Analysieren und Bauen Nukleinsäurestrukturen mit 3DNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Laborwissenschaftlern und anderen die 3D-NA-Programmsuite zur Verfügung zu stellen, um die räumliche Organisation von DNA und RNA mit modernsten Rechenwerkzeugen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Sie zuerst die Software aus dem 3D NA-Forum herunterladen und auf einem lokalen Computer installieren. Der zweite Schritt besteht darin, eine repräsentative DNA-Struktur auf der Ebene der Schritte der einzelnen Basenpaare zu analysieren.

Als Nächstes wird dieselbe DNA-Struktur auf der Ebene des Basenpaarschritts geändert und dann mit den neu definierten Parametern für den Basenpaarschritt neu erstellt. Der nächste Schritt ist die Analyse eines großen Ensembles verwandter Strukturen. Der letzte Schritt ist die Ausrichtung eines Satzes verwandter DNA-Strukturen auf einem gemeinsamen Bezugssystem, um globale Verzerrungen der Strukturen sichtbar zu machen.

Letztendlich werden die 3D-NA-Werkzeuge verwendet, um zu untersuchen, wie einzelne Basenpaarschritte, einschließlich derjenigen, die an Wirkstoffe und Proteine gebunden sind, zur Gesamtfaltung der DNA beitragen und um die Orte und Richtungen erheblicher globaler Verzerrungen zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Software robust und breit anwendbar auf eine Vielzahl unterschiedlicher Nukleinsäure-haltiger Strukturen ist. Die Methode kann helfen, zentrale Fragen der Biochemie und Biophysik zu beantworten, etwa wie Genome dreidimensional organisiert sind und welche Art von Verformung die DNA annehmen kann.

Um mit der Installation des Softwarepakets zu beginnen, verbinden Sie sich mit den drei DA website@xthreed. org und klicken Sie auf den Link zum 3D NA-Forum innerhalb des Forums. Wählen Sie den Registrierungslink aus und folgen Sie den Anweisungen, um ein neues Konto zu erstellen.

Sobald Sie einen Benutzernamen und ein Passwort festgelegt haben, loggen Sie sich in das Forum ein, wählen Sie im Willkommensbereich den Download-Link aus und wählen Sie auf der neuen Seite 3D NA download aus. Doppelklicken Sie auf die tar gz-Datei, um einen Ordner mit dem Namen X 3D NA dash V 2.1 zu erstellen, der die 3D NA-Software enthält. Öffnen Sie die Terminalanwendung, die auf einem Macintosh normalerweise unter Dienstprogramme zu finden ist, und wechseln Sie in das Verzeichnis X 3D NA dash V 2.1.

Führen Sie das Setup-Skript aus, das für die ordnungsgemäße Funktion von 3D NA erforderlich ist. Alle Befehle, die in diesem Video verwendet werden, finden Sie im Textprotokoll. Kopieren Sie als Nächstes die zweizeiligen Exporteinstellungen, die auf dem Bildschirm gedruckt angezeigt werden.

Wenn der Benutzer die Software im Anwendungsverzeichnis abgelegt hat, sollten die beiden Zeilen wie hier gezeigt angezeigt werden. Öffnen Sie die Anwendung zum Bearbeiten von Texten, die sich im Anwendungsverzeichnis befindet. Wählen Sie im Menü "Format" die Option "Nur-Text erstellen" aus.

Wenn eine BRC-Datei vorhanden ist, öffnen Sie die Datei im Text, bearbeiten Sie die Exporteinstellungen und fügen Sie sie am Ende der Datei ein. Wenn keine bash RC-Datei existiert, fügen Sie die Exporteinstellungen in eine leere Datei ein und speichern Sie sie unter dem Dateinamen bash RC im Home-Verzeichnis. Damit die neuen Einstellungen verfügbar sind, führen Sie die neu gespeicherte Bash RC-Datei im Terminalprogramm aus.

Dieses Video zeigt die Analyse einer repräsentativen Nukleinsäurestruktur, der DNA, die an das HBB-Protein aus dem Bakterium Borrelia bergdorf eye gebunden ist. Der erste Schritt in der 3D-NA-Analyse ist die Erstellung einer Datei, in der alle gepaarten Basen aufgelistet sind. Dies geschieht durch Eingabe eines Befehls, um das Programm Find para auf die in der Datei gespeicherte atomare Struktur auf NP two, MP two pdb anzuwenden.

Der nächste Schritt in der Analyse besteht darin, die geometrischen Parameter zu bestimmen, die die Struktur charakterisieren. Der Befehl analyze nimmt als Eingabe die Basispaardatei und erstellt mehrere Ausgabedateien, die im Arbeitsverzeichnis erscheinen. Die geometrischen Werte können dann durch Eingabe berechnet werden, analysieren Sie zwei MP zwei bps.

Zu den generierten Ausgabedateien gehören zwei MP two out, die einen Überblick über die berechneten Parameter enthalten, und bpco step par, das eine Liste der Starrkörperparameter enthält. Neben der Analyse der Nukleinsäurestruktur bietet die 3D-NA-Software die Möglichkeit, ein Strukturmodell aus Starrkörperparametern mit dem Befehl rebuild zu erstellen, um ein ungefähres atomares Modell zu erstellen. Dies enthält Koordinaten sowohl für das Rückgrat als auch für die Basisatome. Geben Sie den Befehl ein, der im Text aufgeführt ist. Dieser Befehl weist 3D NA an, eine standardmäßige BDNA-Backbone-Bestätigung bei der Konstruktion von Modellen aus Starrkörperparametern einzuführen.

Ein doppelhelikales Modell mit den Steifkörperparametern, die in der H-B-B-D-N-A-Struktur zu finden sind, kann dann durch Eingabe des entsprechenden Befehls erstellt werden. Die bpco step par-Datei kann bearbeitet werden, um eine geänderte Struktur zu generieren. Dabei werden die extremen Walzwinkel, die an den beiden Stellen der größten Biegung gebildet werden, modifiziert.

Die Struktur wird dann mit dem geänderten Satz von Schrittparametern als Eingabedatei erstellt. Die beiden Modelle können mit einem molekularen Standardbetrachter betrachtet werden, im Gegensatz zur Analyse einer einzelnen Nukleinsäure-haltigen Struktur. In diesem Teil des Videos wird gezeigt, wie ein großes Ensemble von Strukturen in einer Reihe von Dateien analysiert wird, beginnend mit den Namen MD underscore set one PDB und endend mit einer Zahl.

Der erste Schritt in der Analyse ist die Identifizierung der gepaarten Basen, die durch das Ausführen des Programms find pair wie zuvor erhalten wurden, da der gesamte Satz von Strukturen das gleiche Basenpaarungsschema teilt, muss man find pair einmal auf eine repräsentative Datei hier ausführen, die Datei endet mit 1001. Dadurch werden die Basis-Pairing-Informationen generiert und in der Datei MD bei Set One BPS PS gespeichert. Im nächsten Schritt werden die geometrischen Parameter des gesamten Satzes von Strukturen mithilfe des Command X 3D ncore-Ensembles ermittelt. Analysieren. Anschließend können die gewünschten Steifkörperparameter aus der Übersichtsausgabedatei MD bei set one herausextrahiert werden.

Dies wird mit dem Command X drei DCO-Ensemble-Extrakt durchgeführt. Die Rollwinkel werden extrahiert und eine durch Kommas getrennte Textdatei der Rollwinkel erstellt. Diese Datei kann in andere Programme eingelesen werden, um sie weiter zu analysieren und zu plotten.

Die neueste Version von 3D NA verfügt über eine neue Funktion, die es einem Benutzer ermöglicht, mehrere Strukturen aus einer gemeinsamen Perspektive zu betrachten. Der Befehl X three DCO ensemble reorient überlagert eine Sammlung verwandter Strukturen auf einem gemeinsamen Basenpaar oder Basispaarschritt, wie in früheren Protokollen. Der erste Schritt besteht darin, die Basenpaarung der DNA mit dem Programm "Paar finden" zu berechnen.

In diesem Fall besteht die Eingabedatei aus zwei KEK pdb, der Datei, die die 10 Strukturen des CIA coli, O 3D NA-Operators enthält, der an das Kopfstück des LAC-Repressor-Proteins gebunden ist. Mit der Neuausrichtung des Command X Three-DCO-Ensembles werden die einzelnen Modelle in einer Struktur mit mehreren Modellen auf einem gemeinsamen Referenzrahmen ausgerichtet. Für diesen Befehl sind sowohl die PDB-Datei als auch die Basis-Pairing-Datei aus dem vorherigen Schritt als Eingabe erforderlich.

Ebenfalls im Befehl enthalten ist die Identität des Basispaarschritts, an dem alle Strukturen ausgerichtet sind. Die W 3D NA Weboberfläche enthält einige beliebte Funktionen des 3D NA Softwarepakets. Dieser Teil des Videos lenkt die Aufmerksamkeit auf die Möglichkeit, mit dem Webserver dreidimensionale Modelle von proteindekorierter DNA zu erstellen.

Der erste Schritt zum Aufbau eines proteindekorierten DNA-Modells besteht darin, die W 3D NA-Website zu besuchen, die sich in W drei d.rutgers.edu befindet. Die Auswahl der Rekonstruktion aus dem Menü oben links auf der Seite aktiviert die Funktionen zur Online-Modellerstellung. Der nächste Schritt besteht darin, den Link zur Vorlage für gebundene Protein-DNA auszuwählen, der sich in dem leicht schattierten Feld in der Mitte der neuen Seite befindet.

Diese Auswahl aktiviert ein Pulldown-Menü, in dem der Benutzer die Anzahl der gebundenen Proteine festlegen kann. Die Auswahl der Anzahl der gebundenen Proteine führt zu einer neuen Spezifikationsseite. Der Benutzer kann dann in der gewünschten Reihenfolge eingeben oder einfügen.

Im Textfeld befindet sich in der Mitte der neuen Seite ein Pulldown-Menü unterhalb des Textfelds, um die helikale Bestätigung der ungebundenen DNA-Regionen auszuwählen. Am unteren Rand der Spezifikationsseite befindet sich ein Textfeld, in das Sie die Bindungspositionen und Dateinamen der gebundenen Proteine eingeben können. Die Bindungsposition gibt die Position des Zentrums des proteingebundenen Fragments auf der DNA-Sequenz an.

Am unteren Rand der Spezifikationsseite befindet sich ein Feld, das es dem Benutzer ermöglicht, eine Vorschau der proteingebundenen DNA zu erstellen. In diesem Fall ist dieses Kontrollkästchen aktiviert und auf die Schaltfläche Weiter geklickt wird. Diese Aktion generiert eine Überprüfungsseite, auf der die ausgewählten Parameter sowie alle Fehler aufgeführt sind, die möglicherweise durch die Überlappung der ausgewählten Bindungsstellen aufgetreten sind.

Der Benutzer kann die Schaltfläche "Zurück" auswählen, wenn Änderungen vorgenommen werden müssen, oder die Schaltfläche "Erstellen", um fortzufahren. Die nächste Seite zeigt ein statisches Bild des DNA-Proteinkomplexes in seiner umfangreichsten Anordnung und ermöglicht eine interaktive Online-Visualisierung über das Web. Der Benutzer kann auch eine Datei herunterladen, die atomare Koordinaten enthält.

Die 3D-NA-Softwaretools werden routinemäßig zur Analyse von Nukleinsäurestrukturen eingesetzt. Die Werte der Starrkörperparameter zeigen Verzerrungen in der dreidimensionalen Struktur, wie z. B. die beiden Stellen extremer DNA-Biegung in die Hauptrille mit großen positiven Rollwinkeln, die in den Schritten 13 und 22 zu finden sind. Im Kristallkomplex der DNA mit den Borrelien Bergdorf, RHBB Protein.

Die Fähigkeit der Software, Strukturen aus diesen Größen zu rekonstruieren, ermöglicht es, zu bestimmen, wie einzelne Schritte von Basen und Basenpaaren zur gesamten Molekülfaltung beitragen. Wie hier dargestellt, spiegelt die durch HBB induzierte globale Krümmung der DNA mehr als die beiden oben genannten extremen Rollenverzerrungen wider. Die DNA bleibt stark gekrümmt, wenn sie rekonstruiert wird, wobei diese Basenpaarschritte begradigt werden.

Das ist der Fall, wenn die beiden größten Werte der Rolle auf Null gesetzt wurden. Die neue Fähigkeit in 3D NA, eine große Anzahl verwandter Strukturen zu untersuchen, ermöglicht es, sowohl sequenz- als auch zeitabhängige Muster in der räumlichen Anordnung von simulierten DNA- und RNA-Molekülen zu extrahieren. Zum Beispiel zeigt die gelbe Farbbeschichtung der Rollwinkel zwischen aufeinanderfolgenden Basenpaaren in zwei großen Sätzen simulierter DNA-Strukturen die bevorzugte Biegung dieser Moleküle in permischen Purin-Basenpaar-Schritten.

Die höheren Rollwerte, die in Rot dargestellt sind und für kurze Zeit an den Enden der DNA bestehen bleiben, deuten auf ein lokalisiertes Schmelzen und Wiederauftauchen der Doppelhelic-Struktur hin. Die Variationsmuster anderer Starrkörperparameter, wie z.B. die Winkel und Abstände zwischen komplementären Basen, können helfen, die genauen strukturellen Verzerrungen zu entschlüsseln. Die Fähigkeit der 3D-NA-Software, verwandte Moleküle in einem gemeinsamen Referenzsystem neu auszurichten, enthüllt Merkmale der Gesamtstruktur, die in vielen der in der Proteindatenbank gespeicherten Dateien verborgen sind.

Zum Beispiel erzeugt die konventionelle Ausrichtung verwandter Strukturen auf der Grundlage einer mittleren quadratischen Passung entsprechender Atome eine Reihe ähnlicher räumlicher Bahnen, die sich hier ungefähr überlagern, die 10 NMR-basierten Modelle des Esia coli, O 3D NA-Operators, die an die Kopfstücke des LAC-Repressorproteins gebunden sind, Die Überlagerung der gleichen Strukturen auf einem gemeinsamen Koordinatensystem auf den fünf Primzahl-Endbasispaaren jedes Duplex offenbart beträchtliche Verzerrungen der globalen Struktur, in der sich die Moleküle in deutlich unterschiedliche Richtungen biegen. Die strukturelle Variabilität kann die Leichtigkeit beeinflussen, mit der das CIA coli LAC-Repressorprotein O drei bindet und eine Schleife zwischen O drei und sequentiell entfernten Operatoren in der LAC-Operation induziert. Wie hier dargestellt, kann die präzise Platzierung eines architektonischen Proteins wie HBB aus Borrelia burgdorferi einen dramatischen Einfluss auf die Gesamtfaltung der DNA haben.

Wenn zwei Kopien der bekannten hochauflösenden Struktur durch 43 Basenpaare getrennt sind, schließt sich ein DNA-Fragment mit 81 Basenpaaren zu einer engen, fast kreisförmigen Konfiguration. Werden die beiden Proteine durch weitere fünf Basenpaare getrennt, folgt die DNA einem offenen Mäanderweg. Die sehr unterschiedlichen Anordnungen des proteindekorierten Duplex zeigen, wie die Abstände von Architekturproteinen die Cyclisierung oder Schleife der DNA nach ihrer Entwicklung beeinflussen können.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Nukleinsäure-Strukturbiologie den Weg, um DNA-Protein-Interaktionen, RNA, Faltung und Nanopartikeldesign zu erforschen, um ein besseres Verständnis von Entwicklungsdefekten und Krankheiten wie Krebs zu erlangen und neue Therapeutika zu entwickeln.