Name: Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Implantation allogener mesenchymaler Stammzellen in Fibringerinnseln zur Behandlung osteochondraler Defekte im Kaninchenkniegelenk. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Geweberegeneration.

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Dieses Projekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Zuschuss HE 4578/3-1) und teilweise durch das FP7 EU-Projekt &quot;GAMBE&quot; NMP3-SL-2010-245993 finanziert.

A. Herstellung einer Donor Kaninchen zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (Chirurgie Zimmer) <ol><li> Die Zellen werden von männlichen New Zealand White (NZW) Kaninchen im Alter von 4 Monaten und ca. 3 kg Körpergewicht isoliert. </li><li> Induce Narkose durch Propofol (10 mg / kg Körpergewicht iv) und opfern mit Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht iv). </li><li> Shave Fell von Hinterbeine, Rücken und Bauch mit einem elektrischen Haarschneider und absaugen Fell. </li><li> Desinfizieren Sie die rasierte Fläche gründlich mit 70% Ethanol. </li><li> Mit stumpfen Pinzette, scharfe Schere (oder Skalpell) und Knochen-Fräser für Gewebe und Bänder. </li><li> Einen Einschnitt entlang der Schädelbasis Oberfläche des Beines und Kalb. </li><li> Reflect Haut und des subkutanen Gewebes durch entweder scharf oder stumpf. </li><li> Separate Muskeln und Bänder von Schienbein und Oberschenkelknochen. Halten Schnitten als dicht am Knochen wie möglich, um eine saubere Zerlegung machen. Nicht trennen Oberschenkelknochen von Tibia zu diesem Zeitpunkt. </li><li> Cut through das Hüftgelenk, um den Kopf des Oberschenkelknochens aus der Gelenkpfanne zu trennen. </li><li> Elevate die Tibia-Femur komplex. </li><li> Verwenden Sie das Skalpell abkratzen alle verbleibenden Weichteile von den Knochen oder reiben die Knochen mit sterilen Tuch Gewebe. An diesem Punkt werden Femur und Tibia noch angeschlossen. </li><li> Entfernen Patella durch Schneiden, dann schneiden Kniegelenk Bänder zu trennen Knochen schließlich. </li><li> Spray getrennt Knochen mit 70% Ethanol, der Luft trocknen lassen und legen jeden Knochen in einen 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Zellkulturmedium (DMEM + 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep)), um sie feucht. </li><li> Jetzt unter einem sterilen Zellkultur Laminarströmungshaube wechseln. </li></ol> B. Flushing von Kaninchen MSC aus Knochen und Expansion (Cell Culture Hood) <ol><li> Sammle Knochen von Rohren und legen Sie sie in 150 mm-Schalen mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Entfernen Sie beide Knochen endet mit einer sterilen Säge und bewegen, um neue Stücke 150 mm Gerichte. </li><li> Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit medium (DMEM), legen eine 18-Gauge-Nadel und stecken Sie in die Öffnung des Knochenmarks. </li><li> Dann spülen Markhöhle mit mittlerer bis das Knochenmark in die Schüssel zu spülen. Anschließend, aus dem anderen Ende spülen, wenn möglich. Falls erforderlich, absägen mehr von den Enden. Wenn Knochen brechen sollte, nur spülen Sie das Innere des Knochens. </li><li> Saugen Zellmedium Suspension in der Spritze und spülen Sie das Knochenmark so oft, bis Suspension frei schwimmenden durch das Knochenmark Hohlraum und ohne weitere Knochenmark-Klumpen erscheinen. </li><li> Sobald Knochenmark wurde aus allen Knochen gesammelt worden, die Knochenmark Klumpen, indem sie durch eine 18-Gauge-Nadel stören: füllen Spritze mit Nadel und verdrängen in Medium. </li><li> Danach, filtern die Suspension durch einen Filter in eine Zelle 50 ml Tube. Um Zellen zu verhindern, waschen Kulturschale 2x mit 10 ml Medium und zu filtern sowie. </li><li> Zentrifuge Suspension bei 500 xg für 5 min bei RT. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren Zelle Pellet in 10 ml Medium (DMEM + 1% Pen / Strep). </li><li> Separate Blutzellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) und mesenchymale Stammzellen (MSC) mit einem Biocoll Trennlösung. </li><li> Füllen Sie 5 ml Biocoll Trennlösung in einen 15-ml-Tube und vorsichtig 5 ml Zell-Suspension auf und Zentrifuge bei 800 xg für 20 min bei RT (ohne Bremse). </li><li> Mögliche Ergebnisse siehe Abbildung 1: Sein dichter als Biocoll, rote Blutkörperchen Sediment auf den Boden, während PBMC und mesenchymalen Stammzellen an der Schnittstelle zu bleiben. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Schnittstelle in einen 15-ml-Tube und wäscht mit 5 ml PBS. </li><li> Zentrifuge wie in Schritt 22 beschrieben, resuspendieren in 5 ml PBS und 2-3x wiederholen. </li><li> Dann wieder Zentrifuge bei 350 xg für 10 min bei RT (mit Bremse). </li><li> Resuspendieren in 10 ml Medium und zählen Zellen in einer Zählkammer. </li><li> Teller Zellen bei einer anfänglichen Aussaatdichte von ca. 5 x 10 6 in 150 mm-Schalen. </li><li> Nach 2-3 Tagen wiederbewegen nicht haftenden Zellen. Möglicherweise müssen Sie mit PBS erste Spülung, um Zelltrümmer zu entfernen. In frischem Vollmedium (DMEM + 10% Fetal Calf Serum (FCS) + 1% Pen / Strep) danach. </li><li> Füttern Zellen alle 3-4 Tage (Abbildung 2). </li><li> Nach 5-10 Tagen Durchgang die Zellen für die erste Zeit. </li></ol> C. Herstellung von Fibringerinnseln in vitro <ol><li> Am Tag der Implantation, lassen anhaftenden Zellen aus den Kolben / Geschirr von einem 3-min Exposition gegenüber 0,25% Trypsin-EDTA. Stoppen Trypsinierung indem Vollmedium. </li><li> Verteilen Sie Zellen in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit PBS. </li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und Zahlen von Trypanblaufärbung. </li><li> In 50.000 Zellen / Mikrozentrifugenröhrchens und sammeln Pellets durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei RT. Bereiten Sie eine mastermix für mindestens eine weitere Gerinnsel nach Bedarf. </li><li> Zellpellet in 17 ul PBS und mischen Sie 25 ul der Fibrinogen-Komponente von TISSUCOL-Kit mit diesem 17 ul MSC Suspension. </li><li> Nehmen Sie eine sterile Platte mit Vorbohrungen (3x3.6 mm) in Übereinstimmung mit den Bohrungen in vivo (Abbildung 3). </li><li> Zuerst impfen 4 ul Thrombin-Lösung (500 IU / ml) in einem Loch, durch sofortige Zugabe von 42 ul Fibrinogen-Zell-Suspension und wieder 4 ul Thrombin-Lösung an der Spitze gefolgt. Mischen Sie nicht die Aussetzung zu vermeiden Blutgerinnung in der Pipettenspitze. Zunächst wird die 50 ul Volumen des pipettierten Fibrinogen-Zell-Suspension der Rand der vorgebohrten Löcher ohne Schmelzen aufgrund der Oberflächenspannung vorstehen. Jedoch nach vollständiger Gerinnung (nach 60 min) das Gerinnsel zusammenzieht und passt in das vorgebohrte Loch. </li><li> Entfernen Sie das Gerinnsel vorsichtig mit einem stumpfen Pinzette und in einen Mikrozentrifugenröhrchens mit PBS. Bereiten 2 Blutgerinnsel / Tier. </li><li> Nehmen Sie die Klumpen an den Operationssaal. </li></ol> D. Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln<ol><li> Induce Anästhesie, Kaninchen (NZW, männlich, 3,5-4,0 kg Körpergewicht, 5-6 Monate alt) durch iv-Injektion von Propofol (10 mg / kg Körpergewicht). </li><li> Rasur das Knie auf mit einem elektrischen Haarschneider und Vakuum das Fell betrieben werden. Alle Verfahren genannt werden, bevor in einer Operation Herstellung Raum, um eine Verunreinigung der sterilen Umgebung des Operationssaals vermeiden durchgeführt. </li><li> Nach der Intubation Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,5 mg / kg / min Propofol und 0,05 mg / kg / min Fentanyl intravenös. Überwachen Anästhesie mit Kapnographie, Pulsoximetrie und Pulsfrequenz. </li><li> Desinfizieren Sie die Knie rasiert gründlich und decken den Rest der Kaninchen mit einem sterilen Verband. </li><li> Ertasten Sie die Patella und führen Sie einen Hautschnitt medial der Patella. </li><li> Öffnen Sie das Kniegelenk durch eine medial parapatellaren Arthrotomie unter sterilen Bedingungen. Versuchen Sie zu vermeiden Schneiden alle kleinen oberflächlichen Blutgefäße. </li><li> Anschließend verdrängt man das Patella seitlich (Abbildung 4). </li><li> Nach InSpektion des Kniegelenks für jegliche begleitende Knorpelschäden oder gemeinsamen Anomalien, erstellen Sie zwei osteochondralen Defekten (3 mm tief, Achter-Form) in der Trochleagrube mit steriler Luft Betriebsleistung Bohrer (3,6 mm Durchmesser) mit einem Stopp-Gerät (Abbildung 5). </li><li> Reinigen Sie die Mängel und spülen Sie sie mit steriler Kochsalzlösung. </li><li> Vor der Implantation füllen 20 ul Fibrinkleber in die Defekte und verteilt sie gleichmäßig auf dem Boden der fehlerhaften Stelle. </li><li> Dann implantieren Blutgerinnsel im Preßsitz in der Acht-förmigen Defekt. </li><li> Nach Gerinnung, verlagern die Kniescheibe im Trochleagrube und beugen und strecken das Knie ein paar mal. </li><li> Anschließend verdrängt man das Patella seitlich noch einmal und überprüfen Sie, ob Fibrinogen-Zell-Klumpen sind noch an Ort und Stelle. </li><li> Ersetzen Sie die Patella wieder und beenden Sie den Vorgang mit Wundverschluss in Schichten mit einzelnen Knopf Nähte (4-0 Vicryl) und eine kontinuierliche Hautnaht (4-0 Monocryl) (beide mit resorbierbares NahtmaterialMaterial). </li><li> Schließlich versiegeln die Wunde mit einem Spray Dressing wasserdampfdurchlässig. </li><li> Für die postoperative Versorgung wird die Wunde täglich für 7 Tage überprüft. Die Kaninchen erhalten zur postoperativen Analgesie Carprofen 4 mg / kg sc alle 24 h (für 4 Tage) und Buprenorphin 0,03 mg / kg sc alle 12 h (2,5 Tage). Eine Stabilisierung des Knies (z. B. Verband) ist nicht erforderlich. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In den letzten Jahren, die Möglichkeit der Behandlung von komplexen Gelenk osteochondralen Defekten - wurde mit Tissue Engineering Ansätze mehr und mehr attraktiv - wie jene, die aus ÖD, Osteonekrose und Trauma. In den zuvor genannten pathologischen Entitäten erstreckt Gewebeschäden an der subchondralen Knochens und umfasst zwei Geweben von verschiedenen intrinsischen Kapazitäten Heilung 1 gekennzeichnet. Es gibt ein zunehmendes Interesse an der Rolle des subchondralen Knochen für den pathogenen Prozessen ost...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>0401</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2210</td><td>1.000 Einheiten/10 &amp;mu;g/&amp;mu;l in 0,9 %iger NaCl</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>Äthanol (70 %)</td><td>Merck KGaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung (0,4 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll Trennlösung</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td>Isotonische Lösung, Dichte: 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05 %</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>NaCl-Lösung (0,9 %)</td><td>B. Braun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen (Injekt)</td><td>B. Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Kanülen (Sterican)</td><td>B. Braun</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten (stumpf/spitz)</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scheren</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpelle</td><td>Feather Safety Razor Co</td><td>02.001.30.022</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten, Forschung</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knochenquetsche</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>Wachstumsfläche 60,1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147,8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Zellkulturgefäße 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>Gammasterilisiert</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Inkubator</td><td>Forma Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Werkbank für Zellkultur Hera Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Säge</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Megafuge 2.0 R</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blutkörperchenzähler</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauer</td></tr><tr><td>Luftbetriebene Bohrmaschine</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TISSUCOL-Kit 1,0 ml Immuno</td><td>Baxter</td><td>2546648</td><td></td></tr><tr><td>Fäden (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprühverband (OpSite)</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>Wasserdampfdurchlässig</td></tr></tbody></table>

behandlung von osteochondralen defekten in des kaninchens kniegelenk durch implantation von allogenen mesenchymalen stammzellen in fibringerinnseln

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

Die Behandlung von osteochondralen Gelenkdefekten stellt Ärzte seit vielen Jahren vor Herausforderungen. Das verbesserte Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Gelenkknorpel und subchondraler Knochensubstanz in den letzten Jahren führte zu einer stärkeren Fokussierung auf die Wiederherstellung der gesamten osteochondralen Einheit. Im Vergleich zu knorpeligen Läsionen ist die Regeneration osteochondraler Defekte weitaus komplexer und stellt eine deutlich größere chirurgische und therapeutische Herausforderung dar. Das geschädigte Gewebe umfasst nicht nur die oberflächliche Knorpelschicht, sondern auch den subchondralen Knochen. Bei tiefen osteochondralen Schäden, wie sie beispielsweise bei der Osteochondrosis dissecans auftreten, muss die gesamte Defekttiefe ersetzt werden, um die Gelenkoberfläche wiederherzustellen1. Geeignete therapeutische Verfahren müssen diese beiden unterschiedlichen Gewebe mit ihrem jeweils unterschiedlichen intrinsischen Heilungspotential berücksichtigen2. In den letzten Jahrzehnten haben sich mehrere chirurgische Behandlungsoptionen entwickelt, die bereits klinisch etabliert sind3–6.
Autologe oder allogene osteochondrale Transplantate bestehen aus Gelenkknorpel und subchondralem Knochen und ermöglichen den Ersatz der gesamten osteochondralen Einheit. Die Defekte werden mit zylindrischen osteochondralen Transplantaten aufgefüllt, die eine kongruente, mit hyalinem Knorpel bedeckte Oberfläche schaffen sollen 3,7,8. Nachteile sind die begrenzte Verfügbarkeit von Transplantaten, die Morbidität an der Entnahmestelle (bei autologen Transplantaten) sowie die Inkongruenz der Oberfläche; dadurch ist der Einsatz dieses Verfahrens besonders bei großen Defekten eingeschränkt.
Neue Ansätze im Bereich des Gewebeengineerings haben vielversprechende Möglichkeiten für die regenerative osteochondrale Therapie eröffnet. Die Implantation autologer Chondrozyten markierte den ersten zellbasierten biologischen Ansatz zur Behandlung von Knorpelläsionen durchgehender Dicke und ist mittlerweile weltweit etabliert, mit guten klinischen Ergebnissen auch 10 bis 20 Jahre nach der Implantation 9,10. Bis heute eignet sich diese Technik jedoch nicht zur Behandlung aller Läsionstypen, wie beispielsweise tiefer Defekte, die den subchondralen Knochen betreffen 11.
Die Sandwich-Technik kombiniert die Knochentransplantation mit aktuellen Ansätzen des Gewebe-Engineering 5,6. Diese Kombination scheint in der Lage zu sein, die bei osteochondralen Transplantaten allein beobachteten Einschränkungen zu überwinden. Nach autologer Knochentransplantation in den subchondralen Defektbereich wird eine mit autologen Chondrozyten besiedelte Membran darüber vernäht und erleichtert so die Anpassung der Topologie des Transplantats an die verletzte Stelle. Natürlich erfordert die vorherige Knochenrekonstruktion zusätzliche Operationszeit und oft sogar einen zusätzlichen Eingriff. Außerdem fehlen bisher Langzeitdaten 12.
Das Gewebeengineering ohne zusätzliche Knochentransplantation zielt darauf ab, die komplexe Struktur und die Eigenschaften des nativen Gelenkknorpels durch das chondrogene und osteogene Potenzial der transplantierten Zellen wiederherzustellen. Allerdings wird erneut meist nur das Knorpelgewebe mehr oder weniger regeneriert. Zusätzliche osteochondrale Schäden erfordern eine spezifische weitere Behandlung. Um eine Regeneration der mehrschichtigen Struktur osteochondraler Defekte zu erreichen, könnten dreidimensionale, mit autologen/allogenen Zellen besiedelte, gewebeengineeringbasierte Produkte eine gute Regenerationskapazität bieten 11.
Neben autologen Chondrozyten scheinen mesenchymale Stammzellen (MSC) eine attraktive Alternative für die Entwicklung eines vollständigen Knorpelgewebes zu sein. In zahlreichen präklinischen in vitro- und in vivo-Studien haben mesenchymale Stammzellen ein hervorragendes Geweberegenerationspotenzial gezeigt 13,14. Der entscheidende Vorteil mesenchymaler Stammzellen, insbesondere für die Behandlung von osteochondralen Defekten, liegt darin, dass sie sich sowohl in Osteozyten als auch in Chondrozyten differenzieren können. Daher ermöglichen sie potenziell eine mehrschichtige Regeneration des Defekts.
In den letzten Jahren wurden daher mehrere Gerüste mit osteochondraler regenerativer Wirkung entwickelt und mit vielversprechenden vorläufigen Ergebnissen evaluiert 1,15-18. Darüber hinaus hat sich Fibrinkleber als Zellträgermaterial zu einer der bevorzugten Techniken in der experimentellen Knorpelreparatur entwickelt und wurde bereits erfolgreich in mehreren Tierversuchen 19-21 und sogar ersten humanen Studien 22 eingesetzt.
Das folgende Protokoll beschreibt eine experimentelle Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark eines Kaninchens, zur anschließenden Vermehrung in Zellkultur sowie zur Herstellung eines standardisierten in vitro-Modells für Fibrin-Zell-Klumpen. Abschließend wird eine Technik zur Implantation vorab hergestellter Fibrin-Zell-Klumpen in künstliche osteochondrale Defekte des Kniegelenks des Kaninchens beschrieben.

Die beschriebene Operationstechnik ermöglicht eine erfolgreiche Isolierung und die Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in einer künstlichen osteochondralen Defekt. Der experimentelle Aufbau ergab eine erfolgreiche Integration des Implantates in den umgebenden Knorpel. Der Defekt wurde durch Reparatur Gewebe mit ähnlichen biomechanischen Eigenschaften und ähnliche Haltbarkeit im Vergleich zum umgebenden Knorpel gefüllt. Das Fibrin-Clot-Zellen wurde in vitro an einer ...

Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von osteochondralen Defekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in osteochondralen Defekten stellt eine viel versprechende Entwicklung auf dem Gebiet des Tissue Engineering. Die Herstellung von Fibrin-Gerinnsel-Zelle<em&gt; In vitro</em&gt; Bietet eine standardisierte Methode für die Implantation.

Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln

Die Behandlung osteochondraler Gelenkdefekte stellt Ärzte bereits seit vielen Jahren vor große Herausforderungen. Ein besseres Verständnis der Wechselwirkungen von Gelenk...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine standardisierte Methode für experimentelle Stammzellforschung im Bereich der osteochondralen Reparatur zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark von Kaninchen isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die isolierten Stammzellen kultiviert, um deren Proliferation zu fördern.Anschließend werden die Fibrin-Zellklumpen in vitro hergestellt. Schließlich werden die vorab hergestellten Fibrin-Zellklumpen in künstliche osteochondrale Defekte im Kniegelenk des Kaninchens implantiert. Letztendlich kann nach 12 Wochen in vivo eine makroskopische Analyse des Knies durchgeführt werden, wobei das Reparaturgewebe eine homogene und intakte Oberfläche mit fester Beschaffenheit aufweist.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Knorpelläsionen im experimentellen Tierversuch, da sie die in-vivo-Analyse der Integrations- und Regenerationsfähigkeit allogener mesenchymaler Stammzellen zur Behandlung von Knorpelschäden ermöglicht. Im Operationssaal verwenden Sie eine elektrische Schermaschine, um das Fell von den Hintergliedmaßen, dem Rücken und dem Bauch eines euthanasierten Kaninchens abzurasieren, und saugen Sie das Fell gleichzeitig ab, nachdem Sie den rasierten Bereich gründlich mit 70 % Ethanol desinfiziert haben. Führen Sie einen Schnitt entlang der kranialen Fläche von Oberschenkel und Unterschenkel durch und reflektieren Sie Haut und Unterhautgewebe durch scharfe Präparation.Als Nächstes trennen Sie die Muskeln und Bänder vom Schienbein und Oberschenkelknochen, wobei die Schnitte so nah wie möglich am Knochen verlaufen sollten, um eine saubere Präparation zu gewährleisten. Danach durchtrennen Sie das Hüftgelenk, um den Femurkopf vom Hüftpfanne zu lösen, und heben Sie den tibiofemoralen Komplex an. Verwenden Sie nun die Skalpellklinge, um jegliches verbleibende Weichgewebe von den Knochen abzukratzen.Schneiden Sie dann die Patella und die Kniegelenkbänder ab, um schließlich die Beinknochen zu trennen. Besprühen Sie die getrennten Knochen nach dem Lufttrocknen mit 70 % Ethanol. Geben Sie jeden Knochen in separate 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, die Zellkulturmedium enthalten, um sie feucht in einer sterilen Zellkultur zu halten.Laminarfluss-Werkbank. Verwenden Sie sterile Pinzetten, um die gewonnenen Knochen aus den Zentrifugenröhrchen in 150 Millimeter-Dishs umzusetzen. Anschließend entfernen Sie mit einer sterilen Säge beide Knochenenden und überführen die Stücke in neue 150 Millimeter-Dishs.Füllen Sie als Nächstes eine 10-Milliliter-Spritze mit Medium. Befestigen Sie eine 18-Gauge-Nadel daran und führen Sie die Spitze der Nadel an einem Ende des Knochens in das Mark ein. Spülen Sie nun die Markhöhle mit Medium, um das Knochenmark in die Petrischale zu spülen.Aspirieren Sie dann die Zellsuspension in die Spritze und spülen Sie das Knochenmark wiederholt aus, bis die Suspension frei fließt, durch die Knochenmarkhöhle wandert und keine weiteren Knochenmarkklumpen mehr sichtbar sind. Sobald das Knochenmark aus allen Knochen gesammelt wurde, füllen Sie die Spritze über die Nadel mit der Knochenmarksuspension und pressen die Suspension in das Medium, um die Knochenmarkklumpen aufzulösen. Danach lassen Sie die Suspension durch einen Zellfilter in einen 50-Milliliter-Probengefäß laufen, um Zellverluste zu vermeiden.Waschen Sie die Kulturschale zweimal mit je 10 Milliliter Medium, wobei Sie die Waschflüssigkeit jedes Mal ebenfalls durch den Filter laufen lassen. Zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten bei 500 × g und Raumtemperatur. Anschließend entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in 10 Milliliter Medium.Fügen Sie anschließend fünf Milliliter Bio Call-Aufreinigungslösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen hinzu und schichten Sie vorsichtig fünf Milliliter Zellsuspension darauf auf. Nach der Zentrifugation der geschichteten Lösung sedimentieren die roten Blutkörperchen auf den Boden, während die PBMCs und mesenchymalen Stammzellen an der Grenzfläche verbleiben. Überführen Sie die Zellen an der Grenzfläche in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die gesammelten PBMCs und mesenchymalen Stammzellen zwei bis drei Mal mit fünf Milliliter PBS.Danach die Zellen nochmals zentrifugieren und das Pellet in 10 Milliliter Medium resuspendieren. Abschließend die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und sie mit einer initialen Aussaatdichte von etwa fünf mal 10 hoch sechs in 150-Millimeter-Platten aussäen. Nach zwei bis drei Tagen die Kulturen pflegen, indem die nicht-anklebenden Zellen entfernt werden.Spülen der Platte mit PBS, um Zelltrümmer zu entfernen, und Versorgung der Zellen mit frischem, vollständigem Medium am Tag der Implantation. Beginnen Sie damit, die anhaftenden Zellen drei Minuten lang 0,25 %igem Trypsin-EDTA auszusetzen. Beenden Sie die Trypsinisierung durch Zugabe von vollständigem Medium.Überführen Sie anschließend die abgelösten mesenchymalen Stammzellen in ein 50-Milliliter-Kegelrohr und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Nach der Bestimmung der Zellanzahl und Vitalität mittels Trypanblau-Färbung bereiten Sie eine Master-Mischung von mindestens einem weiteren Gerinnsel entsprechend n gleich vier vor. Zentrifugieren Sie 200.000 Zellen in einem Mikrozentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das Pellet anschließend in 68 Mikroliter PBS und 100 Mikroliter der Fibrinogen-Komponente eines Gewebe-Koagulations-Kits.Anschließend vier Mikroliter Thrombinlösung in eine Vertiefung einer vorgebohrten sterilen Platte impfen. Unmittelbar danach alle 42 Mikroliter einer Fibrinogen-Zellsuspension hinzufügen und die Zellsuspension mit weiteren vier Mikrolitern Thrombinlösung überdecken. Aufgrund der Oberflächenspannung ragt das Volumen der pipettierten 50 Mikroliter Fibrinogen-Zellsuspension zunächst über den Rand der vorgebohrten Vertiefung hinaus.Jedoch nach einer Stunde wird die Mischung vollständig geronnen sein und sich zusammengezogen haben, sodass sie in das vorgebohrte Loch passt. Verwenden Sie nun stumpfe Pinzette, um den Gerinnsel vorsichtig zu entfernen, und legen Sie ihn anschließend in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das PBS enthält. Nach der Desinfektion des rasierten Knies ertasten Sie gründlich die Kniescheibe und führen einen Hautschnitt medial zur Kniescheibe durch.Öffnen Sie anschließend unter sterilen Bedingungen das Kniegelenk mittels einer medialen parapatellaren Arthrotomie und verschieben Sie die Kniescheibe lateralseitig. Erzeugen Sie nun mit einem sterilen, luftbetriebenen Bohrgerät, einem 3,6 Millimeter durchmessenden Bohrer und einer Anschlagvorrichtung zwei osteochondrale Defekte in Form einer Acht, jeweils drei Millimeter tief, in der Trochleafurche. Nachdem die Defekte mit steriler Kochsalzlösung gespült wurden, geben Sie anschließend schnell 20 Mikroliter Fibrinkleber gleichmäßig in den Boden der Defekte, bevor der Kleber trocknet.Implantieren Sie die druckangepassten Gerinnsel in den achtförmigen Defekt. Nach der Gerinnung verschieben Sie die Kniescheibe innerhalb der Trochlea und beugen und strecken das Knie mehrmals. Verschieben Sie anschließend die Kniescheibe erneut lateral und prüfen Sie, ob die Fibrinogen-Zellgerinnsel noch an Ort und Stelle sind.Nachdem die Patella erneut eingesetzt wurde, schließen Sie die Wunde schichtweise mit einzelnen Knopfnähten aus Vicryl 4-0 und einem kontinuierlichen Hautnaht aus Monocryl 4-0. Verschließen Sie die Wunde abschließend mit einem wasserdampfdurchlässigen Sprühverband. In diesem Experiment wurde der Defekt durch Reparaturgewebe ausgefüllt, das ähnliche biomechanische Eigenschaften und eine vergleichbare Haltbarkeit wie der umgebende Knorpel aufwies.Dieses Fibrin-Zellgerinnsel wurde in vitro auf einer sterilen Platte mit vorgebohrten Löchern hergestellt, die dieselbe Größe wie der osteochondrale Defekt aufwiesen. Dadurch entstanden keine Spalten zwischen dem implantierten Fibringerinnsel und dem umgebenden Knorpel, die sonst ein Risikofaktor für eine vorzeitige Degeneration oder Delamination darstellen würden. Eine basale Anheftung des Reparaturgewebes wurde gewährleistet, da das subchondrale Knochengewebe durchbrochen wurde und somit eine Abscherung verhindert wurde.Ein weiterer wichtiger Aspekt war die Steifigkeit des Reparaturgewebes, die an das gesunde umgebende Knorpelgewebe angepasst sein sollte, um eine erhöhte Belastung des Gelenks und eine mögliche vorzeitige Degeneration zu vermeiden. Zudem zeigte sich eine intakte und homogene Oberfläche des Transplantats, die die Scherbelastung und mögliche Implantatschäden nach der Entwicklung verringerte. Diese Technik könnte für Forscher auf dem Gebiet der orthopädischen Stammzellforschung den Weg ebnen, Behandlungsoptionen für osteochondrale Defekte sowie ein experimentelles Tiermodell zu erforschen.Um eine ausführlichere Darstellung einiger Techniken zur Tierpräparation und Kniechirurgie zu erhalten, sollten Sie unbedingt unseren begleitenden Jovi-Artikel „Matrixunterstützte autologe Chondrozytentransplantation zur Umgestaltung und Reparatur von Knorpeldefekten“ in einem Kaninchenmodell lesen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Ziel der Präsentation ist es, eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode zur Matrix verbunden Stammzellen Implantate in Knorpeldefekte, die visualisiert werden MR-Bildgebung erzeugen kann demonstrieren. Stammzellen sind mit von der FDA zugelassene Ferumoxides mit Agarose, implantiert in Knorpeldefekte und abgebildet mit einem 7T MR-Scanner bezeichnet.

Die Implantation von Ferumoxides Labeled humanen mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu...

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von Knorpeldefekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von autologen Chondrozyten auf einer Matrix ausgesät ist eine gut akzeptierte Methode für den Umbau und die Reparatur von Gelenkknorpelläsionen Bereitstellung befriedigend langfristige Ergebnisse. Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation (MACT) bietet eine standardisierte und klinisch etablierte Methode der Implantation.

Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation für Umbau und Reparatur von Knorpeldefekten in einem Kaninchen-Modell

Tiermodelle sind wichtige Werkzeuge für die Bewertung von Tissue-Engineering-Transplantaten. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Herstellung eines elektrogesponnenen, biologisch abbaubaren Polymertransplantats für die Verwendung im Tissue Engineering des vorderen Kreuzbandes sowie ein chirurgisches Protokoll für die Implantation in ein Rattenmodell vorgestellt.

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Das Ziel dieser Studie ist ein Protokoll für die arthroskopische Behandlung von osteochondrale Läsionen des Talus mit Microfractured und gereinigtes Fettgewebe Stammzellen zu melden.

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Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung und Auswertung der Nabelschnur Matrix-mesenchymale Stammzellen Sphäroide mit einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell in eine Ratte. Dieses Modell wurde wurde mit einer akzeptablen Morbidität verbunden festgestellt, dass die Unterschiede zwischen unbehandelten und behandelten sehnen erkennen und zwischen den beiden Behandlungen getestet.

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Dieser Artikel stellt eine einfache und kostengünstige Protokoll für die einfache Isolierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus New Zealand white Kaninchen Gelenkflüssigkeit.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Fettgewebe abgeleitet Stromazellen vaskulären Bruch und seine Anwendung auf Knie Funktionen zu verbessern, indem die Regeneration von Knorpel-ähnliches Gewebe bei menschlichen Patienten mit Arthrose zu produzieren.

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Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

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Das vorgeschlagene Protokoll beinhaltet einen globalen Ansatz zur Bewertung der Knochenbildung im Rahmen der Knochenregeneration mit Hilfe multimodaler Analysen. Ziel ist es, qualitative und quantitative Informationen über die Knochenneubildung bereitzustellen und so die Strenge und Validität grundlegender und präklinischer Untersuchungen zu verbessern.

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Hier stellen wir ein integriertes Protokoll zur Erzeugung kontrollierter osteochondraler Läsionen in Schafsknien vor, um ein experimentelles Modell zu etablieren, das für Knochen- und Knorpelgeweberegenerationsstudien geeignet ist. Das Protokoll beschreibt eine Methode, um einen vollwertigen osteochondralen Defekt im Oberschenkelkondylus zu induzieren, wobei Techniken verwendet werden, die Auswirkungen auf das Tierwohl und die Variabilität der Ergebnisse minimieren.

Etablierung und Bewertung eines Schafmodells für volldicken osteochondralen Defekt

Erfahren Sie die Implantation allogener mesenchymaler Stammzellen in Fibringerinnseln zur Behandlung osteochondraler Defekte im Kaninchenkniegelenk. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Geweberegeneration.

Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln (Video) | JoVE Journal

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