Name: Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Lernen Sie die effiziente Isolierung von Lymphozyten aus dem Genitaltrakt der Maus mittels Kollagenas-Verdauung und Percoll-Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Immunzellen und liefert Einblicke in das Verhalten von Gewebelymphozyten.

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Wir möchten NIH für die Finanzierung Zuschüsse R01-AI026328 (KAK) und R01-AI079004 (KAK) danken.

Ein. Das Entfernen des Genitaltraktes <ol><li> Euthanize die Maus über die Leitlinien gebilligt. Machen niedrigen Mittellinienschnitt und Einfahren Haut. </li><li> Isolieren und entfernen ganzen Genitaltrakt von Eileiter zur vaginalen Öffnung. </li><li> Öffnen Sie den gesamten Trakt längs mit einer Schere. </li><li> Schneiden Sie den Genitaltrakt mit feinen chirurgische Schere in feine Stücke (etwa &lt;1 mm) in einer Petrischale mit Complete RPMI-10/EDTA (siehe Formel unten) und rühren Sie das Gewebe in 125 ml Kolben bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer Set für 15 min. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt und anschließend der Überstand, der Epithel und andere Verunreinigungen enthält, wird verworfen. </li><li> Gießen Inhalt des Kolbens durch eine Zelle Sieb (40 um). Abwaschen EDTA Rückstand mit Vollmedium. Komplette RPMI/10: 500 ml RPMI (Gibco), 10% fötalem Rinderserum (FBS), hitzeinaktiviertes, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml 1M HEPES. Komplette RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (wie oben) mit 5 &amp;mgr; EDTA </li></ol> 2. Verdauen Genitaltrakt Gewebe <ol><li> Übertragen Gewebestücke zu einer neuen Flasche mit 20 ml frisches RPMI-10/collagenase (siehe Rezept unten) und verdauen das Gewebe bei 37 ° C für 1 Stunde auf einem Magnetrührer auf kräftig rühren das Gewebe. Komplette RPMI-10/collagenase: Kurz vor Gebrauch rekonstituieren Collagenase Typ VIII (Sigma; bei -20 ° C, oder nach den Anweisungen des Herstellers.), In komplette RPMI/10 hinzufügen einer Endkonzentration von 450-500U/ml. </li><li> Nach der ersten Verdauung, sammeln Überstände durch 100 um Zellsieb, halten die Zellen auf Eis. </li><li> Übertragen die unverdaute Gewebe zu einem neuen Kolben und wiederhole Schritt 2.1 noch zweimal mit frischem Komplettmedium RPMI-10/collagenase für insgesamt 3 separaten Aufschlüsse. An diesem Punkt sollte keine sichtbaren Gewebestücke in Lösung sein. </li><li> Pool die alle Überstände zusammen aus einer Probe und sammeln über 100 um Zellsieb. Drehen Sie das cEllen tief herunter. Zellpellets werden getrennt mit Percoll Gradienten werden. </li></ol> 3. Trennung Genitaltrakt Zellen mit Percoll Gradienten <ol><li> Bereiten Sie jede Konzentration von Percoll vor dem Gebrauch: <ul><li> 100% ige isotonische Percoll: mix 09.01 Lager Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. pH ist auf 7,4 mit HCL. </li><li> 40% Percoll-Lösung: 40 ml Mischung aus 100% isotonischer Percoll und 60 ml vollständigem RPMI. </li><li> 70% Percoll-Lösung: mix 70 ml 100% ige isotonische Percoll mit 30 ml komplettem RPMI. </li></ul></li><li> Resuspendieren jede Zelle Pellet aus Schritt 6 in 40% Percoll-Lösungen. Ein gleiches Volumen von 70% Percoll wird verwendet, um die Gradienten zu machen. Es gibt zwei Möglichkeiten zum Einrichten Gradienten Röhren: <ol><li> Unter-Schicht: add Zellsuspension mit 40% Percoll in einem Gradienten Rohr, dann vorsichtig unter-Schicht 70% Percoll. </li><li> Überlagerungsschicht: in 70% Percoll in das Rohr zuerst, dann vorsichtig und langsam geladen werden 40% Percoll, welche die Zellen auf dietop. </li></ol></li><li> Gradient Proben @ 900 xg, Raumtemperatur zentrifugiert werden, für 20 min mit der Bremse ab. </li><li> Die Lymphozyten werden an der Grenzschicht zwischen 40% und 70% Percoll Schichten sein. Sorgfältig ernten die Grenzschicht, waschen mit RPMI 1:3 und Spin-Down bei 740 xg. Die Lymphozyten werden im Zellpellet sein und sind zur weiteren Verwendung bereit. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel der Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genitaltrakt und Durchflusszytometrie (FACS)-Analyse ist in Abbildung 1 gezeigt. Genitaltrakt wurde von Chlamydia muridarum entfernt intravaginal infiziert Maus 7 Tage nach der Infektion. Zwei Genitaltrakt wurden zusammen, um genügend Lymphozyten zur funktionellen Untersuchung und Phänotyp durch FACS haben gepoolt. Seziert Gewebe wurden durch die Verdauung und Isolierungsschritte wie oben verarbeitet. Die einzelne Zellsuspension wurde für verschiedene Fluorochrom-konjugierten angefärbtmonoklonale Antikörper gegen den Maus-CD3, CD4 und CD8. Abbildung 1 zeigt eine Dot-Plot Darstellung der CD4-positiven T-Zellen im Vergleich zu CD8-positiven T-Zellen aufgetastet CD3 positive T-Lymphozyten. Unser Verfahren untersuchen können Lymphozyten aus Genitaltrakt verschiedener Krankheitsmodelle isoliert verschiedenen Immunzellen funktionelle und phänotypische Merkmale bei verschiedenen Krankheiten im Mausmodell zu beurteilen. Dazu gehören verschiedene Immunzellen, wie dendritische Zellen, Neutrophilen, Makrophagen NK, NKT, T-Zellen (Ag-spezifischen T-Zellen), B-Zellen usw. 3-10. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> Abbildung 1. Lymphozyten wurden aus Genitaltrakt von Mäusen mit Chlamydia muridarum infiziert isoliert, mit dem hier vorgestellten Verfahren. Nach der vollständigen Trennung Verfahren wurden Lymphozyten mit Fluorochrom-konjugierten CD3, CD4 und CD8 gefärbt. Die Quadranten Daten waren gated auf CD3 +-Lymphozyten,zeigt CD4 + gegenüber CD8 + mit und Prozentsatz der gated Zellen.

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
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<li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li>
<li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll wird gezeigt, wie man von Maus-Lymphozyten Genitaltrakt vorzubereiten und wird leicht beherrschen. Der kritischste Punkt bei diesem Verfahren ist, um die Zellviabilität, indem die Zellen auf Eis erhalten. Die Zellausbeute aus dieser Methode hängt von Technik, Handhabung Geschicklichkeit, den infektiösen Zustand der Maus (naive oder Tage nach Infektion), die Erreger (Bakterien, Viren, Pilze) und den Abschnitt des murinen Reproduktionstrakt geprüft (Eileiter, der Gebärmutter, vaginalen Bereich oder die...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma Life Sciences </td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Gibco von Life Technologies </td><td> 11875 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von lymphozyten aus maus genital tract mucosa

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Schleimhäute, einschließlich in den Magen-Darm-, Urogenital-, und Atemwege bieten Eintrittspforten für Krankheitserreger wie Viren und Bakterien ein. Schleimhäute sind auch induktive Plattformen mit dem Host, um Immunität gegen Pathogene, wie etwa die Peyer-Plaques im Darmtrakt und der nasalen-assoziierten lymphoretikulären Gewebe im Atemtrakt zu erzeugen. Dieses einzigartige Feature bringt Schleimhaut-Immunität als ein entscheidender Spieler des Abwehrsystem. Viele Studien haben sich auf gastrointestinalen und respiratorischen Schleimhaut Standorten konzentriert. Allerdings gibt es nur wenige Untersuchungen der reproduktiven Schleimhäute. Der Genitaltrakt Schleimhaut ist die primäre Infektion Website für sexuell übertragbare Krankheiten (STD), einschließlich bakterielle und virale Infektionen. Geschlechtskrankheiten sind eine der wichtigsten gesundheitlichen Herausforderungen der heutigen Welt. Centers for Disease Control and Prevention schätzt, dass es 19 Millionen neuer infektiöser jedes Jahr in den Vereinigten Staaten. STDs kostet das US-Gesundheitssystem $ 17000000000 jedes Jahr 2 und Kosten Individuen noch in unmittelbarer und lebenslanges gesundheitlichen Folgen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, ist ein besseres Verständnis der reproduktiven Schleimhaut-Immunität benötigt und Isolierung Lymphozyten ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Studien. Hier präsentieren wir eine Methode, um reproduzierbare Isolierung von Lymphozyten aus murinen weiblichen Genitaltrakt für immunologische Studien, die zur Anpassung an andere Arten modifiziert werden können. Das nachfolgend beschriebene Verfahren ist auf einer Maus.

Ein effizienter Weg, um Lymphozyten, die aus Maus Genitaltrakt isolieren beschrieben. Diese Methode nutzt Enzym Verdauung und Percoll Gradienten Trennung effiziente Isolierung ermöglichen. Diese Technik ist auch anpassbar für die Verwendung in anderen Spezies

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Schleimhautoberflächen, einschließlich derer in den gastrointestinalen, urogenitalen und respiratorischen Trakt, bieten Eintrittspforten für Pathogene, wie zum Beispiel Viren und ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Lymphozyten aus dem murinen Fortpflanzungstrakt zu isolieren. Dazu wird zunächst der gesamte Genitaltrakt entfernt und das Gewebe in kleine Stücke zerkleinert, um die Lymphozyten aus dem Gewebe freizusetzen. Das fein zerkleinerte Gewebe wird anschließend mit Kollagenase acht unter starker Rührtätigkeit bei 37 Grad Celsius verdaut.Unter Verwendung eines magnetischen Rührers werden die Lymphozyten anschließend durch eine Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Letztendlich können die Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie charakterisiert werden. Die Anwendung dieses Verfahrens erstreckt sich auf die Diagnose und Therapie reproduktiver Erkrankungen. Da diese Methode es uns ermöglicht, das Verhalten von Gewebe-Lymphozyten zu verstehen, die sich häufig von den aus dem zirkulierenden System isolierten Lymphozyten unterscheiden.Obwohl diese Methode Einblicke in das Fortpflanzungsschleimhautsystem bietet, kann sie auch auf andere Systeme wie das intestinale und respiratorische Schleimhautsystem angewendet werden. Nach der Tötung einer weiblichen Maus verwenden Sie chirurgische Scheren, um einen mittigen Hautschnitt im unteren Bauchber

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Isolation von Lymphozyten mit der Miltenyi MACs Kit ist eine zuverlässige Methode, um Zellen aus ganzen lymphatischen Gewebe-Homogenaten zu reinigen. Cells unter Verwendung der Miltenyi-System sind in der Regel ≥ 96% rein. Hier zeigen wir, welche Schritte unternommen wurden, um CD4 + T-Zellen, einer der vielen Kits von Miltenyi angeboten isolieren.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von Lymphozyten aus einem entnommenen Peyer-Pflaster der Maus. Die isolierten Lymphozyten können für weitere Analysen verwendet werden.

Isolierung von Lymphozyten aus einem Peyer-Pflaster der Maus

Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Isolierung myeloischer Zellen aus der Maushaut und der Drainage von Lymphknoten nach intradermaler  Injektion von Plasmodium-Sporozoiten. Die Durchflusszytometrie der gesammelten Zellen bietet einen zuverlässigen Assay zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion der Haut und der Drainage von Lymphknoten auf den Parasiten.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Es besteht ein wachsendes Interesse an der quantitativen Charakterisierung von intestinalen Lymphozyten, da zunehmend erkannt wird, dass diese Zellen eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Darm- und systemischen Erkrankungen spielen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten für die anschließende durchflusszytometrische Charakterisierung isoliert werden können.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

In dieser Studie präsentieren wir eine neue und effektive Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Peyer Patches (PPs), die anschließend für in Vivo und in Vitro funktionelle Assays sowie Flow durchflusszytometrischen Studien des follikulären T verwendet werden können Helfer und germinal Center B-Zellen.

Entwirren Key Player der humoralen Immunität: erweiterte und optimierte Lymphozyten isoliert Protokoll von Murine Peyer Patches

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Lernen Sie die effiziente Isolierung von Lymphozyten aus dem Genitaltrakt der Maus mittels Kollagenas-Verdauung und Percoll-Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Immunzellen und liefert Einblicke in das Verhalten von Gewebelymphozyten.

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

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