Integrierte Photoakustische Ophthalmoskopie und Spectral-Domain Optical Coherence Tomography

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Integration der photoakustischen Ophthalmoskopie mit der optischen Kohärenztomographie im Spektralbereich zur simultanen in-vivo-Bildgebung der Netzhaut bei kleinen Tieren zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein anästhesiertes Tier präpariert wird, wobei die Pupille erweitert und der Musculus sphincter pupillae gelähmt wird. Anschließend wird eine Echtzeit-S-D-O-C-T-Querschnittsbildgebung verwendet, um die gewünschte Netzhautregion zu lokalisieren und die optischen Parameter zu optimieren.

Ein nadelartiger Ultraschallwandler, der in Kontakt mit dem Augenlid des Tieres platziert wird, detektiert die laserinduzierten photoakustischen Signale und optimiert die Position des Ultraschallwandlers für eine maximale Signalamplitude. Die abschließenden Schritte bestehen darin, die Scanparameter einzustellen und S-D-O-C-T- und PAOM-Bilder gleichzeitig aufzuzeichnen. Letztendlich können der optische Absorptionskontrast und der optische Streukontrast aus den aufgezeichneten Bildern geringfügige funktionelle Veränderungen in der Netzhautdurchblutung und im Pigmentepithel zusammen mit einer detaillierten Netzhautanatomie sichtbar machen.

Das Forte des Ophthalmoskops ist eine neu entwickelte ophthalmologische Bildgebungstechnologie. Diese Technologie kann den optischen Absorptionskontrast der Netzhaut sichtbar machen und bietet somit einen potenziellen Vorteil gegenüber bestehenden Verfahren in der Bildgebung. Das netzhautnahe Choroidealgeflecht und das retinale Pigmentepithel werden mittels spektralbereichsbasierter optischer Kohärenztomographie, S-D-O-C-T, abgebildet, die auf rückgestreuten Photonen basiert, um ein volumetrisches Bild der Netzhaut zu erzeugen, und ist in der klinischen Praxis weit verbreitet.

Durch die Kombination von PAOM mit S-D-O-A-T können wir umfassendere anatomische und funktionelle Informationen über die Netzhaut gewinnen. Das photoakustische Mikroskopie-Subsystem umfasst einen Nd:YAG-Laser als Lichtquelle. Der ausgegebene Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 1064 Nanometern wird durch ein Beta-Bariumborat auf 532 Nanometer frequenzverdoppelt.

Acht Kristalle. Ein Laserspiegel teilt diesen Strahl. Anschließend wird das 532 Nanometer Licht über eine einmodige optische Faser geleitet, während der 1064 Nanometer Laser von einer Photodiode erfasst wird, die die Erfassung des photoakustischen Signals auslöst.

Das Laserlicht, das aus der Einmoden-Glasfaser austritt, wird über eine Konfiguration aus Galvanometer und Teleskop in die Netzhaut eingeleitet. Ein unkonzentrierter Nadelschwinger wird in Kontakt mit dem Augenlid platziert, um die aus der Netzhaut erzeugten photoakustischen Signale zu detektieren. Zwischen der Spitze des Wandlers und dem Augenlid des Tieres wird Ultraschallgel aufgetragen, um eine gute akustische Kopplung zu gewährleisten.

Das photoakustische Signal wird durch zwei Verstärker verstärkt und anschließend von einer Datenerfassungskarte digitalisiert. Das optische Kohärenztomographie-Subsystem im Spektralbereich (SD-OCT) verwendet eine Lichtquelle mit geringer Kohärenz, eine breitbandige superlumineszierende Diode, die die axiale Auflösung auf sechs Mikrometer festlegt. Das nahinfrarote Licht wird durch einen kommerziellen Einmoden-Faserkoppler mit 50:50 aufgeteilt, der das Licht zum Probearm und zum Referenzarm leitet.

Der Strahl, der zum OCT-Probenarm geliefert wird, wird durch einen Hot-Mirror mit dem PAOM-Beleuchtungslicht kombiniert. Der Probenarm teilt sich die gleiche Scan- und Optikeinheit wie das PAOM. Abschließend wird ein selbstgebautes Spektrometer verwendet, um die S-D-O-C-T-Interferenzsignale aufzuzeichnen, wobei eine Zeilen-Scan-CCD-Kamera eine A-Linien-Frequenz von 24 Kilohertz ermöglicht.

Es sind einige Schritte erforderlich, um die beiden Teilsysteme auszurichten. Zuerst maximieren Sie die Frequenzverdopplungseffizienz des BBO-Kristalls. Danach richten Sie den Faserlaser-Ausgang des PAOM auf einen Durchmesser von 2,0 Millimetern aus.

Drittens richten Sie die kombinierten Beleuchtungslichter des PAOM und des S-D-O-C-T koaxial aus. Stellen Sie abschließend das Anregungslicht des PAOM auf etwa 40 Nanojoule pro Puls und das Abtastlicht des S-D-O-C-T auf etwa 0,8 Milliwatt ein. Beide Einstellungen gelten als augensicher, nachdem eine Ratte anästhesiert wurde.

Unter Verwendung eines standardmäßigen ISO-Fluor-Protokolls wird die Ratte in einer selbstgebauten Halterung mit fünf justierbaren Freiheitsgraden fixiert. Um die Körpertemperatur der Ratte nahe 37 Grad Celsius zu halten, wird eine Heizplatte zur Aufrechterhaltung der Anästhesie verwendet. Die Ratte erhält kontinuierlich 1 % ISO-Fluor mit einem Fluss von 1,5 Litern pro Minute während des gesamten Experiments.

Entfernen Sie nun mit einer kleinen chirurgischen Schere den Wimpernreben vom Augenlid, weiten Sie anschließend die Pupille mittels einer 1 %igen tropischen Augenlösung und paralysieren Sie danach den Musculus sphincter iridis mit einer 0,5 %igen TETRACAINE-Hydrochlorid-Augenlösung. Während des gesamten Verfahrens ist es entscheidend, dem Auge der Ratte im Zwei-Minuten-Takt künstliche Tränen zuzuführen. Schalten Sie danach das Beleuchtungslicht der SDO-CT ein und überprüfen Sie, ob das Messlicht etwa 0,8 Milliwatt beträgt.

Aktivieren Sie nun das galvanometrische Scanning. Richten Sie das S-D-O-C-T-Belichtungslicht auf die Netzhaut der Ratte aus, und identifizieren Sie den interessierenden Netzhautbereich, indem Sie den Fünf-Achsen-Tierhalter und das Zentrum des Sichtfeldes auf diesem Bereich justieren. In diesem Beispiel wird die Papille optica betrachtet.

Passt den Tierhalter weiter an, um die bildgebende Darstellung des retinalen Querschnitts in einer Scanningsrichtung zu optimieren. Wechseln Sie dann die Raster-Scanningsrichtung und nehmen Sie weitere Anpassungen vor, bis der optimale Fokuspunkt gefunden ist. Bereiten Sie nun den an einer fünfachsigen verstellbaren Plattform befestigten Nadelschwinger vor.

Tragen Sie einen Tropfen Ultraschallgel auf die Transducer-Spitze auf und bringen Sie die Transducer-Spitze vorsichtig mit dem Augenlid des Tieres in Kontakt. Stellen Sie den PAOM-Laser auf den externen Trigger-Modus ein. Starten Sie das Galvanometer-Scanning und aktivieren Sie die Echtzeitanzeige des PAOM.

Querschnittsbilder. Passen Sie die Transdager-Orientierung sorgfältig an, um eine gute Überlappung des Empfindlichkeitsbereichs mit dem Abtastbereich des PAOM-Lasers zu erzielen. Stoppen Sie, wenn das PAOM-Bild das beste Signal-Rausch-Verhältnis und gleichmäßig verteilte PA-Amplitudenmuster in beiden Abtastrichtungen aufweist.

Stellen Sie nun die Ansteuerspannungen der beiden Galvanometerscanner gemäß der Größe des interessierenden Bereichs ein und führen Sie den Scan durch. Wenn der Scan ausgelöst wird, erfolgt ein schneller 2D-Raster-Scan durch das GALVANOMETER, der von einer analogen Ausgabekarte gesteuert wird, die gleichzeitig sowohl das Abfeuern des PAOM-Lasers als auch die Signalerfassung des OCT-Spektrometers auslöst.

Daher erfolgt die Synchronisierung der beiden Teilsysteme. Eine Foto-DDE-Aufnahme der PAOM-Lasersequenz löst anschließend die Erfassung der PAOM-Daten aus. Nach dem Experiment schalten Sie das S-D-O-C-T-Abtastlicht aus und entfernen das Tier unverzüglich aus der Halterung.

Halten Sie das Tier warm und dunkel, bis es von selbst aufwacht. Schalten Sie dann die Heizung aus und belassen Sie es weitere Stunde im Dunkeln, rekonstruieren Sie die dreidimensionalen Bilder offline mithilfe eines frei verfügbaren, auf MATLAB basierenden Visualisierungsprogramms namens Vue Construct, die 3D-Volumenbilder und 2D-Fundusbilder aus 256 B Bcan-Bildern. 2D-Fundusbilder von S-D-O-C-T und PAOM wurden simultan in einer albino-Ratte und in einer pigmentierten Ratte aufgenommen.

Der maximale Abtastwinkel betrug 26 Grad und die Bildakquisitionszeit lag bei etwa 2,7 Sekunden. In den S-D-O-C-T-Fundusbildern erscheinen die Netzhautgefäße aufgrund der Hämoglobinabsorption des Messlichts dunkel. Da das pigmentierte Auge eine hohe Melaninkonzentration aufweist, zeigen PAOM-Bilder zusätzlich zu den Netzhautgefäßen das retinale Pigmentepithel oder RPE mit hohem Kontrast; da das albino Auge hier Melanin im RPE fehlt, visualisiert PAOM die Netzhautgefäße und die Aderhautgefäße. Um die dreidimensionale Abbildungsfähigkeit von P-A-O-M zu demonstrieren, wurde eine volumetrische Darstellung dieses Bildes erstellt.

Wenn der Ablauf einmal beherrscht ist, kann dieser bildgebende Prozess innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen werden. Wir erwarten, dass die Polarisationsmikroskopie (POM) eine wichtige Rolle sowohl beim grundlegenden Verständnis als auch bei der klinischen Diagnose mehrerer erblindender Erkrankungen wie der diabetischen Retinopathie und der Netzhautdegeneration spielen wird.