Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert

Dieser experimentelle Ansatz kombiniert die BrdU-Inkorporation mit der fluoreszenzmarkierten in-situ-Hybridisierung, um den Replikationszeitpunkt von Säugetierchromosomen quantitativ zu analysieren. Zunächst wird BrdU in lebende Zellen inkorporiert und anschließend die Metaphasechromosomen isoliert.

Führen Sie anschließend ein DNA-FISH in Kombination mit sequenziellem BrdU-Antikörpernachweis durch, um die einzelnen replizierenden Chromosomen zu identifizieren. Verwenden Sie danach die Fotomikroskopie, um Bilder der FISH-Signale und der BrdU-Inkorporierung in einzelnen mitotischen Figuren aufzunehmen. Berechnen Sie mithilfe der Cyto-Vision-Software die Fläche und Intensität der Pixel, die durch die BrdU- oder DAPI-Signale auf jedem isolierten Chromosom dargestellt werden.

Die Ergebnisse ermöglichen eine Quantifizierung und einen Vergleich der BRDU-Inkorporierung in einzelnen umgeordneten Chromosomen und deren Holoen. Da die hier beschriebene Methode einzelne Zellen bewertet, kann sie Veränderungen in der Replikation und dem zeitlichen Ablauf chromosomaler Umordnungen nachweisen, die nur in einem Bruchteil der Zellen einer Population vorhanden sind, im Vergleich zu kürzlich entwickelten Hochdurchsatz-Mikroarray- und DNA-Sequenzierungsprotokollen. Diese Methode erlaubt einen direkten Vergleich homologer Chromosomen, die sich in derselben Zelle befinden.

Es besitzt außerdem die Fähigkeit, Chromosomenumordnungen eindeutig zu identifizieren, die die Chromosomenreplikation beeinflussen. Der zeitliche Ablauf ganzer Chromosomen, der das Verfahren demonstriert, wird von Leslie Smith übernommen. Eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor säen die Zellen bei etwa 70 % Konfluenz in eine 150 Millimeter Zellkulturschale aus und stellen sie 24 Stunden lang zum geeigneten Zeitpunkt in einen Zellinkubator.

Punkte vor der Ernte. Ersetzen Sie das Medium durch frisches, komplettes Medium, das 10 Mikrogramm pro Milliliter BRDU enthält. Die Dauer, für die die Zellen in Medium mit BRDU kultiviert werden, variiert je nach Zelltyp und Spezies.

Die G2-Phase dauert typischerweise zwischen zwei und fünf Stunden. Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte und bewahren Sie 10 Milliliter in einem 15-Milliliter-Kegelzentrifugenröhrchen auf. Spülen Sie die Zellen mit 10 Millilitern Sine ab und entfernen Sie die restliche Sine durch Vakuum-Aspiration.

Gegeben Sie dann fünf Milliliter 0,25 %iger Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur, bis sich die Zellen von der Platte gelöst haben. Sammeln Sie die Zellen ein und überführen Sie die Suspension in die 10 Milliliter zurückgehaltene Nährlösung. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und aspirations Sie die Flüssigkeit bis auf 0,5 Milliliter ab.

Suspensieren Sie die Zellen nun gründlich mithilfe von Pipettierschritten, um die Zellen osmotisch aufquellen zu lassen. Geben Sie drei Tropfen 75 Millimolar Kaliumchlorid, die auf 37 Grad Celsius erwärmt wurden, hinzu und mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren. Fügen Sie anschließend zusätzlich 0,5 Milliliter hypotone Lösung hinzu. Bringen Sie das Gesamtvolumen der hypotonen Lösung nun auf fünf Milliliter und mischen Sie durch Pipettieren.

Inkubieren Sie die Zellsuspension je nach Zelltyp 20 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Röhrchen schräg, um die Zellen in Suspension zu halten. Anschließend zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 400 × g.

Aspirieren Sie alles bis auf 0,5 Millimeter des Überstandes ab und verwenden Sie eine Pasteurpipette, um das Zellpräparat vorsichtig erneut in Suspension zu bringen. Die osmotisch geschwollenen Zellen sind an diesem Punkt empfindlich, daher sollte darauf geachtet werden, die zytoplasmatischen Membranen nicht zu beschädigen. Geben Sie anschließend drei Tropfen Car-noix-Fixiermittel hinzu und mischen Sie vorsichtig.

Nach Zugabe weiterer 0,5 Milliliter Fixansatz wird das Volumen des Fixansatzes auf fünf Milliliter aufgefüllt und zu einer homogenen Zellsuspension pipettiert. Diese fixierten Zellen können mehrere Monate im Dunkeln bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Die fixierten Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen, der Fixansatz wird abgesaugt und das Pellet in 10 Volumina Fixansatz unter Zugabe von nasser kalter Mikroskopie-Eiskälte resuspendiert.

Gleiten Sie in einem Winkel von etwa 45 Grad. Geben Sie die Zellsuspension tropfenweise hinzu, um die Zellsuspension zu verteilen. Überfluten Sie den Objektträger mit Fixans und lassen Sie den Überschuss ablaufen.

Legen Sie die Probe dann flach auf Papiertücher, um sie an der Luft trocknen zu lassen. Überprüfen Sie die Proben auf das Vorhandensein von Mitosespuren mit einem umgekehrten Mikroskop. Geben Sie zwei Mikroliter einer Lösung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter RNase A in zwei XSSC auf jede Probe und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Führen Sie drei Waschungen mit jeweils drei Minuten Dauer in zwei XSSC, pH 7,0, bei Raumtemperatur durch. Anschließend dehydrieren Sie die Proben bei Raumtemperatur durch eine Ethanolreihe über jeweils drei Minuten. Trocknen Sie die Proben danach jeweils lufttrocken bei Raumtemperatur und geben Sie sie in eine gekühlte Mikrozentrifugenrobe.

Geben Sie vier Mikrogramm DNA-Substrat mit markiertem Nukleotid, 10× NIC-Translationspuffer, dNTP-Mix und NIC-Translationsenzym hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 16 Grad Celsius, erhitzen Sie sie dann zur Beendigung der Reaktion 10 Minuten lang auf 70 Grad Celsius. Anschließend fünf Minuten lang auf Eis abkühlen.

Um nun die DNA mit Ethanol zu präzipitieren, geben Sie 48 Mikroliter dreimolarem Natriumacetat, 160 Mikroliter 0,25 Mikrogramm pro Mikroliter Cot-1-DNA und 1,2 Milliliter 100 %igen Ethanol hinzu. Lagern Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius für 10 Minuten bis über Nacht, um die DNA durch Zentrifugation zu präzipitieren, waschen Sie das Pellet mit 70 %igem Ethanol und resuspendieren Sie die luftgetrocknete DNA-Sonde in 40 Mikrolitern zweifach destilliertem Wasser, um eine Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter markierter Cot-1-DNA für die gleichzeitige Back-SEP-Hybridisierung zu erhalten. Bereiten Sie zwei separate Cot-1-DNA-haltige Sondenmischungen wie im begleitenden Manuskript beschrieben vor.

Denaturieren Sie die Sonden-Cocktails bei 75 Grad Celsius für 10 Minuten. Anschließend inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, um die cot-1-DNA an repetitive Sequenzen zu binden. Mischen Sie nun die Back-Sonde mit der S-Sonde im Verhältnis drei zu zwei mit 25 Mikrolitern pro Probe.

Schieben Sie, um die Proben zu denaturieren. Tauchen Sie die Objektträger in 70 % Formamid, zwei Mal SSC bei 72 Grad Celsius ein und inkubieren Sie drei Minuten lang. Dehydrieren Sie die Proben anschließend unverzüglich durch eine Ethanolreihe bei 4 Grad Celsius für drei Minuten.

Trocknen Sie jede Probe luftig bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten, bevor die Vorbereitung der Sonde abgeschlossen ist. Äquilibrieren Sie die Objektträger auf einem Objektträgerwärmer bei 45 Grad Celsius. Geben Sie dann 25 Mikroliter der Back-S-Sondemischung hinzu.

Platzieren Sie vorsichtig auf jede Probe einen Deckglaser und verschließen Sie alle Kanten mit Kautschukzement für den Hybridisierungsschritt. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer. Führen Sie drei Nachhybridisierungsspülungen von jeweils drei Minuten in 50 % IDE zwei XSSC pH 7,0 bei 38 bis 40 Grad Celsius durch.

Die optimale Temperatur der Waschschritte hängt von der Sonde ab. Wenn eine starke unspezifische Hybridisierung vorliegt, erhöhen Sie die Temperatur der Waschschritte. Umgekehrt, wenn das Signal der Sonde schwach ist und keine Hintergrundfärbung auftritt, verringern Sie die Temperatur der Waschschritte.

Führen Sie eine Wäsche in PN-Puffer bei Raumtemperatur für drei Minuten durch. Für die BRDU-Detektion geben Sie 200 Mikroliter PNM-Blockierpuffer zu jedem Objektträger hinzu. Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln und lassen Sie die Objektträger auf einem Papierhandtuch abtropfen.

Anschießend 100 Mikroliter einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Anti-B-R-D-U-F-E-konjugierten Antikörperlösung hinzufügen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Drei Waschschritte mit jeweils drei Minuten Dauer in PN-Puffer bei Raumtemperatur durchführen. Den überschüssigen PN-Puffer von jedem Objektträger entfernen.

Anschießend 20 Mikroliter dappy Antifa-Mounting-Lösung hinzufügen. Das Objektträger mit einem Papiertuch abdecken und vorsichtig auf das Deckglas drücken, um Luftblasen und überschüssige Mounting-Lösung zu entfernen. Die Bilder mit einem an eine CCD-Kamera angeschlossenen Fluoreszenzmikroskop aufnehmen.

Verwenden Sie das 100×-Objektiv sowie das automatische Filterrad und die Cyto-Vision-Software, um BRDU mit einem Fitzy-Filter und die Chromosomenmalproben sowie Zentromerproben mit einem Side-Three- oder Texas-Red-Filter aufzunehmen. Verwenden Sie außerdem einen Dappy-Filter für die Kernfärbung. Identifizieren Sie die einzelnen Chromosomen von Interesse mit Back-EP- oder chromosomenspezifischen Malproben in der Cyto-Vision-Software.

Schneiden Sie jedes Chromosom von Interesse als Ganzes aus der Metaphaseausstrahlung aus. Kopieren und fügen Sie die DPI- und FITZY-Chromosombilder in ein neues Fenster ein. Wählen Sie das Diagrammsymbol im Werkzeugmenü aus, das die Erstellung eines Diagramms ermöglicht, das die Fläche und Intensität der Fitz- und Dappy-Färbung entlang jedes einzelnen Chromosoms darstellt.

Dies erfolgt, indem eine Linie von dem kurzen zu dem langen Arm entlang der Länge des Chromosoms gezogen wird. Wählen Sie im Werkzeugmenü das Daten-Symbol aus und generieren Sie eine Tabelle, die die berechnete Fläche und Intensität für ZI und dpi anzeigt. Wählen Sie anschließend die ZI- und DPI-Signale für die Chromosomen von Interesse aus.

Klicken Sie anschließend auf die Schaltflächen für Intensität und Fläche im Tabellensymbol. Die Software erzeugt eine numerische Messung der Pixel pro Quadratzoll für jedes Signal. Danach wird die durchschnittliche Pixelintensität jedes Chromosoms mit der von diesen Pixeln eingenommenen Fläche multipliziert.

Um die Gesamtanzahl der Pixel für die Visualisierung der zuletzt replizierenden Regionen von Chromosomen zu erhalten, bewerten Sie das Bandmuster der BrdU-Inkorporation für die aktiven Replikationsbereiche der Chromosomen. Berechnen Sie anschließend die Unterschiede in der Replikationszeit zwischen Chromosomenpaaren basierend auf den Unterschieden im BrdU-Bandmuster. Die Chromosomen in Säugetierzellen replizieren gemäß einem zeitlichen Programm, bei dem eine frühe und späte Replikation zu Beginn bzw. am Ende der S-Phase erfolgt.

Eine typische S-Phase in Säugetierzellen dauert acht bis zehn Stunden, und die G2-Phase beträgt in der Regel zwei bis fünf Stunden. In diesem experimentellen System wird BrdU über zunehmende Zeiträume hinweg zugesetzt, um die letzten Abschnitte der Chromosomen zu markieren, die in diesen Zellen replizieren; die Zellen weisen eine Deletion des menschlichen ASAR6-Gens auf, das sich an Position 6q16.1 befindet. Nach einer fünfstündigen Behandlung mit BrdU wurden mitotische Zellen gesammelt und zur Detektion der BrdU-Inkorporation sowie zur fluoreszenten in-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer Chromosom-6-Malprobe aufgearbeitet; die beiden Chromosom-6-Exemplare zeigen drei fluoreszierende Markierungen.

Der signifikante Unterschied im BRDU-Bandingmuster stimmt mit der Verzögerung der Replikationszeit um mehr als zwei Stunden für eines der Chromosom 6 überein. Die Cyto-vision-Software zeigt die unterschiedlichen Signalintensitätsprofile für DPI und BRDU auf den beiden Chromosomen 6, was auf eine asynchrone Replikation hinweist. Zusätzlich besteht ein signifikanter Unterschied in der Gesamtmenge der BRDU-Inkorporation im Vergleich zu einer ähnlichen Analyse der DPI-Färbung.

Die Einbindung einer Rückprobe, die das humane AR-sechs-Gen enthält, verdeutlicht das einzelne Chromosom sechs, das eine Deletion in seinem langen Arm in dieser Zelle aufweist. Interessanterweise erfolgt eine intensivere BRDU-Inkorporation und zeigt sich ein ausgedehnteres Bandmuster der BRDU-Inkorporation im Vergleich zum nicht-ED-Chromosom sechs. Als Mitosespreizungen aus sieben verschiedenen Zellen zur Quantifizierung des Unterschieds in der Replikationszeit zwischen den Chromosomen sechs verarbeitet wurden.

Die BRDU-Konzentrationen zeigen einen mehr als zweifachen Unterschied zwischen den Gesamtpixelwerten der gelöschten und der nicht-ED-Chromosomen sechs. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei Tagen korrekt durchgeführt werden. Wir hoffen, dass Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Replikation gemessen wird, der Zeitpunkt der Replikation homologer Chromosomen innerhalb derselben Zelle bestimmt wird und wie chromosomale Umstrukturierungen eindeutig identifiziert werden können, die mit Veränderungen in der Replikation korrelieren.

Zeitliche Abfolge gesamter Chromosomen.