Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Ein effizienter Weg, um Lymphozyten, die aus Maus Genitaltrakt isolieren beschrieben. Diese Methode nutzt Enzym Verdauung und Percoll Gradienten Trennung effiziente Isolierung ermöglichen. Diese Technik ist auch anpassbar für die Verwendung in anderen Spezies

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lymphozyten aus dem Fortpflanzungstrakt der Maus zu isolieren. Dazu wird zunächst der gesamte Genitaltrakt entfernt und das Gewebe in kleine Stücke zerkleinert, um die Lymphozyten aus dem Gewebe zu befreien. Das fein zerkleinerte Gewebe wird mit Kollagenase acht und kräftigem Rühren des Gewebes bei 37 Grad Celsius verdaut.

Mit einem magnetischen Rühr werden die Lymphozyten dann durch einen Gradienten pro Aufruf isoliert. Letztendlich können die Lymphozyten durch Durchflusszytometrie charakterisiert werden. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Diagnose und Therapie von Fortpflanzungskrankheiten. Diese Methode ermöglicht es uns, das Verhalten der Gewebelymphozyten zu verstehen, die sich oft von den Lymphozyten unterscheiden, die aus dem zirkulierenden System isoliert wurden.

Obwohl diese Methode einen Einblick in das System der Fortpflanzungsschleimhaut bietet, kann sie auch auf andere Systeme wie die Darmschleimhaut und die Atemwege angewendet werden. Nachdem Sie eine weibliche Maus eingeschläfert haben, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen tiefen Schnitt in der Mittellinie zu machen, und öffnen Sie dann die Haut. Schieben Sie den Darm vorsichtig zur Seite, identifizieren Sie das UCS und isolieren und entfernen Sie dann den gesamten Genitaltrakt vom UCS bis zur Vaginalöffnung.

Lege den Genitaltrakt in eine Petrischale. Öffne den gesamten Trakt mit einer Schere in Längsrichtung. Übertragen Sie dann das Gewebe in eine Petrischale mit vollständigem RPMI 10 Medium.

Schneiden Sie nun den Genitaltrakt in feine Stücke und geben Sie die Stücke dann in einen Kolben, der das vollständige RPMI 10 und EDTA enthält. Den Kolben auf ein magnetisches Rührwerk stellen und das Gewebe zweimal 15 Minuten lang bei Raumtemperatur umrühren, um die Epithelzellen nach der letzten Rührphase loszuwerden, den Überstand verwerfen und dann die Gewebestücke durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gießen. Waschen Sie die EDTA-Rückstände mit einem vollständigen Medium ab.

Nun werden die filtrierten Gewebestücke in einen neuen Kolben mit frischem RPMI 10 und Kollagenase überführt und die Stücke bei 37 Grad Celsius auf dem Magnetrührer verdaut, um das Gewebe nach einer Stunde kräftig umzurühren, den Überstand durch ein 100 Mikrometer großes Zellsieb in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen gießen und die gefilterte Zellsuspension auf Eis halten. Geben Sie frisches RPMI 10 mit Kollagenase in den Originalkolben und rühren Sie das Gewebe jeweils zwei Mal mit frischem vollständigem RPMI 10 und Kollagenase um. Nach dem dritten Aufschluss sollten keine sichtbaren Gewebestücke in der Lösung vorhanden sein.

Bündeln Sie nun die Überstände aus den drei Verdauungen. Drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 410 G und vier Grad Celsius und entsorgen Sie dann den Überstand. Beginnen Sie mit der Wiederbelebung des Zellpellets in einer frischen Lösung mit 40 % pro Anruf.

Geben Sie die Zellsuspension mit 40 % pro Anruf in ein Gradientenröhrchen und unterlegen Sie dann sorgfältig das gleiche Volumen frisch zubereitet 70 % pro Anruf. Zentrifugieren Sie nun die Gradientenproben für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit abgebrochenem Break.

Nach der Zentrifugation werden die Lymphozyten vorsichtig an der Grenzschicht zwischen den Perolgradienten entnommen. Waschen Sie dann die wiedergewonnenen Zellen mit RPMI eins bis drei für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Schließlich werden die Lymphozyten nach dem Verwerfen des Trägers in der geeigneten Lösung gemäß dem gewünschten experimentellen Verfahren wieder suspendiert.

Dieses Punktdiagramm ist ein Beispiel für eine Lymphozytenpopulation, die aus dem Genitaltrakt einer intravaginal mit Chlamydien Harnleiter infizierten Maus isoliert wurde. Sieben Tage nach der Infektion wurde die Einzelzellsuspension auf CD drei positiven Lymphozyten gestoppt und nach ihrer Entwicklung auf CD vier und CD acht exprimierende Zellen analysiert. Diese Technik ebnete dem Forscher den Weg zur Erforschung der Funktion der reproduktiven Lymphozyten und der Zelleigenschaften in Virus-Maus-Krankheitsmodellen, die menschliche Krankheiten nachahmen.