Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine standortspezifische Transfektion in anhaftenden Zellen zu erreichen. Dies wird erreicht, indem eine Zellschicht auf einem Mikroelektrodenarray kultiviert wird. Im zweiten Schritt führt die Anwendung eines elektrischen Impulses auf ausgewählte Elektroden zur Elektroporation der gezielt angesiedelten Zellen, die auf der Oberseite der Elektroden haften.

Dies führt zur Bildung von Poren in der Zellmembran, die den Eintritt exogener Moleküle in die Zelle ermöglichen. Die gezielten Zellen können anschließend mittels eines geeigneten Assays auf das resultierende Phänotyp untersucht werden. Die hier beschriebene mikroskalige Transfektionstechnik weist mehrere entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen Transfektionsmethoden wie der Bulk-Elektroporation oder der chemischen Transfektion auf.

A, ermöglicht es uns, eine exquisit präzise räumliche Kontrolle über den Transfektionsprozess selbst zu erzielen, und hilft dabei, einzelne Zellen oder Zellverbände mit hoher Effizienz zu transfizieren, selbst bei Zelllinien, die schwer zu transfizieren sind. B, es ist ein Ansatz, der sich leicht hochskalieren lässt und uns dabei unterstützt, molekulare Assays mit hohem Durchsatz durchzuführen. Einer der entscheidenden Vorteile der Verwendung eines mikroelektrodenbasierten Bereichs für ortsspezifische Transfektion besteht darin, dass dadurch eine simultane funktionelle Beurteilung gezielter Zellen ermöglicht wird, beispielsweise quantitative Elektrophysiologie und morphologische Veränderungen.

Um das Verfahren zu beginnen, sterilisieren Sie die MEA im Autoklaven, überführen Sie anschließend die autoklavierte MEA in eine laminare Luftströmungskabine und legen Sie sie vor dem Ansäen der Zellen auf die MEA in eine standardmäßige sterile Petrischale aus Polystyrol. Sterilisieren Sie die laminare Luftströmungskabine, indem Sie das UV-Licht für 20 Minuten einschalten. Falls die MEA empfindlich gegenüber UV-Licht ist, bedecken Sie die Petrischale mit der MEA mit steriler Aluminiumfolie, während die Luftströmungskabine unter UV-Bestrahlung steht. Behandeln Sie danach die MEA-Oberfläche für eine bis zwei Stunden mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin für HELO-Zellen.

Führen Sie eine Spülung mit DI-Wasser durch und lassen Sie die MEA im laminaren Luftstromgehäuse lufttrocknen. Danach gewinnen Sie die Zellen aus einer wachsenden Zelllinie adhärenter Säugetierzellen mithilfe von Trypsin-ETTA und stellen sie in einer Konzentration von 100 bis 200 Zellen pro Mikroliter in einem Milliliter Zellkulturmedium zum Ansäen ein. Geben Sie anschließend einen Tropfen des Zellmediums mit einem Volumen von 20 bis 30 Mikrolitern auf die MEA.

Stellen Sie sicher, dass es groß genug ist, um alle Elektroden auf der MEA abzudecken. Anschließend die Petrischale mit der MEA in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid überführen. Zwei bis vier Stunden.

Nach dem Aussäen der Zellen überführen Sie die Petrischale mit der MEA aus dem Inkubator in die laminare Flussabsaughaube. Anschließend geben Sie vorsichtig 400 bis 500 Mikroliter vorgewärmtes Medium mit 37 Grad Celsius in die MEA-Vertiefung, und prüfen danach unter dem Mikroskop, ob die Zellen weiterhin an der MEA-Oberfläche haften und gleichmäßig verteilt sind. Danach bringen Sie die MEA erneut in den Inkubator zurück. Acht bis zwölf Stunden nach dem Aussäen der Zellen führen Sie ein bis zwei Spülschritte mit PBS durch, um tote Zellen zu entfernen.

In einem typischen Experiment sind die Zellen üblicherweise 24 bis 48 Stunden nach der Aussaat für die Transfektion bereit. Um die Konsistenz der Elektroporationseffizienz zu gewährleisten, wird empfohlen, bis kurz vor die Konfluenz der Kultur zu warten, bevor die Elektroporation durchgeführt wird. Um eine hoch effiziente sarna-Transfektion zu erzielen, ist es notwendig, zunächst die optimalen Pulsparameter der Elektroporations-Spannung für ein gegebenes MEA zu bestimmen.

Hier beschreiben wir eine Abfolge experimenteller Schritte, die die Verwendung von Propidiumiodid zur Bestimmung der optimalen Elektroporationsparameter vor der Elektroporation beinhalten. Bereiten Sie eine 300 bis 500 Mikroliter große Lösung mit 30 Mikrogramm pro Milliliter PI in eiskaltem Elektroporationspuffer sowie 400 Mikroliter einer vier Mikromolar Calcium-AM-Lösung in PBS vor. Überführen Sie anschließend die MEA aus dem Inkubator in die laminare Luftstrahlwerkbank.

Entfernen Sie das Zellmedium von der MEA und waschen Sie mit PBS. Danach geben Sie 300 bis 500 Mikroliter des eiskalten Elektroporationspuffers mit Pi dazu. Anschließend platzieren Sie einen einen Millimeter hohen Abstandshalter in der MEA.

Nun, es ist äußerst wichtig sicherzustellen, dass es die Zellen im Zentrum der MEA nicht berührt. Anschließend verbinden Sie die MEA mit dem elektrischen Anschluss und wählen die gewünschten Elektroden für die Elektroporation aus. Danach werden elektrische Impulse mit der gewünschten Impulsamplitude und -dauer auf die ausgewählten Elektroden für den Elektroporationsschritt appliziert.

Senken Sie die mit Aluminiumfolie bedeckte Stahlkathode in das MEA-Loch ab, bis sie mit dem einen Millimeter dicken Abstandshalter in Kontakt kommt. Unmittelbar danach werden elektrische Impulse an die gezielten Elektroden angelegt. Anschließend wird der Schritt je nach experimentellem Design mit einem anderen Satz von Elektroden wiederholt.

Bei unseren Experimenten mit Helo-Zellen stellten wir fest, dass ein einzelner Spannungsimpuls mit einer Amplitude von drei Volt bis neun Volt und einer Dauer von einer Millisekunde bis 10 Millisekunden bei einer Elektrode mit einer Größe von 100 Mikrometern zu einer erfolgreichen Elektroporation mit minimaler Zelltodrate führte. Unmittelbar nach der Applikation der Spannungsimpulse überführen Sie die MEA für fünf Minuten in den Inkubator.

Nach einer Inkubationszeit von fünf bis zehn Minuten entfernen Sie den Abstandshalter vorsichtig von der MEA. Danach entfernen Sie 75 % des Elektroporationspuffers aus dem MEA-Loch und ersetzen ihn durch warmes Zellmedium. Anschließend bringen Sie die MEA wieder in den Inkubator zurück.

Nach einer Inkubationszeit von zwei bis vier Stunden ersetzen Sie das Zellmedium in der MEA-Vertiefung durch 300 bis 500 Mikroliter einer vier Mikromolar Calcium-AM-Lösung in PBS. Stellen Sie die MEA nach der Inkubation der Zellen mit Calcium-AM erneut für 30 Minuten in den Inkubator. Ersetzen Sie nach einem Waschschritt das Calcium-AM in der Vertiefung durch PBS und nehmen Sie anschließend die fluoreszierenden Bilder der Zellen mit einem optischen Mikroskop mit Filtern für pi auf.

Die Aufnahme von PI aufgrund der Elektroporation führt dazu, dass die Zellen rot fluoreszieren, und das Calcium AM verursacht, dass lebende Zellen grün fluoreszieren. Die Zellviabilität für jede Elektrode kann mit dieser Gleichung geschätzt werden, und die Elektroporationseffizienz für jede Elektrode kann mit dieser Gleichung geschätzt werden. Sobald die optimalen Elektroporationsparameter bestimmt sind, können sie für die ortsspezifische Abgabe eines Moleküls verwendet werden, und das Elektroporationsverfahren für siRNA-Moleküle ist identisch mit dem Elektroporationsverfahren für PI.

Hier wird die ortsspezifische Applikation von Propidiumiodid in HELO-Zellen an einer 200-Mikrometer-Elektrode gezeigt. Der calciumbasierte Vitalitätsassay wurde zwei Stunden nach der Elektroporation durchgeführt. Die lebenden Zellen sind hier durch grüne Fluoreszenz gekennzeichnet, und die rote Fluoreszenz zeigt hier die Aufnahme von PI durch Zellen an der Elektrode an.

Hier ist das überlagerte Bild. Diese Zellen sind elektroporiert und lebendig, während jene Zellen tot sind. Diese Abbildung zeigt die Transfektion von mit Rumine markiertem irna an einer 200 Mikrometer durchmessenden Elektrode, und diese Abbildung zeigt die Transfektion von Hela-Zellen mit Alexa 488-markiertem irna an einer 100 Mikrometer durchmessenden Elektrode.

Die weißen Pfeile zeigen die mit irna transfizierten Zellen, während die schwarzen Pfeile die toten Zellen markieren. Die hier dargestellte Technik kann auf verschiedene Zelllinien ausgedehnt werden, einschließlich schwer zu transfizierender primärer Zelllinien, und ermöglicht die Transfektion mit größeren Molekülen wie Plasmiden und Proteinen.