Name: Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Erfahren Sie die hocheffiziente, ortsspezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA unter Verwendung von Mikroelektroden-Arrays. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle und verbesserte Aufnahme im Vergleich zu konventionellen Verfahren.

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Ein. MEA Vorbereitung <ol><li> MEAs zur Verwendung bei Elektroporation Experimenten kann entweder unter Verwendung von Standard-Photolithographietechnik werden, wie zuvor beschrieben 18 oder direkt von gekauften Anbieter von MEA Herstellern wie Multi Channel Systems <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> und Alpha MED Scientific, Inc. <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Die MEAs in unseren Experimenten verwendet wurden, in-house im Reinraum in Arizona State University, die vom Center for Solid State Electronics Research (CSSER) verabreicht wird hergestellt. Die MEAs in unseren Experimenten verwendet wurden, hatten 32 Indium-Zinn-Oxid-Elektroden in einem 8 x 4 Array mit Elektroden-Durchmesser Größen von 50-200 um innerhalb eines 1 cm Innendurchmesser Glas gut. Das Glas wurde auch auf der MEA unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) verklebt ist. </li><li> Sterilisieren MEA in einem Autoklaven vor cell seeding. Andere Verfahren zum Sterilisieren wie eine Einweichen in 70% Ethanol, UV-Behandlung und Behandlung mit heißem Wasser als auch an anderer Stelle beschrieben verwendet, so lange sie nicht gefährden die Integrität des MEA werden. </li><li> Übertragen Sie die autoklaviert MEA zu einer laminaren Strömung Haube und legen Sie sie in einem Standard-sterile Polystyrol Petrischale. Vor dem Aussäen Zellen auf der MEA, sterilisieren Laminarströmungshaube durch Einschalten der UV-Licht für 20 min. Wenn der MEA ist empfindlich gegenüber UV-Licht decken die Petrischale mit der MEA mit steriler Aluminiumfolie während die Strömung Haube ist unter UV-Beleuchtung. </li></ol> 2. Seeding Cells auf der MEA <ol><li> Ernte von Zellen aus einem laufenden Zelllinie von adhärenten Säugetierzellen mit Trypsin / EDTA und heben sie bis zu einer Konzentration von 100-200 Zellen / ul in 1 ml Zellmedium zum Plattieren. In unseren Experimenten haben wir bei der Kultivierung NIH 3T3 Fibroblasten-Zelllinie HeLa-Zelllinie und primären kortikalen und hippocampalen Neuronen auf der MEA erfolgreich. </li><li&gt; Legen Sie eine 20-30 ul Tropfen Medien mit Zellen auf der MEA. Übertragen Sie die Petrischale mit der MEA in den Inkubator. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zelle Tropfengröße groß genug, um alle Elektroden auf der MEA abzudecken. </li><li> 2 h nach dem Aussäen der Zellen übertragen die Petrischale mit der MEA aus dem Inkubator in Laminarströmungshaube und sanft hinzuzufügen 400-500 ul pre erwärmt Medien (37 ° C) zu der MEA gut. Unter dem Mikroskop zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zellen noch gebunden sind und gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt MEA. Übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator. Das 2 hr Warteperiode vor der Zugabe von Medien sorgt genügend Zeit für die Zellen mit der MEA Oberfläche haften. Zugabe von Zell-Medien zu früh nach dem Aussäen der Zellen abzuwaschen die Zellen. Wenn Zellen nicht gut haften kann auf der MEA, kann seine Oberfläche mit Zellhaftung Faktoren wie aspolylysine, Fibronectin und Laminin behandelt werden, um die Zelladhäsion zu verbessern. In unserem HeLa-Zelle Experimente, die wir in der Regel behandeln die MEA Oberfläche mit fibronectin (10 ug / ml) für 1-2 Std. </li><li> 8-12 Stunden nach dem Aussäen der Zellen, führen 1-2 Waschgängen mit PBS sie keine toten Zellen zu entfernen. Zellmedium ersetzt alle 24-48 Stunden nach Bedarf. In einem typischen Experiment werden die Zellen gewöhnlich Transfektion 24-48 h nach der Aussaat. Um die Konsistenz bei der Elektroporation Effizienz zu erhalten empfiehlt es sich zu warten, bis die Kultur ist mindestens 80% konfluent vor der Elektroporation. </li></ol> 3. Site-spezifische Transfektion von siRNA <ol><li> Planen Nukleinsäurelösung. Für siRNA Transfektion, bereiten Sie einen 1-2 uM siRNA Elektroporation Lösung in eiskaltem Elektroporationspuffer, um ein Endvolumen von 200-400 ul erreichen. In diesem Video Artikel zeigen wir die Transfektion von HeLa-Zellen mit Alexa 488 konjugierten verschlüsselten Sequenz von siRNA. </li><li> Übertragen der MEA mit Zellen aus dem Inkubator in sterilen Sterilbank. Entfernen Sie die Zelle Medien aus dem MEA und führen Sie einen Waschgang mit PBS. Danach fügen 200-400 ul des ice kalten 1 uM siRNA Elektroporation Lösung für das gut. </li><li> Anwenden anodischen quadratischen elektrische Impulse an die gezielte Elektroden (siehe 4 zur Bestimmung der optimalen Parameter des elektrischen Impulses Schritt). In unseren Experimenten verwendeten wir einen pragmatischen Instruments 2414A Waveform-Generator in elektrische Impulse und ein Dual-Inline-Package (DIP) 16 pin clip den Kontakt mit den MEA Bondpads machen zu generieren. Der Wellenformgenerator können zur DIP Clips über einen Demultiplexer Leiterplatte an Selektivität der einzelnen Elektroden bereitzustellen angeschlossen werden. Für die Referenzelektrode, legen eine Stahlkathode in dem Zellmedium. Gleichzeitig wird der Stahl Referenzelektrode in den Medien ist es extrem wichtig, um sicherzustellen, dass es keinen Kontakt mit der MEA Oberfläche. Bei Kontakt, kann es zu Schädigungen der Zellen und der MEA. Es wird empfohlen, um die Referenz-Elektrode mit einer Höhe von mindestens 1 mm oberhalb der Zellen abzusenken. Ein Abstandshalter mit einer Höhe von 1 mm können in der Vertiefung zu helfen bei Platzierung des ref abgegeben werdenerenz Elektrode. Ein alternativer Ansatz zur Verwendung eines externen Referenzelektrode ist in benachbarte Elektroden als Kathoden-Anoden-Paare verwendet werden. </li><li> Sofort nach dem Auftragen die elektrischen Impulse an die gezielte Elektroden auf der MEA, übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator. Nach einer Inkubationszeit von 5 min sanft ersetzt 75% des Elektroporation Puffer mit vorgewärmten (37 ° C) Zelle Medien. Später kann Fluoreszenz-Bildgebung durchgeführt, um die Lieferung von fluoreszierend markierten siRNA zu den Zellen zu bestätigen. </li></ol> 4. Elektroporation Parameter Optimization <ol><li> Um die optimalen elektrischen Pulsparameter zur Elektroporation, Design Elektroporation Experimente für einen Bereich von Werten der Impulsamplitude, Impulsdauer, und die Anzahl der Impulse zu bestimmen. Nach unserer Erfahrung mit HeLa-Zellen wurde beobachtet, dass ein einzelner Spannungspuls von Amplitude von 3 V bis 9 V, und die Dauer von 1 msec bis 10 msec für eine Elektrode eine Größe von 100 um führte zu erfolgreichen Elektroporation mit minimal Zelltod. Es ist unsere Empfehlung, dass ein Parameter zu einem Zeitpunkt variiert werden und andere konstant gehalten werden. Um die Effizienz Elektroporation für jeden der Impulsparameter quantifizieren, verwenden wir Propidiumiodid (PI), eine Zelle impermeante Farbstoff daß Flecken Nukleinmaterial und Live Assay basierte Methodik, wie in Schritten von 4,2 bis 4,5 beschrieben. </li><li> Stellen Sie eine Zellkultur auf der MEA nach den Anweisungen in Schritt 1 und 2 dargestellt. </li><li> Vor der Elektroporation bereiten 300-500 ul von 30 ug / ml PI-Lösung in eiskaltem Elektroporation Puffer und 400 ul von 4 uM calcien AM-Lösung in PBS. </li><li> Übertragen der MEA aus dem Inkubator zur Sterilbank. Entfernen Sie die Zelle Medien aus dem MEA und führen Sie einen Waschgang mit PBS. Danach fügen 300-500 ul des eiskalten Elektroporation Puffer mit PI. </li><li> Anwenden elektrischer Impulse mit gewünschten Puls Amplitude und Dauer, um die gezielten Elektroden (Die Ausrüstung in unseren Experimenten zum Erzeugen und Anlegen des elek verwendettric Impuls an der MEA im Schritt 3.3) beschrieben. Für die Referenzelektrode entweder abzusenken einen Stahl-Elektrode in die Elektroporationspuffer in der MEA gut oder den benachbarten Elektrode als Referenz. Durch selektives Anlegen von Impulsen variierender Amplituden oder Dauern, um verschiedene Elektroden mehrere Experimente können auf demselben Gerät durchgeführt werden. Beispielsweise auf einem 32-Elektrode MEA kann durch Spalten 8 Versuche durchgeführt werden, um die Elektroden 32 in 8 Gruppen, jeweils bestehend aus 4 Elektroden. Jede der acht Gruppen können dann durch einen einzigen rechteckigen Spannungsimpuls von 5 msec Dauer mit variierenden Amplituden in 3 V-6 V bei 0,5 V-Schritten und eine Gruppe stimuliert werden kann als Kontrolle verwendet werden. </li><li> Unmittelbar nach dem Auftragen die Spannungsimpulse übertragen die MEA zum Inkubator für 5 min. Danach entfernen Sie vorsichtig 75% der Elektroporation Puffer aus dem MEA gut und ersetzen Sie es mit warmem Zellmedien. Übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator. </li><li> Nach einer Inkubationszeit von 2-4 hersetzen Sie die Zelle Medien in der MEA gut mit 300-500 ul 4 uM Calcein AM-Lösung in PBS. Übertragen Sie die MEA zurück zum Inkubator für weitere 30 min. </li><li> Nach der Inkubation der Zellen mit Calcein AM, Calcein AM ersetzen Lösung in der MEA gut mit PBS nach zweimaligem Waschen mit PBS. Erhalten Fluoreszenzbilder der Zellen unter Verwendung mit einem optischen Mikroskop mit Filtern für PI (Anregung / Emission - 535 nm/617 nm) und Calcein AM (Anregung / Emission - 490 nm/520 nm). Die Aufnahme von PI aufgrund Elektroporation bewirkt Zellen fluoreszieren rot und die Calcein AM verursacht Zellen, die lebendig zu fluoreszieren grün sind. Drei mögliche Szenarien, die beobachtet werden können, sind 1) Zelle elektroporierten und lebendig (fluoreszieren sowohl rot und grün), 2) Cells lebendig, aber nicht elektroporiert (fluoresziert nur grün) und 3) Cells Toten durch Elektroporation (fluoresziert nur rot) . Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozent der Gesamtzahl der Zellen am Leben auf der Elektrode und der Elektroporation eff berechneticiency wurde als Prozent der Gesamtzahl der Zellen mit PI / siRNA geladen berechnet. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt die site-spezifische Belastung von HeLa-Zellen mit PI. Es kann beobachtet werden, dass nur Zellen auf der Elektrode eine Aufnahme von PI (1B) nachzuweisen. Ein Live-Assay durchgeführt nach der Elektroporation wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen (1A) zu beurteilen. Die Elektroporation Effizienz und Zelllebensfähigkeit für das Beispiel in 1 gezeigt sind 81,8% und 96,1% betragen. Hohe Zelllebensfähigkeit und Elektroporation Effizienz kann durch Optimierung der Elektroporation Pulsparameter erreicht werden. Ortsspezifische Transfektion von HeLa-Zellen mit fluoreszierend markierten siRNA zur optimierten Impulses Elektroporation (8 V, 1 ms) ist in Abbildung 2 gezeigt. Die Elektroporation Effizienz für die siRNA bei 8 V, 1 ms wurde festgestellt, dass 74,4 von ± 16,0% undZelllebensfähigkeit wurde gefunden, 87,9 ± 8,4% (alle Angaben als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, N = 5) sein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ortsspezifische Lieferung von PI in HeLa-Zellen auf einem 200 um-Elektrode (6 V, 5 ms). A) Calcien basierende Live-Assay durchgeführt 2 h nach der Elektroporation. Lebenden Zellen werden durch grüne Fluoreszenz. B) Rot-Fluoreszenz zeigt die Aufnahme von PI von Zellen auf der Elektrode. C) Eine überlagerte Bild von A und B. Die weißen Pfeile zeigen Zellen, die Elektroporation und lebendig sind. Die schwarzen Pfeile zeigen Zellen, die tot sind. Der weiße Kreis in A, B und C zeigt den Umriss der Elektrode. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Abbildung 2. Transfektion von HeLa-Zellen mit fluoreszenzmarkierten scramble Abfolge von siRNA. A) Bild von HeLa-Zellen auf einem 100 um Elektrode mit Alexa 488 markierten siRNA (8 V, 1 ms) transfiziert. B) Bild von Zellkerne mit DAPI gefärbt. Der weiße Kreis markiert den Rand der Elektrode.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video Artikel zeigen wir die Verwendung von MEA für die ortsspezifische Transfektion von HeLa-Zellen mit verschlüsselten Sequenz von siRNA. Einer der Vorteile dieser Technologie ist die Anwendbarkeit auf verschiedene Zelllinien einschließlich primären Zelllinien. Unser Labor hat zuvor die Verwendung dieser Technologie für die ortsspezifische Transfektion von primären hippocampalen Neuronen Kultur von E18 Tage alten Ratten und NIH-3T3-Zellen mit verwürfelten siRNA Sequenzen und GFP-Plasmid 18, 19 gez...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Cell-Medium: Erweiterte MEM L-Glutamin 200 mM Penicillin / Streptomycin Fötales Rinderserum </td><td> Gibco / Invitrogen HiMedia Laboratories / VWR Lonza Group Ltd Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Cell-Medium Zusammensetzung: 2% FBS, 2% L-Glutamin und 2% Pennstrep in Advance MEM </td></tr><tr><td> Trypsin EDTA </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 und Rhodamin markiert kletterte sequENCE siRNA </td><td> Qiagen, Inc. </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroporationspuffer </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Wellenformgenerator </td><td> Pragmatisch </td><td> 2414A </td><td> Jede Wellenform / Impulsgenerator, die die gewünschten Impulse liefern kann, kann verwendet werden. </td></tr></table>

hohe effizienz, site-spezifische transfektion adhärenter zellen mit sirna mit mikroelektroden-arrays (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

Die Entdeckung von RNAi in Eukaryoten und der anschließenden Entwicklung von RNAi Mittel wie siRNA und shRNA, haben eine potente Verfahren zum Silencing spezifische Gene 1-8 für funktionelle Genomik und Therapeutika erreicht. Eine große Herausforderung bei RNAi basierenden Studien beteiligt ist die Lieferung von RNAi Agenten gezielt Zellen. Traditionelle non-viralen Techniken, wie Bulk-Elektroporation und chemische Transfektionsmethoden fehlt oft die notwendige räumliche Kontrolle über Lieferung und leisten schlechte Transfektionseffizienz 9-12. Jüngste Fortschritte in der chemischen Transfektionsmethoden wie kationische Lipide, kationische Polymere und Nanopartikel wurden in stark verbesserte Transfektionseffizienzen 13 geführt. Allerdings sind diese Techniken immer noch nicht präzise räumliche Kontrolle über Lieferzeiten, die immens Hochdurchsatz-Technologien, einzelne Zelle Studien und Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen können miniaturisierte Nutzen bieten. nt &quot;&gt; Neueste technologische Fortschritte in der Gentransfer haben High-Throughput-Transfektion von adhärenten Zellen 14-23, ein Großteil davon mikroskaligen Elektroporation verwenden aktiviert. Microscale Elektroporation bietet präzise räumlich-zeitliche Kontrolle über Lieferung (bis auf einzelne Zellen) und hat sich gezeigt, um hohe Wirkungsgrade 19, 24-26. Zusätzlich zu erreichen, müssen Elektroporation Ansätze erfordern eine längere Inkubationszeit (in der Regel 4 Stunden) mit siRNA und DNA-Komplexe wie nötig in der chemischen Basis Transfektionsmethoden und führen zu direkten Eingabe der nackte siRNA und DNA Moleküle in die Zelle Zytoplasma. Als Folge Genexpression kann bereits sechs Stunden nach der Transfektion 27 erreicht werden. Unser Labor hat zuvor die Verwendung von Mikroelektrodenarrays (MEA) für die ortsspezifische Transfektion in adhärenter Säugerzellkulturen 17-19 gezeigt. In der MEA Ansatz, erfolgt die Lieferung der genetischen Nutzlast über lokale Mikro-Maßstab electroporati erreichtauf der Zellen. Eine Anwendung des elektrischen Impulses an den ausgewählten Elektroden erzeugt lokale elektrische Feld, die Elektroporation von Zellen in der Region der stimulierten Elektroden führt. Die unabhängige Steuerung der Mikroelektroden stellt räumliche und zeitliche Steuerung über Transfektion und ermöglicht auch mehrere Transfektion basierte Experimente auf der gleichen Kultur durchgeführt werden Erhöhung des Durchsatzes und zur Verringerung experimentellen Kultur-zu-Kultur Variabilität. Hier beschreiben wir den Versuchsaufbau und das Protokoll für die gezielte Transfektion von adhärenten HeLa-Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten verschlüsselten Sequenz siRNA mittels Elektroporation. Das gleiche Protokoll kann auch zur Transfektion von Plasmid-Vektoren verwendet werden. Zusätzlich kann das hier beschriebene Protokoll leicht an eine Vielzahl von Säugetier-Zelllinien mit geringfügigen Modifikationen verlängert werden. Kommerzielle Verfügbarkeit von MEAs sowohl mit vordefinierten und benutzerdefinierten Elektrode Muster machen diese Technik zugänglich to die meisten Forschungslabors mit grundlegenden Zellkultur Ausrüstung.

Der Artikel beschreibt das Protokoll für ortsspezifische Transfektion von verscrambeltem Sequenz von siRNA in einer anhaftenden Säugerzellkultur mit Hilfe eines Mikroelektrodenfeldanordnung (MEA).

Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)

Die Entdeckung des RNAi-Signalwegs in Eukaryoten und die anschließende Entwicklung von RNAi-Wirkstoffen, wie siRNA und shRNA, haben eine leistungsstarke Methode für ... ermöglicht.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine standortspezifische Transfektion in anhaftenden Zellen zu erreichen. Dies wird erreicht, indem eine Zellschicht auf einem Mikroelektrodenarray kultiviert wird. Im zweiten Schritt führt die Anwendung eines elektrischen Impulses auf ausgewählte Elektroden zur Elektroporation der gezielt angesiedelten Zellen, die auf der Oberseite der Elektroden haften.Dies führt zur Bildung von Poren in der Zellmembran, die den Eintritt exogener Moleküle in die Zelle ermöglichen. Die gezielten Zellen können anschließend mittels eines geeigneten Assays auf das resultierende Phänotyp untersucht werden. Die hier beschriebene mikroskalige Transfektionstechnik weist mehrere entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen Transfektionsmethoden wie der Bulk-Elektroporation oder der chemischen Transfektion auf.A, ermöglicht es uns, eine exquisit präzise räumliche Kontrolle über den Transfektionsprozess selbst zu erzielen, und hilft dabei, einzelne Zellen oder Zellverbände mit hoher Effizienz zu transfizieren, selbst bei Zelllinien, die schwer zu transfizieren sind. B, es ist ein Ansatz, der sich leicht hochskalieren lässt und uns dabei unterstützt, molekulare Assays mit hohem Durchsatz durchzuführen. Einer der entscheidenden Vorteile der Verwendung eines mikroelektrodenbasierten Bereichs für ortsspezifische Transfektion besteht darin, dass dadurch eine simultane funktionelle Beurteilung gezielter Zellen ermöglicht wird, beispielsweise quantitative Elektrophysiologie und morphologische Veränderungen.Um das Verfahren zu beginnen, sterilisieren Sie die MEA im Autoklaven, überführen Sie anschließend die autoklavierte MEA in eine laminare Luftströmungskabine und legen Sie sie vor dem Ansäen der Zellen auf die MEA in eine standardmäßige sterile Petrischale aus Polystyrol. Sterilisieren Sie die laminare Luftströmungskabine, indem Sie das UV-Licht für 20 Minuten einschalten. Falls die MEA empfindlich gegenüber UV-Licht ist, bedecken Sie die Petrischale mit der MEA mit steriler Aluminiumfolie, während die Luftströmungskabine unter UV-Bestrahlung steht. Behandeln Sie danach die MEA-Oberfläche für eine bis zwei Stunden mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin für HELO-Zellen.Führen Sie eine Spülung mit DI-Wasser durch und lassen Sie die MEA im laminaren Luftstromgehäuse lufttrocknen. Danach gewinnen Sie die Zellen aus einer wachsenden Zelllinie adhärenter Säugetierzellen mithilfe von Trypsin-ETTA und stellen sie in einer Konzentration von 100 bis 200 Zellen pro Mikroliter in einem Milliliter Zellkulturmedium zum Ansäen ein. Geben Sie anschließend einen Tropfen des Zellmediums mit einem Volumen von 20 bis 30 Mikrolitern auf die MEA.Stellen Sie sicher, dass es groß genug ist, um alle Elektroden auf der MEA abzudecken. Anschließend die Petrischale mit der MEA in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid überführen. Zwei bis vier Stunden.Nach dem Aussäen der Zellen überführen Sie die Petrischale mit der MEA aus dem Inkubator in die laminare Flussabsaughaube. Anschließend geben Sie vorsichtig 400 bis 500 Mikroliter vorgewärmtes Medium mit 37 Grad Celsius in die MEA-Vertiefung, und prüfen danach unter dem Mikroskop, ob die Zellen weiterhin an der MEA-Oberfläche haften und gleichmäßig verteilt sind. Danach bringen Sie die MEA erneut in den Inkubator zurück. Acht bis zwölf Stunden nach dem Aussäen der Zellen führen Sie ein bis zwei Spülschritte mit PBS durch, um tote Zellen zu entfernen.In einem typischen Experiment sind die Zellen üblicherweise 24 bis 48 Stunden nach der Aussaat für die Transfektion bereit. Um die Konsistenz der Elektroporationseffizienz zu gewährleisten, wird empfohlen, bis kurz vor die Konfluenz der Kultur zu warten, bevor die Elektroporation durchgeführt wird. Um eine hoch effiziente sarna-Transfektion zu erzielen, ist es notwendig, zunächst die optimalen Pulsparameter der Elektroporations-Spannung für ein gegebenes MEA zu bestimmen.Hier beschreiben wir eine Abfolge experimenteller Schritte, die die Verwendung von Propidiumiodid zur Bestimmung der optimalen Elektroporationsparameter vor der Elektroporation beinhalten. Bereiten Sie eine 300 bis 500 Mikroliter große Lösung mit 30 Mikrogramm pro Milliliter PI in eiskaltem Elektroporationspuffer sowie 400 Mikroliter einer vier Mikromolar Calcium-AM-Lösung in PBS vor. Überführen Sie anschließend die MEA aus dem Inkubator in die laminare Luftstrahlwerkbank.Entfernen Sie das Zellmedium von der MEA und waschen Sie mit PBS. Danach geben Sie 300 bis 500 Mikroliter des eiskalten Elektroporationspuffers mit Pi dazu. Anschließend platzieren Sie einen einen Millimeter hohen Abstandshalter in der MEA.Nun, es ist äußerst wichtig sicherzustellen, dass es die Zellen im Zentrum der MEA nicht berührt. Anschließend verbinden Sie die MEA mit dem elektrischen Anschluss und wählen die gewünschten Elektroden für die Elektroporation aus. Danach werden elektrische Impulse mit der gewünschten Impulsamplitude und -dauer auf die ausgewählten Elektroden für den Elektroporationsschritt appliziert.Senken Sie die mit Aluminiumfolie bedeckte Stahlkathode in das MEA-Loch ab, bis sie mit dem einen Millimeter dicken Abstandshalter in Kontakt kommt. Unmittelbar danach werden elektrische Impulse an die gezielten Elektroden angelegt. Anschließend wird der Schritt je nach experimentellem Design mit einem anderen Satz von Elektroden wiederholt.Bei unseren Experimenten mit Helo-Zellen stellten wir fest, dass ein einzelner Spannungsimpuls mit einer Amplitude von drei Volt bis neun Volt und einer Dauer von einer Millisekunde bis 10 Millisekunden bei einer Elektrode mit einer Größe von 100 Mikrometern zu einer erfolgreichen Elektroporation mit minimaler Zelltodrate führte. Unmittelbar nach der Applikation der Spannungsimpulse überführen Sie die MEA für fünf Minuten in den Inkubator.Nach einer Inkubationszeit von fünf bis zehn Minuten entfernen Sie den Abstandshalter vorsichtig von der MEA. Danach entfernen Sie 75 % des Elektroporationspuffers aus dem MEA-Loch und ersetzen ihn durch warmes Zellmedium. Anschließend bringen Sie die MEA wieder in den Inkubator zurück.Nach einer Inkubationszeit von zwei bis vier Stunden ersetzen Sie das Zellmedium in der MEA-Vertiefung durch 300 bis 500 Mikroliter einer vier Mikromolar Calcium-AM-Lösung in PBS. Stellen Sie die MEA nach der Inkubation der Zellen mit Calcium-AM erneut für 30 Minuten in den Inkubator. Ersetzen Sie nach einem Waschschritt das Calcium-AM in der Vertiefung durch PBS und nehmen Sie anschließend die fluoreszierenden Bilder der Zellen mit einem optischen Mikroskop mit Filtern für pi auf.Die Aufnahme von PI aufgrund der Elektroporation führt dazu, dass die Zellen rot fluoreszieren, und das Calcium AM verursacht, dass lebende Zellen grün fluoreszieren. Die Zellviabilität für jede Elektrode kann mit dieser Gleichung geschätzt werden, und die Elektroporationseffizienz für jede Elektrode kann mit dieser Gleichung geschätzt werden. Sobald die optimalen Elektroporationsparameter bestimmt sind, können sie für die ortsspezifische Abgabe eines Moleküls verwendet werden, und das Elektroporationsverfahren für siRNA-Moleküle ist identisch mit dem Elektroporationsverfahren für PI.Hier wird die ortsspezifische Applikation von Propidiumiodid in HELO-Zellen an einer 200-Mikrometer-Elektrode gezeigt. Der calciumbasierte Vitalitätsassay wurde zwei Stunden nach der Elektroporation durchgeführt. Die lebenden Zellen sind hier durch grüne Fluoreszenz gekennzeichnet, und die rote Fluoreszenz zeigt hier die Aufnahme von PI durch Zellen an der Elektrode an.Hier ist das überlagerte Bild. Diese Zellen sind elektroporiert und lebendig, während jene Zellen tot sind. Diese Abbildung zeigt die Transfektion von mit Rumine markiertem irna an einer 200 Mikrometer durchmessenden Elektrode, und diese Abbildung zeigt die Transfektion von Hela-Zellen mit Alexa 488-markiertem irna an einer 100 Mikrometer durchmessenden Elektrode.Die weißen Pfeile zeigen die mit irna transfizierten Zellen, während die schwarzen Pfeile die toten Zellen markieren. Die hier dargestellte Technik kann auf verschiedene Zelllinien ausgedehnt werden, einschließlich schwer zu transfizierender primärer Zelllinien, und ermöglicht die Transfektion mit größeren Molekülen wie Plasmiden und Proteinen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Messung der elektrophysiologischen Aktivität neuronaler Netzwerke mit Hilfe von Mikroelektrodenarrays

Wir beschreiben eine Methode für Depletion-Rescue-Experimente, die die zelluläre Integrität und Proteinhomöostase bewahrt. Die Adenofektion ermöglicht funktionelle Analysen von Proteinen innerhalb biologischer Prozesse, die auf fein abgestimmter Aktin-basierter Dynamik beruhen, wie z. B. mitotische Zellteilung und Myogenese, auf Einzelzellebene.

Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

Dieses Protokoll soll zeigen, wie in-vitro- Mikroelektrode Arrays mit mikrofluidischen Geräten für das Studium Aktionspotential Übertragung in neuronalen Kulturen zu verbinden. Datenanalyse, nämlich die Erkennung und Charakterisierung von Aktionspotentiale, Vermehrung ist durchgeführt mit einem neuen, erweiterten, aber benutzerfreundlich und frei verfügbar, computational Tool.

Interfacing Mikrofluidik mit Mikroelektrode Arrays für das Studium neuronale Kommunikation und axonalen Signalausbreitung

Dieses Protokoll beschreibt die Durchsatz-Plasmidtransfektion von Säugetierzellen in einer 384-Well-Platte mit akustischer Tröpfchenauswurftechnologie. Die zeitaufwändige, fehleranfällige DNA-Dosierung und Multiplexing, aber auch die Transfektionsreagenz-Dosierung, sind softwaregesteuert und werden von einem Nanospenderdurchgeführt ausgeführt. Die Zellen werden dann in diesen vorgefüllten Brunnen gesät.

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

Die Kombination aus Laserporation und Mikroelektrodenarrays (MEA) ermöglicht aktionspotentialartige Aufnahmen von kultivierten Primär- und Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten. Die Wellenformform bietet einen besseren Einblick in die Wirkungsweise von Testverbindungen als Standardaufzeichnungen. Es verbindet Patch-Clamp und MEA-Anzeige, um die kardiosichere Forschung in Zukunft weiter zu optimieren.

Laserinduzierte Aktionspotential-ähnliche Messungen von Kardiomyozyten an Mikroelektrodenarrays für erhöhte Vorhersagbarkeit der Sicherheitspharmakologie

Erfahren Sie die hocheffiziente, ortsspezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA unter Verwendung von Mikroelektroden-Arrays. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle und verbesserte Aufnahme im Vergleich zu konventionellen Verfahren.

Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)

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