hybrid erlaubt diese Technik die Visualisierung von Proteinkomplexen in Säugerzellen im subzelluläre Ort der Interaktion mittels Mikroskopie-basierten Assay. Daher beide qualitativen Merkmale wie Muster der Lokalisierung kann beurteilt, sowie die quantitative Stärke der Wechselwirkung werden.

Ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung von neuartigen Signalisierung zuständigen Transmembranrezeptoren beschrieben. Diese Methode ist zugänglich für großflächige Automatisierung und ermöglicht Vorhersagen über<em&gt; In vivo</em&gt; Proteinbindung und die sub-zelluläre Lokalisation von Protein-Komplexen in Säugetierzellen.

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Die Signaltransduktion durch Wachstumsfaktorrezeptoren ist für die Aufrechterhaltung der Proliferation und Differenzierung von Zellen essenziell und erfordert eine präzise Steuerung. Signal ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Interaktionspartner von Grab zwei mittels CDNA-Expressionsklonierung und Beobachtung von Veränderungen des mit grün fluoreszierendem Protein markierten Grab zwei zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst als erster Schritt eine CDNA-Bibliothek aus bakteriellen Lysaten hergestellt wird. Im zweiten Schritt werden die CDNAs in humane embryonale Nierenzellen transfiziert, was zur Expression des Reporterkonstrukts zusammen mit den Genen von Interesse führt.Anschließend werden die transfizierten Platten am Opera-Mikroskop analysiert, um Veränderungen in der Lokalisation von Grab2 in den Zellen sichtbar zu machen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-vermittelte Rekrutierung von GFP-markiertem Grab2 zu Endosomen basierend auf der Fluoreszenzmikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie dem Hefe-Zwei-Hybrid-System besteht darin, dass Interaktionspartner von Grab2 unter physiologischen Bedingungen identifiziert werden können, wobei die subzelluläre Verteilung der Interaktionspartner berücksichtigt wird.Auch wenn diese Methode verwendet werden kann, um die Signaltransduktion durch Grab zwei nachzuweisen, ist sie ebenfalls auf andere Systeme übertragbar, beispielsweise auf andere Proteine von Interesse. Die cDNA-Bibliothek liegt in Form einzelner baktenieller Klone in Glycerinstöcken vor.In einem 96-Well-Format unter Verwendung des Re-Ray-Befehls im Picker-Menü des Hudson Rapid Pick Light werden bakterielle Klone von der Quellplatte aufgenommen und in 1,5 Milliliter LB-Amp in einer 96er-Tiefbrunnenplatte angeimpft. Die Tiefbrunnenplatten werden anschließend mit einer gasdurchlässigen Folie verschlossen und über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler inkubiert. Am folgenden Tag werden die Tiefbrunnenplatten, die die Bakterien enthalten, bei 2000 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert.Unter Verwendung von Plattenadaptern in einer Tischzentrifuge das Medium von den Vertiefungen abziehen, wobei das bakterielle Pellet intakt bleibt. Als Nächstes die Arbeitsfläche der Tecan-Freedom-Evo-Automatisierungsplattform wie hier gezeigt konfigurieren. Lösungen für die Plasmidpräparation in Rinnen eins bis fünf verteilen und eine Tieflochplatte auf die Arbeitsfläche stellen.Stellen Sie einen Mehrfachbrunnen mit Alucian-Lösung neben die Tiefbrunnenplatte. Laden Sie die Spitzen in die Spitzenracks. Bauen Sie das Vakuummanifold zusammen. Die Plasmid-Bindungsplatte wird in das Manifold eingesetzt und die Plasmid-Filterplatte auf das Manifold gelegt. Resuspendieren Sie die Pellets mit 250 Mikrolitern Lösung eins.Den Resus-Aufschwemmungspuffer durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Es ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens, sicherzustellen, dass die Pellets vollständig resuspendiert sind. Ein Schüttler kann verwendet werden, falls das Auf- und Abpipettieren die Pellets nicht vollständig resuspendiert.Nachdem die Pellets vollständig resuspendiert sind, fügen Sie 250 Mikroliter der Lösung zum Lysepuffer hinzu, um die Bakterien aufzulysieren. Verschließen Sie die Platte und drehen Sie sie um, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Stellen Sie einen Timer auf zwei Minuten.Fügen Sie anschließend 350 Mikroliter Lösung drei hinzu, dem Neutralisierungspuffer. Verschließen Sie die Platte und invertieren Sie sie dreimal.Überführen Sie die bakteriellen Lysate in die Plasmid-Filterplatten. Unterziehen Sie sie fünf Minuten lang einem Vakuum. Entfernen Sie die Filterplatte und setzen Sie die Bindungsplatte auf den Manifold.Unter Vakuum eine Minute lang abziehen. 500 µL zusätzlichen Waschpuffer hinzufügen und zwei Minuten lang unter Vakuum abziehen. 900 µL Waschpufferlösung vier hinzufügen und zwei Minuten lang unter Vakuum abziehen.Danach erneut 900 Mikroliter Waschpufferlösung hinzufügen und 15 Minuten unter Vakuum setzen. Die DNA-Sammelplatte in das Manifold geben. 100 Mikroliter Eluierpuffer zur Bindungsplatte hinzufügen und zwei Minuten lang inkubieren.Wenden Sie 10 Minuten lang Vakuum an. Entfernen Sie abschließend die Sammelplatte und messen Sie die DNA-Konzentration mit dem NanoDrop 8,000. Typischerweise kann mit dieser Methode eine Ausbeute von etwa 100 Nanogramm pro Mikroliter erzielt werden, um dieses Verfahren zu beginnen.Nachdem die HEK 293-Zellen trypsinisiert und gezählt wurden, geben Sie mithilfe eines automatischen Dosiergeräts jeweils zwei mal 10 hoch vier Zellen in jede Vertiefung einer Perkin Elmer View-Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zur Transfektion.Verwenden Sie den automatisierten Flüssigkeitshandler, um in jedem Brunnen einer runden 96-Well-Platte folgende Mischung herzustellen: 100 Nanogramm GFP. Geben Sie zwei Plasmid-DNA mit jeweils 100 Nanogramm CD-NA in 25 Mikroliter serumfreiem Medium hinzu. Fügen Sie anschließend 25 Mikroliter serumfreies Medium hinzu, das 0,5 Mikroliter Transfectin pro Brunnen enthält, und starten Sie die Zeitschaltung für 30 Minuten. Nach 30 Minuten 50 Mikroliter der cDNA-Transfektionsmischung in die Zellen überführen. Verwenden Sie dazu eine schonende Dosiermethode. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Um die Bildaufnahme zu beginnen, starten Sie die Opera-Software. Wählen Sie den Konfigurationsreiter und anschließend das 20-fache Objektiv sowie den korrekten Plattentyp aus. Stellen Sie sicher, dass die Kollektoreinstellung am Objektiv auf den richtigen Wert für den jeweiligen Plättentyp eingestellt ist, um eine Fokussierung mit verschiedenen Plättentypen zu ermöglichen.Wählen Sie als Nächstes die Mikroskop-Registerkarte aus. Definieren Sie die erste Belichtung als Fite 4 88 Laser und die zweite Belichtung als UV 365 Laser. Aktivieren Sie den UV-Filter bei beiden Belichtungen und weisen Sie die Belichtung zu.Eins an Kamera eins und Belichtung. Zwei an Kamera zwei. Stellen Sie die Belichtungszeiten auf 800 Millisekunden für die Belichtung eins und auf 40 Millisekunden für die Belichtung ein.Zwei, Belichtung auswählen, Fokushöhe auf null Mikrometer einstellen. Fokussieren, sobald fokussiert ist. Kamera eins belichten.Stellen Sie die Fokus­höhe ein, um die Belichtungsebene zu optimieren, und klicken Sie auf „Höhe aufnehmen“. Speichern Sie die Belichtungs­parameter und wiederholen Sie den Vorgang für die Belichtung. Zwei: Wählen Sie den Reiter „Experiment­definition“, erstellen Sie ein Layout und ein Unterlayout.Ziehen und legen Sie das entsprechende Layout, die Belichtung, das Referenzbild, die Schräglage, die Beschneidungsdatei und das Teil-Layout ab. Speichern Sie das Experiment. Wählen Sie die Registerkarte für automatische Experimente und nehmen Sie Bilder unter normalen Bedingungen auf.Grab zwei ist in der gesamten Zelle lokalisiert. Nach Stimulation eines Wachstumsfaktor-Rezeptors transloziert es an die Plasmamembran und wird anschließend in Endosomen internalisiert. In dieser Abbildung zeigt das obere Feld CO M sechs Zellen, die vorübergehend mit GFP-Grab zwei transfiziert wurden, und wie erwartet ist die Fluoreszenz in der gesamten Zelle verteilt.Jedoch verlagert sich bei Zellen, die vorübergehend mit GFP-Grab2 und dem Zelloberflächenrezeptor EGFR transfiziert wurden, Grab2 in endosomenähnliche Strukturen, wie in der unteren Abbildung dargestellt. Daher kann bei Anwendung einer genomweiten Bibliothek erwartet werden, dass neuartige Grab2-bindende Zelloberflächenproteine identifiziert werden können. Diese Methode beschränkt sich nicht auf den Nachweis von Zelloberflächenproteinen.Zum Beispiel induziert das GPA-Protein DYNAMIN zwei, das an der grab zwei-vermittelten Endozytose beteiligt ist, eine Translokation von grab zwei. In diesem Experiment wurde GFP-grab zwei gemeinsam mit DNM zwei in HEC 293T-Zellen transfiziert. Die Umlokalisierung von GFP-grab zwei zu endosomenähnlichen Strukturen wird durch die Zellen innerhalb der roten Kreise veranschaulicht.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die Immunpräzipitation oder biochemische Assays verwendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die Interaktion direkt oder indirekt ist. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mittels Expressionsklonierung subzelluläre Proteininteraktionen identifizieren kann.

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